Pozytywna synergia funkcjonalna zintegrowanych strukturalnie sztucznych dimerów białkowych zmontowanych za pomocą chemii kliknięć

Miejsca interfejsu chemii kliknięć

Przypuszczaliśmy, że obszary powierzchni białka, które są kompatybilne pod względem asocjacji są bardziej prawdopodobne, aby wygenerować zintegrowaną strukturę poprzez tworzenie wzajemnie zgodnych niekowalencyjnych interakcji. Ponieważ białka są monomeryczne, te interakcje są w najlepszym przypadku słabe i przejściowe, więc nie będą się utrzymywać, uznaliśmy, że potrzebujemy molekularnej „śruby” jako części miejsca interfejsu, aby promować i stabilizować wszelkie nowe interakcje. Pierwszym krokiem jest identyfikacja regionów na białkach docelowych, które mają nieodłączny potencjał do interakcji. ClusPro 2.040 (cluspro.org) został użyty do wygenerowania potencjalnych konfiguracji dimerów. Wyjściowe modele homodimerów sfGFP zostały dopracowane, przeanalizowane i uszeregowane przy użyciu programu RosettaDock41,42 (Tabela uzupełniająca 1). Najwyżej uszeregowana konfiguracja jest pokazana na Rys. 1b (która jest najbliższym modelem do ustalonej struktury poniżej; vide infra), a następne 4 uszeregowane konfiguracje są pokazane na Rys. 1. Podczas gdy zaobserwowano różne orientacje jednego sfGFP względem drugiego, dokowanie ujawniło, że reszty 145-148, 202-207 i 221-224 rutynowo przyczyniają się do powstania interfejsu dimeru. Do połączenia obu białek użyto genetycznie zakodowanej bioortgonalnej chemii Click (Rys. 1a). Korzyści w porównaniu z, na przykład, wiązaniami disulfidowymi obejmują dłuższe łańcuchy boczne w celu przezwyciężenia potencjalnych kolizji sterycznych, lepszą stabilność wiązań krzyżowych i zdolność do generowania niesymetrycznych (różne reszty łączące na różnych monomerach) i heterodimerów w zaprojektowany sposób 1 do 1 (vide infra).

Na podstawie modeli dimerów wybrano trzy reszty do zastąpienia dwoma kompatybilnymi z Click ncAA, SCO43 (naprężony alken) i azF (azydek)44,45 (Rys. 1a). H148 i Q204 zostały wybrane na podstawie ich lokalizacji w przypuszczalnym interfejsie dimeru (Rys. 1b i Uzupełniająca Rys. 1). Wiadomo, że obie reszty są łatwo modyfikowane przez małe cząsteczki cyklooktynowe addukty przy wbudowywaniu azF34,46 i leżą blisko funkcjonalnego centrum, chromoforu sfGFP (CRO) (Rys. 1b). Analiza przesunięcia ruchliwości żelu wykazała, że dimeryzacja przebiegła pomyślnie (Rys. 1c, d); zostało to potwierdzone analizą spektrometrii masowej (Rys. 2 uzupełnienia). Przewidywano, że reszty 132 nie będzie w interfejsie dimeru (Rys. 1b i Suplement 1), ale wiadomo, że jest ona kompatybilna z szeregiem naprężonych adduktów alkinowych, począwszy od barwników46 do nanorurek węglowych35 do jednoniciowego DNA36. Jest to zatem dobry test naszej zdolności do przewidywania interfejsów białko-białko i kompatybilności reakcji Click. Pomimo, że reszta 132 jest odsłonięta na powierzchni, nie zaobserwowano żadnego produktu dimeru przy użyciu sfGFP132azF z białkiem zawierającym SCO (Supplementary Fig. 3), co wskazuje na znaczenie zgodności interfejsów powierzchniowych i użyteczność analizy in silico w identyfikacji miejsc kompatybilnych z chemią klikową. Albo zderzenia steryczne i/lub interakcje białko-białko, które utrzymują się dłużej w innych regionach, mogą utrudniać kowalencyjne sieciowanie przy reszcie 132.

