Próbki FFPE – Przygotowanie próbek tkanek ludzkich – Lab-Ally

Spis treści

Wprowadzenie |Pozyskiwanie tkanek |Przetwarzanie tkanek FFPE |Sekcja |Podstawy

Jeśli potrzebujesz próbek FFPE lub innych ludzkich biopreparatów do swoich badań, skontaktuj się z nami.

Wprowadzenie

Wielu dzisiejszych badaczy woli używać próbek tkanek FFPE do swoich analiz IHC, histologicznych lub genomicznych in-situ. FFPE jest skrótem od „Formalin-Fixed Paraffin-Embedded” i opisuje dwie kluczowe cechy tej metody konserwacji tkanek. Formalina jest roztworem formaldehydu i jest używana od czasu odkrycia pod koniec XIX wieku konserwującego działania formaldehydu przez niemieckiego lekarza Ferdinanda Bluma (Fox, et al., 1985). Parafina jest wprowadzana do tkanki po utrwaleniu formaldehydem, a tkanka jest również otoczona osłonką parafinową, która pomaga ją utrzymać i chroni przed utlenianiem. Profesjonalnie utrwalone i zatopione próbki FFPE oraz zawarte w nich biomolekuły są dość stabilne w temperaturze otoczenia. Strukturalnie, utrwalone i zatopione tkanki są odporne i mogą być używane do badań anatomii mikroskopowej niemal w nieskończoność, ale z czasem antygenowość niektórych białek ulegnie degradacji, ograniczając badania IHC do próbek nie starszych niż kilkadziesiąt lat. Dwuniciowe DNA jest zaskakująco stabilne w blokach FFPE, ale inne mniej stabilne biomolekuły, takie jak RNA, mogą ulec degradacji w ciągu dekady lub mniej, zwłaszcza po wycięciu sekcji.

Archiwa, które gromadzą dużą liczbę próbek FFPE, są szczególnie bogatym źródłem danych, gdy pożądane jest porównanie wielu przypadków (tj. Próbek FFPE od wielu dawców) w celu wyciągnięcia statystycznie solidnych wniosków na temat charakterystyki poszczególnych wskazań. Jeśli próbki FFPE mają być użyte w badaniach biomedycznych o „wysokiej stawce”, ważne jest, aby każdy etap procesu przygotowania był wykonywany przez w pełni przeszkolonych i certyfikowanych profesjonalistów, najlepiej w laboratorium posiadającym certyfikat CLIA (tj. kontrolowanym przez rząd) lub akredytację CAP (College of American Pathologists).

Należy zauważyć, że proces FFPE nie jest powszechnie standaryzowany, a instytucje na całym świecie mogą stosować nieco inne protokoły z różnymi roztworami formaliny lub w inny sposób dostosowywać proces do swoich preferencji i wymagań. Poniżej znajduje się przegląd procesu i opisy poszczególnych etapów, a także kilka typowych odmian.

Pobranie tkanki

Przed przystąpieniem do przetwarzania tkanki koniecznym krokiem jest jej pobranie. Jest to w rzeczywistości najtrudniejszy do kontrolowania element, ponieważ jest on powiązany z opieką nad pacjentem, zgodnością z 41CFR46, a w USA z nadzorem wewnętrznej komisji rewizyjnej (IRB). Specyfika procedury medycznej i konwencje standardowej opieki są ważne, ponieważ mogą wpływać na takie zmienne jak odstępy czasowe pomiędzy podaniem znieczulenia i podwiązaniem naczyń, pobraniem tkanki i czasem, który upłynął przed utrwaleniem, z których każda może mieć wpływ na jakość próbki. Na przykład, zmiany w RNA i białkach mogą wystąpić w przedziale czasowym, znanym jako czas ciepłego niedokrwienia, pomiędzy podwiązaniem naczyń krwionośnych a pobraniem tkanki (Dash, et al., 2002). Ten czas niedokrwienia może wynosić od minut do godzin, w zależności od narządu, standardowych procedur operacyjnych obowiązujących w danej instytucji, chirurga i innego zaangażowanego personelu medycznego oraz podejścia chirurgicznego. Z tego powodu zaleca się, aby czas ten był rejestrowany dla każdej próbki i aby był ograniczony do minimum (Hewitt, et al., 2008).

Przetwarzanie tkanekFFPE

Po pobraniu próbki tkanki może być konieczny dodatkowy triage, dysekcja lub mikrodysekcja (łącznie określane jako grossing) w celu wyizolowania i przygotowania określonej części tkanki, która będzie przechodzić przez pozostałe etapy przetwarzania. Obecnie przetwarzanie tkanek jest często całkowicie zautomatyzowane, aż do ostatniego etapu – osadzania, który może być wykonywany ręcznie. Dostępnych jest wiele procesorów tkankowych, ale wszystkie one działają zgodnie z sekwencją pierwszych czterech kroków przedstawionych powyżej. Automatyzacja poszczególnych etapów pomaga wyeliminować różnice w procedurze jako źródło zmienności wyników eksperymentalnych pomiędzy różnymi próbkami FFPE.

Utrwalanie

Utrwalanie jest początkowym etapem przetwarzania tkanek FFPE. Krytyczne czynniki do rozważenia obejmują roztwór, który ma być użyty, długość czasu przeznaczonego na utrwalanie oraz grubość i właściwości histologiczne próbki tkanki, która ma być utrwalona.

– Roztwór

Utrwalaczem, który jest używany przez większość laboratoriów jest neutralnie zbuforowana, 10% formalina. Formalina jest cieczą, która składa się z 37-40% formaldehydu i 10% metanolu (wagowo) w wodzie; tak więc 10% roztwór formaliny zawiera około 3,7% – 4% formaldehydu i 1% metanolu (Hewitt, et al., 2008; Kiernan, 2000). W rzeczywistości formaldehyd występuje w roztworze głównie jako monomery lub małe polimery glikolu metylenowego (metanodiol, monohydrat formaldehydu), który powstaje w wyniku odwracalnej reakcji formaldehydu z wodą. Polimery glikolu metylenowego o dużej masie są określane jako paraformaldehyd i wytrącają się z roztworu, ale metanol spowalnia ten proces polimeryzacji, co jest powodem włączenia go do roztworów formaliny. Formalina rozcieńczona wodą (np. 10% formaliny) – zwłaszcza jeśli jest to roztwór buforowy – będzie zawierać głównie monomery, ponieważ duża liczba cząsteczek wody rozbija wszelkie polimery glikolu metylenowego, które normalnie istniałyby w roztworze o wyższym stężeniu formaldehydu (Kiernan, 2000). Bufory, pozostały składnik formaliny, są również dodawane, ponieważ formaldehyd ma tendencję do utleniania się do kwasu mrówkowego (Fox, et al., 1985). Kwas mrówkowy w utrwalaniu tkanek może powodować wytrącanie się granulek pigmentu formaliny (kwaśnej hematyny), które mogą przypominać pigmenty wytwarzane przez niektóre pasożyty (Pizzolato, 1976). Buforowanie formaliny zapobiega temu zjawisku. Powszechne środki buforujące obejmują węglan magnezu, węglan wapnia, cytrynian, Tris i bufory fosforanowe (Hewitt, et. al., 2008). Handlowa formalina często zawiera bufory fosforanowe. „Neutralnie zbuforowana”, która jest zwykle jak formalina jest przygotowana, oznacza po prostu, że pH jest utrzymywane na poziomie około 7.

– Proces i mechanizm

Z powodu niskich mas cząsteczkowych formaldehydu i glikolu metylenowego, formalina (głównie glikol metylenowy w roztworze) penetruje tkanki stosunkowo szybko, w tempie, które zależy od rodzaju tkanki, ale ze średnią szybkością 1mm/godzinę (Hewitt, et al., 2008). Protokoły utrwalania będą się więc różnić w zależności od rodzaju tkanki, która ma być utrwalona. Po dostaniu się do wnętrza tkanki, frakcja cząsteczek formaldehydu, która jest obecna w roztworze, zacznie się wiązać krzyżowo z białkami, ale dzieje się to w znacznie wolniejszym tempie niż tempo dyfuzji. Reakcja formaldehydu z tkanką wyciąga go z roztworu i ciągnie tę odwracalną reakcję formaldehydu z glikolem metylenowym z powrotem w kierunku formaldehydu, tak, że więcej go wytwarza się nawet wtedy, gdy jest zużywany (Fox, et al., 1985). Boczne łańcuchy aminowe lizyny są najbardziej reaktywne z formaldehydem, ale inne, które są w pewnym stopniu reaktywne z formaldehydem obejmują argininę, asparaginę, histydynę, glutaminę, serynę i tyrozynę (Howat i Wilson, 2014). Po reakcji, powstała grupa hydroksymetylowa przyłączona do kompleksu może następnie dalej reagować z tym samym białkiem lub innymi białkami, tworząc w ten sposób stabilne mostki metylenowe (białko-CH2-białko) (Kiernan, 2000). To właśnie one powodują nierozpuszczalność i sztywność tkanek, które zostały utrwalone w formalinie i w ten sposób zakonserwowane. Około 24-48 godzin jest wymagane, aby to wiązanie krzyżowe dostatecznie wystąpiło w całej tkance (Thavarajah, et al., 2012), ale zaleca się, aby na ten proces nie przeznaczać więcej niż 36 godzin, ponieważ utrwalanie przez dłuższy czas obniży jakość biomolekuł w próbkach FFPE, na przykład poprzez skrócenie długości kwasów nukleinowych, które można wyekstrahować (Hewitt, et al., 2008).