Pozytywne przełączanie funkcjonalne przy tworzeniu dimeru sfGFP148x2

H148 tworzy wiązanie H z CRO (Rys. 1b) i odgrywa ważną rolę w migracji protonów, która reguluje populację neutralnej formy A (λmax ~ 400 nm, CRO A) i anionowej formy B (λmax ~ 490 nm, CRO B)47 obecnej w stanie podstawowym. Forma B dominuje w sfGFP, ale po przyłączeniu azF w miejsce H148 (sfGFP148azF) usunięcie wiązania H powoduje, że dominuje teraz stan A33,34 (Rys. 2a i Tabela 1). Inkorporacja SCO do reszty 148 (sfGFP148SCO) wywołuje podobny efekt, z przewagą CRO A, ale z mniejszym przesunięciem ku czerwieni (λmax 492 nm) w mniejszej formie CRO B (Rys. 2a i Tabela 1).

Dimeryzacja sfGFP148azF i sfGFP148SCO wywołuje dwa istotne pozytywne efekty: (i) włącza fluorescencję ON przy ~490 nm dzięki promocji formy CRO B; (ii) znacznie zwiększoną jasność dzięki zwiększonemu molowemu współczynnikowi absorbancji przy 490 nm (Rys. 2a i Tabela 1). Główny pik wzbudzenia jest przesunięty ku czerwieni po dimeryzacji (λmax 492 nm) w porównaniu z sfGFPWT (λmax 485 nm) (Tabela uzupełniająca 3). Stosunek absorbancji 490:400 nm przesuwa się o rząd wielkości z ~0,5 dla monomerów do ~5 dla dimeru, z formą CRO B dominującą w widmie absorbancji dimeru (Rys. 2a) pomimo pozornego braku gatunku, który mógłby zastąpić rolę grupy imidazolowej H148. Poprzednie przykłady modyfikacji sfGFP148azF za pomocą adduktów małych cząsteczek lub fotoaktywacji w najlepszym przypadku prowadzą do częściowej konwersji do formy CRO B33,34. 10-krotna zmiana absorbancji jest odzwierciedlona w emisji fluorescencji; wzbudzenie przy 490 nm powoduje ~20-krotnie wyższą emisję niż w przypadku każdego z monomerów (Rys. 2a). Co więcej, dimer wykazuje zwiększoną funkcjonalność nawet w porównaniu z oryginalnym superfolderem sfGFPWT (Rys. 2b i Tabela 1). Absorpcja molowa i jasność wzrosły o ~ 320% dla sfGFP148x2 (~160% na podstawie CRO) (ryc. 2b) wyżej niż oczekiwano dla prostego addytywnego wzrostu, jeśli jednostki monomeru działają niezależnie od siebie.

Aby zbadać znaczenie połączenia biorytogonalnego, skonstruowaliśmy klasyczne połączenie oparte na disulfidach przez mutację H148 na cysteinę. Warianty sfGFPH148C dimeryzowały, ale tylko w obecności Cu2+ (Supplementary Fig. 4). Właściwości spektralne sugerowały, że dimer był mniej fluorescencyjny w porównaniu z sfGFP148x2 i sfGFPWT (Supplementary Fig. 4). Monomer sfGFPH148C wykazywał oczekiwane przejście z CRO B do CRO A. Chociaż przejście z CRO A do CRO B było obserwowane przy dimeryzacji sfGFPH148C, dimer miał niższą absorbancję na CRO molową niż sfGFPWT i znacznie mniejszą niż sfGFP148x2; nadal obserwowano znaczącą populację stanu A. Emisja fluorescencji przy wzbudzeniu przy 490 nm dla dimerycznego sfGFPPH148C była o około połowę mniejsza niż sfGFPWT. Tak więc, podejście biorytogonalne wygenerowało lepiej działający gatunek dimeryczny niż klasyczne wiązanie disulfidowe.

Molekularne podstawy funkcjonalnego przełączania w sfGFP148x2

Struktura krystaliczna sfGFP148x2 (patrz Tabela uzupełniająca 2 dla statystyk) ujawnia, że monomery tworzą rozległy interfejs dimeru z oddziaływaniami dalekiego zasięgu łączącymi dwa centra CRO. Jednostki monomeryczne sfGFP148x2 układają się w quasi-symetrycznym układzie głowa-ogon przesunięte względem siebie o ~45° (Rys. 3a). Antyrównoległe ułożenie monomerów obok siebie jest najbardziej zbliżone do tego z modelu o najwyższej randze (Rys. 1 i Tabela 1). Gęstość elektronowa nowego triazolowego wiązania krzyżowego jest wyraźnie określona (Rys. 3b) i tworzy wydłużone ogniwo anty-1,4-triazolowe, które jest częściowo zakopane i ściśle związane z obiema jednostkami monomeru, tworząc integralną część interfejsu dimeru (Rys. 3c). CRO są oddalone od siebie o 15 Å i skierowane ku sobie (Rys. 3a).

Interfejs ma cechy podobne do naturalnych dimerów48. Powierzchnia zakopana w interfejsie wynosi ~1300 Å2, a udział w niej mają generalnie te same reszty z każdego monomeru (Rys. 3c, d). Wiązanie H odgrywa ważną rolę z resztami E142, N146, S147, N149 i N170 z obu monomerów, które przyczyniają się do powstania ośmiu międzypodjednostkowych wiązań H (Rys. 3b). Struktura ta pokazuje, że naturalne interfejsy dimerów mogą być naśladowane i stabilizowane poprzez użycie monomerów połączonych kliknięciami, które, jak sugerowało pierwotne modelowanie, były możliwe do wykonania, ale prawdopodobnie były zbyt słabe lub przejściowe, aby utrzymać się bez wbudowanego łącznika. Tak więc, może się okazać, że nasze podejście może być wykorzystane do stabilizacji szerzej przemijających słabych interakcji białko-białko, tworząc w ten sposób określone interfejsy.

Dimeryzacja wywołuje serię zmian konformacyjnych w celu utworzenia sieci interakcji dalekiego zasięgu, która leży u podstaw mechanizmu, za pomocą którego sfGFP jest włączony i wzmocniona jasność. Struktura sfGFP148azF (PDB 5BT0)34 pokazuje, że 148azF zajmuje pozycję podobną do H148 w sfGFPWT, ale nie ma krytycznego wiązania H z fenolową grupą OH w CRO, które promuje tworzenie stanu CRO B. Podczas dimeryzacji, modyfikacja 148azF poprzez utworzenie połączenia triazolowego z 148SCO w monomerze kognatycznym powoduje zmianę pozycji zarówno jego szkieletu jak i łańcucha bocznego powodując powstanie dziury, która może być teraz zajęta przez cząsteczkę wody w dimerze (W1azF na Rys. 4a). Woda może łączyć się wiązaniami H z CROazF i karbonylem w rdzeniu 148azF (Rys. 4). Analogiczna woda jest obecna w monomerze sfGFP148SCO (W1SCO), który tworzy podobne interakcje. Te uporządkowane cząsteczki wody mogą potencjalnie zastąpić oddziaływanie wiązania H, utracone po usunięciu H148, aktywując w ten sposób dimer poprzez promowanie tworzenia CRO B w stanie podstawowym. Cz±steczki wody s± również pochowane w interfejsie dimeru, więc dynamiczna wymiana z rozpuszczalnikiem będzie znacznie ograniczona. Ponadto, dwa CRO s± teraz poł±czone przez rozszerzon±, dominuj±c± sieć wodn±, która obejmuje interfejs dimeru (Rys. 4b, c). Analiza składu tunelu ujawniła, że trzy cząsteczki wody w każdej jednostce (W1azF/SCO, W2azF/SCO i W3azF/SCO) są symetryczne; W4 w połączeniu z szkieletem F145SCO stanowią mostek przez interfejs dimeru, łącząc ze sobą dwie sieci wodne. W ten sposób dimeryzacja generuje rozszerzoną, bogatą w wodę sieć wiązań H, promując w ten sposób przejście ze stanu A CRO do formy B.