– Ograniczenia

Główną zaletą stosowania formaldehydu – zwłaszcza w postaci neutralnie zbuforowanej, 10% formaliny – jest to, że zachowuje on szeroki zakres tkanek i składników. Jednakże, ma ona pewne ograniczenia. Na przykład, połączenie formaldehydu z glutaraldehydem (C5H8O2), lub sam roztwór glutaraldehydu, jest zwykle używany do mikroskopii elektronowej (Kiernan, 2000), ponieważ te roztwory są lepsze do zachowania struktur tkankowych w tym celu. Należy pamiętać, że tkanki przygotowane z użyciem roztworu glutaraldehydu lub aldehydu glutarowego nie będą uznawane za próbki FFPE. Innym wyzwaniem jest odzyskiwanie cząsteczek DNA i RNA z tkanek FFPE, ponieważ formalina ma tendencję do modyfikowania kwasów nukleinowych – nawet do punktu wprowadzania sztucznych mutacji w DNA – i rozbijania ich na małe fragmenty (Srinivasan, Sedmak, i Jewell, 2002). Jednak możliwe jest wyodrębnienie fragmentów DNA i RNA z tkanki FFPE, które nadają się do analizy, jak opisano w protokole napisanym przez Tang, et al. (2009), przy czym kluczowym czynnikiem w odzyskiwaniu kwasów nukleinowych jest odpowiednie trawienie proteazami. Dostępne są również komercyjne zestawy do ekstrakcji kwasów nukleinowych z próbek FFPE.

– Grubość próbki

Jednym z kolejnych ważnych punktów do rozważenia w odniesieniu do utrwalania w formalinie jest grubość próbki tkanki. Podczas gdy formalina przenika przez tkankę stosunkowo szybko, jak wspomniano powyżej, grubość tkanki będzie miała wpływ na jakość utrwalonej próbki. Formalina będzie potrzebowała więcej czasu na dotarcie do środka grubszych próbek tkanek. Podczas gdy formalina stopniowo dyfunduje do wnętrza próbki, zewnętrzne regiony będą już miały rozpoczęty proces utrwalania, tak że jest bardziej prawdopodobne, że znajdujące się tam biomolekuły ulegną degradacji w przedłużonym czasie wymaganym do całkowitego utrwalenia. Dodatkowo, jeśli przestrzegane są limity czasowe (takie jak maksimum 36 godzin, jak wspomniano powyżej), istnieje możliwość, że próbka tkanki nie zostanie wystarczająco utrwalona (zakonserwowana) w całości. Z tego powodu, tkanki do utrwalenia, które są większe niż kilka milimetrów lub jeden lub dwa centymetry, powinny być lepiej podzielone na cieńsze segmenty dla optymalnego utrwalenia (Hewitt, et al., 2008). Instytucje mogą mieć różne protokoły dotyczące długości czasu i objętości utrwalacza wymaganego dla próbek tkanek o różnej szerokości, ale ogólnie rzecz biorąc stosunek objętości utrwalacza do objętości tkanki powinien wynosić 10:1 (Klatt, 2016).

Odwodnienie

Drugim krokiem w przetwarzaniu próbek FFPE jest odwodnienie. Ponieważ parafina jest niemieszalna z wodą, cała woda z roztworu formaliny musi zostać usunięta z tkanki, zanim parafina będzie mogła w nią wniknąć. Aby usunąć zasadniczo całą wodę z tkanki, stosuje się serię roztworów alkoholu (często etanolu), często zaczynając od 70% i przechodząc do 100% alkoholu. Dla optymalnego odwodnienia konieczne jest stosowanie świeżych roztworów lub częste wymienianie zużytych, ponieważ alkohol będzie się coraz bardziej rozcieńczał w miarę używania. Konieczne jest również, aby ten etap został zakończony w pełni (z wystarczającą ilością czasu przeznaczonego na ten etap), ponieważ niewystarczające odwodnienie może prowadzić do degradacji tkanki (Klatt, 2016; Hewitt, et al., 2008).