Analiza fluorescencji pojedynczej cząsteczki sfGFP148x2

Mikroskopia całkowitego wewnętrznego odbicia fluorescencji (TIRF) została wykorzystana do zbadania zachowania fluorescencyjnego dimerów sfGFP148x2 na poziomie pojedynczej cząsteczki. Przebieg czasowy intensywności fluorescencji pojedynczych dimerów sfGFP148x2 wykazał szereg stanów intensywności, z dominującą fluorescencją przy ~80-100 zliczeń i wykazującą większą trwałość niż subpopulacja stanów o wyższej intensywności, charakteryzujących się krótkimi przejściami do zakresu intensywności od ~100 do 300 zliczeń (Rys. 2c). Ślady fluorescencji wykazują również przedłużoną fotostabilność z długimi okresami do fotobielenia (Rys. 2c i Supplementary Fig. 5). Dla porównania, sfGFPWT fotobluje szybciej, a ślady fluorescencji wykazują pojedynczy stan intensywności, w którym stany włączone trwają na ogół krócej (Suplementary Fig. 6). Co więcej, stwierdzono, że monomeryczny sfGFPWT czasami istnieje w początkowym ciemnym, niefluorescencyjnym stanie, przed zainicjowaniem fluorescencji i późniejszym fotobieleniem (Supplementary Fig. 6). Ekstrakcja średniego czasu trwania fluorescencji przed fotobieleniem i zajęciem przejściowych stanów niefluorescencyjnych (mruganie) wykazała, że sfGFP148x2 wykazuje dłuższe okresy ciągłej fluorescencji (średnio 0,9 s), w porównaniu z sfGFPWT (0,65 s). Biorąc pod uwagę podobieństwo w mierzonej intensywności fluorescencji pojedynczej cząsteczki, zwiększone czasy ON i czas fotobielenia prawdopodobnie przyczyniają się do zwiększonej fluorescencji obserwowanej w pomiarach zespołu stanu ustalonego sfGFP148x2 (Rys. 2a).

Próbując zracjonalizować zakres stanów fluorescencji obserwowanych w śladach dimerów, wygenerowano histogram wszystkich mierzonych intensywności (Rys. 2c). W przeciwieństwie do sfGFPWT (Supplementary Fig. 6), który wykazuje pojedynczy rozkład logarytmiczno-normalny49, sfGFP148x2 preferował dopasowanie dwuskładnikowe50 (Rys. 2c). Zmierzony rozkład intensywności wykazuje dominujący pik o niższej intensywności (~90 zliczeń) i częściowo nakładający się pik o wyższej intensywności, co jest konsekwencją krótkich przejść do stanów o wyższej intensywności obserwowanych w śladach fluorescencji pojedynczej cząsteczki. Podczas gdy bimodalny rozkład intensywności mógłby być oczekiwany w dimerze składającym się z dwóch współlokowanych, niezależnie aktywnych fluoroforów, z każdym fluoroforem sekwencyjnie ulegającym fotobieleniu, ślady czasowe fluorescencji pojedynczej cząsteczki nie są zgodne z tym modelem i wykazują brak dwóch dobrze zdefiniowanych stanów. Proste zachowanie sfGFPWT w stanie włączonym/wyłączonym jest rzadko obserwowane w śladach dimerów, które same nie występują jako oczekiwany addukt dwóch monomerycznych śladów, zamiast tego wykazując bardziej złożone zachowanie.

Wzmocniona funkcja przy formowaniu dimeru sfGFP204x2

Aby zbadać, jak różne miejsca łączenia mogą wywoływać wpływy funkcjonalne, zbadaliśmy alternatywny dimer sfGFP204x2 (Rys. 5a) skonstruowany powyżej (Rys. 1d). Stwierdziliśmy, że dimeryzacja polepszyła właściwości spektralne w porównaniu z prostym dodaniem białek monomerycznych lub sfGFPWT, podkreślając ponownie synergistyczne korzyści dimeryzacji. Inkorporacja azF lub SCO do reszty 204 miała niewielki wpływ na właściwości spektralne w porównaniu do sfGFPWT 46 (Rys. 5b i Tabela 1). Forma B CRO dominowała w formach monomerycznych; zarówno absorbancja molowa, jak i intensywność emisji były podobne do siebie i sfGFPWT. Emisja fluorescencji sfGFP204SCO była nieznacznie obniżona (80% sfGFPWT; Tabela 1). Po utworzeniu dimeru sfGFP204x2 (na dowód patrz Rys. 1d i Suplementarna Rys. 2) analiza spektralna wykazała funkcjonalne wzmocnienie w zakresie podstawowych parametrów spektralnych: molowego współczynnika absorbancji (ε) i emisji fluorescencji (Rys. 5b i Tabela 1). Podczas dimeryzacji ε wzrastał nawet o 400% w porównaniu do monomerów wyjściowych do 160 000 M-1 cm-1. Odpowiada to średniej absorbancji molowej na CRO wynoszącej 80,000 M-1 cm-1, prawie podwajającej jasność w porównaniu z monomerami wyjściowymi i o 31,000 M-1 cm-1 wyższej w porównaniu z sfGFPWT. Zgodnie ze zwiększoną zdolnością do absorpcji światła, zwiększona została również emisja fluorescencji; znormalizowana emisja per CRO była o 180% wyższa niż monomeru sfGFP204azF. Przy użyciu obliczeń Strickler-Berg51 (strona huygens.science.uva.nl/Strickler_Berg/) czasy życia fluorescencji spadają z 3,2 ns dla sfGFPWT do 0,92 ns dla sfGFP204x2. Tak więc, podobnie jak w przypadku sfGFP148x2, dimeryczna struktura sfGFP204x2 ma zwiększone prawdopodobieństwo wzbudzenia elektronowego i wyjścia fluorescencji w porównaniu z formami monomerycznymi (patrz Rys. 8 Suplementu dla porównania spektralnego dimerów). Jest to tym bardziej imponujące dla obu form dimerycznych, że sfGFPWT jest wzorcem dla wydajności zielonego białka fluorescencyjnego.

Znaczenie symetrii dla synergii

Naturalne homodimery białkowe są generalnie symetryczne1,52 i taka symetria była naśladowana w naszym sztucznym dimerze poprzez wspólną resztę wiązania krzyżowego. Zbadaliśmy znaczenie wspólnej reszty sieciującej (jako naśladującej symetrię strukturalną) dla synergizmu funkcjonalnego. Zaletą chemii biorytogonalnej jest to, że wzajemnie zgodne uchwyty reakcyjne pozwalają na konstruowanie zdefiniowanych par (np. 148 + 204 = 148-204, a nie 148-148 lub 204-204), co zapobiega tworzeniu się niepożądanych produktów, które będą trudne do rozdzielenia.