Clearing

Ponieważ parafina w rzeczywistości nie jest również mieszalna w alkoholach, następnym krokiem jest usunięcie alkoholu za pomocą substancji, która jest mieszalna z parafiną. Ten krok jest znany jako oczyszczanie, a ksylen jest najczęściej stosowanym środkiem oczyszczającym (Klatt, 2016; Hewitt, et al., 2008).

Infiltracja parafinowa

Po odpowiednim utrwaleniu, odwodnieniu i oczyszczeniu, tkanka może w końcu zostać poddana infiltracji parafinowej (lub impregnacji). Ten etap również nie jest standaryzowany, a instytucje z całego świata mogą stosować różne parafiny i mieszanki wosków o zróżnicowanym składzie. Parafiny mają różne temperatury topnienia i tekstury, co ma wpływ na ostateczny blok tkankowy i jego właściwości. W Stanach Zjednoczonych, jak również w Europie Zachodniej, dla uzyskania najlepszych rezultatów stosuje się zazwyczaj parafiny syntetyczne o niskich temperaturach topnienia (55°C-63°C). Lateks, sulfotlenek dimetylu i własne „plastyfikatory” mogą być włączone do formuły w celu modyfikacji tekstury i ciągliwości końcowej próbki tkanki (Hewitt, et al., 2008).

Narody z innych części świata często włączają wosk pszczeli do swoich formuł w celu poprawy ciągliwości i obniżenia temperatury topnienia używanych parafin niskiej jakości. Wosk pszczeli zawiera jednak zanieczyszczenia, takie jak pyłki, i obniża jakość próbki końcowej. Należy unikać wyższych temperatur topnienia, ponieważ skutkują one później zmniejszoną i niewystarczającą deparafinizacją próbki tkanki, jak również zmniejszeniem ilości kwasów nukleinowych odzyskanych z tkanki (Hewitt, et al., 2008).

Zanurzanie w parafinie

Ostatnim etapem przetwarzania próbek FFPE jest zatapianie w parafinie. Próbka tkanki nasączona parafiną jest otaczana warstwą parafiny. Należy zwrócić uwagę na prawidłową orientację bloku tkankowego w foremce („kasecie”), ponieważ ma to wpływ na płaszczyznę przekroju podczas wycinania cienkich przekrojów z bloku za pomocą mikrotomu (Klatt, 2016). Po zestaleniu się osłonki parafinowej blok FFPE jest gotowy do przechowywania i pozostanie dobrze zakonserwowany przez lata, nawet do dziesięcioleci (Hewitt, et al., 2008).

Sekcjonowanie

Po zatopieniu tkanki jest ona gotowa do sekcjonowania na mikrotomie. Ponieważ tkanka nie zawsze jest całkowicie płasko przylegająca do czoła parafiny, histotechnolog musi zazwyczaj „ustawić się” twarzą do bloku. Blok tkanki umieszczany jest w uchwycie mikrotomu i podczas regulacji kąta nachylenia uchwytu bloku, tak aby zmarnować jak najmniej tkanki, histotechnik obraca kołem ręcznym, przesuwając blok w górę i w dół w stosunku do ostrego ostrza. Blok jest cięty tak długo, aż na jego czole znajdzie się w pełni reprezentatywny fragment tkanki. Gdy tkanka znajdzie się na czole, blok umieszcza się na lodzie w celu schłodzenia, co ułatwi cięcie cienkich przekrojów; zbyt ciepła parafina spowoduje powstanie zbitej tkanki z pomarszczonymi przekrojami. Po schłodzeniu blok umieszczany jest z powrotem w uchwycie. Technik ponownie kręci kołem ręcznym, tym razem w wolnym, równomiernym tempie, aby utworzyć kolejne cienkie odcinki, które przylegają do siebie, tworząc „wstęgę”.” Wstążka jest umieszczana na ciepłej łaźni wodnej (temperatura jest utrzymywana tuż poniżej temperatury topnienia parafiny), aby wygładzić wszelkie zmarszczki, które się utworzyły. Następnie technik umieszcza szkiełko mikroskopowe w łaźni wodnej i „nabiera” wybraną sekcję (sekcje) tak, aby przylegały do szkiełka.