Dimery zostały wygenerowane, które łączyły reszty 148 i 204 w dwóch dostępnych kombinacjach (148SCO+204azF i 148azF+204SOC). Fluorescencja w stanie ustalonym ujawniła, że w obu dimerach wyraźnie obecne były protonowane i deprotonowane formy CRO (Rys. 6a, b). Połączony dimer 148azF-204SCO wykazywał zmianę we względnych populacjach form A i B, ze znacznym wzrostem molowego współczynnika absorbancji przy 490 nm (Rys. 6a); był on prawie dwukrotnie wyższy od oryginalnego sfGFP204SCO i ~30% wyższy od przewidywanego przez proste dodanie widm monomerów. Względna wysokość piku 400 nm pozostaje podobna zarówno w sfGFP148azF jak i w połączonym dimerze 148azF-204SCO, co sugeruje, że populacja zdeprotonowanej formy jest podobna w dimerze jak w oryginalnym monomerze. Dimeryzacja poprzez połączenie 148SCO-204azF zmieniła względne populacje form protonowanych i deprotonowanych, ale zmniejszeniu piku absorbancji przy 400 nm nie odpowiadał równoczesny wzrost piku przy 490 nm (Rys. 6b). W rzeczywistości dimeryzacja była w dużym stopniu szkodliwa, ponieważ oba główne piki absorbancji miały niższy współczynnik absorbancji molowej niż widma prostej addycji monomerów (Rys. 6b). Jest oczywiste, że asymetrycznie połączone dimery są mniej fluorescencyjne i zawierają znaczącą mieszaną populację dwóch stanów CRO w porównaniu z symetrycznie połączonymi dimerami, więc w tym przypadku symetria ma ważne implikacje funkcjonalne.

Heterodimery i integracja funkcjonalna

Heterodimery, w których dimer składa się z dwóch różnych białek, jest powszechnie obserwowanym alternatywnym stanem dimeryzacji1,2. Pozwala on również na projektowanie nowych kompleksów, w których funkcjonalnie różne białka mogą być połączone. Zaletą sprzężenia bioortogonalnego jest możliwość generowania zdefiniowanych, jednogatunkowych (hetero)dimerów składających się z dwóch różnych jednostek białkowych (tj. A + B = A-B, a nie mieszanina A-A, B-B, A-B, która może być trudna do rozdzielenia). Jako białko partnerskie dla sfGFP wybrano białko żółtej fluorescencji Venus29, biorąc pod uwagę nakładanie się ich widma (Supplementary Fig. 9). Różnice sekwencji pokazane są na Rys. 10.

SfGFP148SCO połączono z odpowiednikiem azF zawierającym Venus (Venus148azF), aby wygenerować GFVen148 (patrz Rys. 11 jako dowód). Pojawiają się nowe charakterystyki spektralne sugerujące, że został wygenerowany zintegrowany system. Formacja GFVen148 generuje dimer, który wykazuje lepszą jasność w porównaniu z sfGFP148SCO lub Venus148azF (Rys. 7a i Tabela uzupełniająca 3). Co ciekawe, dimer ma właściwości spektralne pośrednie w stosunku do pojedynczych monomerów bez znaczącego poszerzenia piku (Rys. 7a, b i Uzupełniająca Rys. 12a), co sugeruje, że dwa centra CRO zostały funkcjonalnie zintegrowane pod względem emisji fluorescencji. Główne λmax wynosi 505 nm, pośrednie pomiędzy sfGFP (492 nm) i Venus (517 nm). Wartość ε odpowiadająca formie B CRO (region 490-510 nm) znacznie wzrasta (~4-5-krotnie), wyżej niż w przypadku prostych addytywnych widm monomerów, podczas gdy populacja A CRO maleje, ale nadal jest obserwowana (Rys. 7a). Odpowiada temu ~4-krotny wzrost intensywności emisji po wzbudzeniu przy 505 nm (Rys. 7b). Obserwuje się pojedynczy pik emisyjny, który jest również pośredni pomiędzy dwoma monomerami, niezależnie od długości fali wzbudzenia (λEM przy 517 nm; Rys. 7b, c); pojedynczy, a nie podwójny lub poszerzony pik był obserwowany przy wzbudzeniu przy 490 nm (zdolny do wzbudzenia obu CRO), co sugeruje, że emitowany jest pojedynczy gatunek. Widmo addytywne widm pojedynczych monomerów, które symuluje dwa niezależnie działające białka, wspiera ideę nowej zintegrowanej funkcji, ponieważ jest szersze i przesunięte ku czerwieni w porównaniu ze zmierzonym profilem emisji GFVen148x2 (Supplementary Fig. 12b). Emisja przy wzbudzeniu przy 400 nm została również zmierzona, ponieważ Venus148azF ma niewielką absorbancję przy tej długości fali w porównaniu z GFVen148. Intensywność emisji była 30-krotnie wyższa dla GFVen148 w porównaniu z monomerycznym Venus148azF z maksimum emisji przy 517 nm (Rys. 7c i Uzupełniające Rys. 12c). Zamiast wykazywać klasyczny FRET, jak można by się spodziewać (vide supra), GFVen148 wydaje się działać jako pojedyncza jednostka pod względem wyjścia fluorescencji. Może to sugerować, że dwa CRO działają teraz głównie jako jeden gatunek, przy czym aspekty strukturalne obserwowane dla sfGFP148x2 (takie jak sieć wodna) odgrywają pewną rolę. Obecność znaczącego neutralnego stanu A w CRO sugeruje, że dwie monomeryczne jednostki nie są w pełni zsynchronizowane. Nie neguje to jednak wyraźnego wpływu dimeryzacji na generowanie nowych właściwości spektralnych, takich jak te obserwowane w GFVen148.

Tak jak w przypadku sfGFP, wbudowanie azF w miejsce Q204 (określane jako Venus204azF) miało niewielki wpływ na właściwości spektralne Venus (Tabela Uzupełniająca 3). Kowalencyjne wiązanie poprzez 204 SPAAC (tworząc GFVen204) z powodzeniem wygenerowało dimer (Suplementarna Figura 11). GFVen204 połączył cechy spektralne obu monomerów generując gatunek z λMax zarówno przy 490 jak i 514 nm (stosunek 1:1.2) (Rys. 7e, f i Uzupełniająca Tabela 3). Wenus204 również absorbuje przy 490 nm, ale w stosunku 1:2,7 do 514 nm. Formacja dimerów ponownie zwiększyła absorbancję molową powyżej absorbancji pojedynczych monomerów; w szczególności ε wzrosło o ~26,000 M-1 cm-1 (~27%) dla λmax związanego z Venus (514 nm), gdzie jest niewielki wkład dla sfGFP. Aby zbadać komunikację między monomerami, monitorowano emisję fluorescencji po wzbudzeniu przy czterech różnych długościach fali: 400 nm (tylko sfGFP); 450 nm (sfGFP, minor Venus); 490 nm (sfGFP λmax, ramię Venus); 510 (Venus, minor sfGFP). Przy wszystkich długościach fal wzbudzenia, jedyny wyraźny pik emisyjny znajdował się przy 528 nm (Rys. 7b), odpowiadając Venus wskazującej na komunikację poprzez rezonansowy transfer energii Förstera (FRET). Pik emisyjny korelujący z sfGFP204SCO (~510 nm) nie został zaobserwowany nawet przy wzbudzeniu przy niższych długościach fali specyficznych dla sfGFP. Nie zaobserwowano również pośredniego piku emisyjnego charakterystycznego dla GFVen148, co podkreśla nowatorską charakterystykę heterodimeru 148. Najbardziej znacząca różnica została zaobserwowana przy wzbudzeniu przy 400 nm, gdzie nastąpił 14-krotny wzrost intensywności emisji przy 528 nm dla GFVen204 w porównaniu z Venus204azF (Rys. 7f, inset). Obliczona względna wydajność FRET po dekompozycji spektralnej wynosiła około 90%. Tak więc, dwa centra funkcjonalne komunikują się poprzez transfer energii (Rys. 7g) w wysoce wydajny sposób.

.