Najczęściej spotykana grubość sekcji tkanek wynosi od 3-5 mikrometrów (lub mikronów, w skrócie), co jest grubością pojedynczej komórki. Slajdy z przekrojami o grubości 3-5 mikronów są zwykle używane do barwienia, niezależnie od tego, czy jest to standardowe barwienie Hematoksyliną & Eozyną (H&E), barwienie specjalne, czy barwienie immunohistochemiczne (IHC). Badacze często proszą o „loki” zamiast cienkich przekrojów na slajdach. Loki to grubsze wycinki (10 mikronów lub większe), które umieszcza się w probówkach Eppendorfa i są one zazwyczaj używane w przypadku konieczności ekstrakcji RNA lub DNA z próbek FFPE. Grube skrawki można również umieszczać na szkiełkach mikroskopowych zamiast w probówkach; jest to optymalne rozwiązanie, gdy tylko część tkanki będzie używana do ekstrakcji. W takim przypadku tkanka jest zeskrobywana ze szkiełka i wkładana do probówki. Próbki FFPE, które zostały poddane sekcji, są strukturalnie stabilne i jeśli są odpowiednio traktowane i przechowywane, mogą być używane do analizy mikroskopowej przez pewien czas po sekcji, ale jeśli mają być wykonane ekstrakcje chemiczne, to generalnie sekcje powinny być używane jak najszybciej po wycięciu, aby zapobiec utleniającej i biologicznej degradacji odsłoniętych cząsteczek docelowych.

Szukasz informacji na temat histologii i pobierania bloczków FFPE reprezentujących określone wskazania? Zapoznaj się z naszą stroną z zasobami dotyczącymi histologii. Lab-Ally jest liderem branży w zakresie zgodności z 45CFR46 i 21CFR11, etycznie pozyskiwanych ludzkich biopierwiastków, bioinformatyki, zarządzania danymi naukowymi i nie tylko.

1. Fox, C. H., Johnson, F. B., Whiting, J., & Roller, P. P. (1985). Formaldehyde Fixation. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry, 33(8), 845-853.
2. Dash, A., Maine, I. P., Varambally, S., Shen, R., Chinnaiyan, A. M., & Rubin, M. A. (2002). Changes in Differential Gene Expression because of Warm Ischemia Time of Radical Prostatectomy Specimens. The American Journal of Pathology, 161(5), 1743-1748.
3. Hewitt, S. M., Lewis, F. A., Yanxiang, C., Conrad, R. C., Cronin, M., Danenberg, K. D., Goralski, T. J., Langmore, J. P., Raja, R. G., Williams, P. M., Palma, J. F., & Warrington, J. A. (2008). Tissue Handling and Specimen Preparation in Surgical Pathology: Issues Concerning the Recovery of Nucleic Acids From Formalin-Fixed, Paraffin-Embedded Tissue. Archives of Pathology & Laboratory Medicine, 132(12), 1929-1935.
4. Kiernan, J. A. (2000). Formaldehyd, formalina, paraformaldehyd i glutaraldehyd: Czym są i co robią. Microscopy Today, 00(1), 8-12. Retrieved from http://publish.uwo.ca/~jkiernan/formglut.htm.
5. Pizzolato, P. (1976). Pigment formaliny (kwaśna hematyna) i pigmenty pokrewne. American Journal of Medical Technology, 42(11), 436-440.
6. Howat, W. J., & Wilson, B. A. (2014). Tissue fixation and the effect of molecular fixatives on downstream staining procedures. Methods, 70(1), 12-19.
7. Thavarajah, R., Mudimbaimannar, V. K., Elizabeth, J., Rao, U. K., & Ranganathan, K. (2012). Chemical and physical basics of routine formaldehyde fixation. Journal of Oral and Maxillofacial Pathology : JOMFP, 16(3), 400-405. http://doi.org/10.4103/0973-029X.102496
8. Srinivasan, M., Sedmak, D., & Jewell, S. (2002). Effect of Fixatives and Tissue Processing on the Content and Integrity of Nucleic Acids. The American Journal of Pathology, 161(6), 1961-1971.
9. Tang, W., David, F. B., Wilson, M. M., Barwick, B. G., Leyland-Jones, B. R., & Bouzyk, M. M. (2009). DNA Extraction from Formalin-Fixed, Paraffin-Embedded Tissue. Cold Spring Harbor Protocols. http://doi.org/10.1101/pdb.prot5138
10. Klatt, E. C. Histotechniques: Tissue Processing. Mercer University School of Medicine, Savannah. Retrieved from http://library.med.utah.edu/WebPath/HISTHTML/HISTOTCH/HISTOTCH.html Accessed Dec 28, 2016

.