Regulacja ruchliwości przez parę centralną
Zmiany ruchliwości w odpowiedzi na bodźce zewnętrzne mogą przybierać jedną z dwóch form. Bodziec może zmienić częstotliwość przypadkowej reorientacji, jak to ma miejsce u bakterii, tak że ruchliwość w korzystnym kierunku jest nagradzana, lub bodziec może bezpośrednio regulować ruchliwość, tak że organizm skręca w określonym kierunku względem bodźca (w kierunku bodźca dla taksji pozytywnych, w kierunku przeciwnym dla taksji negatywnych). Takie taktyczne skręcanie wymaga zlokalizowanych receptorów, które mogą działać jak antena, oraz aparatu ruchowego, który może być sterowany kierunkowo (Foster i Smyth, 1980). Prosta regulacja typu stop-reorient-start nie wymaga wyrafinowanej regulacji ruchliwości. U flagelli kontrola kierunku wymaga skoordynowanych zmian w kształcie fali i częstotliwości bicia, a więc bardziej wyrafinowanego aparatu regulacyjnego. Centralny układ para-szprychy spełnia tę rolę w rzęskach i flagellach 9+2, co najbardziej elegancko zademonstrowano u Chlamydomonas (ryc. 1D). Ta jednokomórkowa, biflagellowa alga odpowiada na bodźce fototaktyczne zmieniając względny kształt fali, prędkość skoku i częstotliwość bicia swoich dwóch flagelli (Witman, 1993). Dostępne dowody wskazują, że fototaksja obejmuje ścieżkę transdukcji sygnału z centralnego aparatu, poprzez promieniste szprychy, do kompleksu regulacyjnego związanego z dubletem, który następnie modyfikuje wzór aktywności dyneiny, a tym samym formowanie i propagację zakrętu poprzez zmiany w kinazach i fosfatazach białkowych związanych z dyneiną (Porter i Sale, 2000; Smith i Yang, 2004).
Pomimo, że mógł istnieć więcej niż jeden możliwy sposób na uformowanie asymetrycznego aparatu centralnego, ten zbudowany na minimalnym rusztowaniu z dwóch mikrotubul mógł powstać jako pierwszy i wymagałby minimalnej zmiany w protocilium, przede wszystkim dodania nowego miejsca inicjacji montażu w strefie przejściowej wraz ze strukturą (radial spoke) do przekazywania sygnałów z aparatu centralnego do dynein związanych z dubletem. Wyobrażamy sobie, że radialne szprychy wyewoluowały z regulacji dynein w arkuszach dubletów, gdzie oddziaływały one u swych podstaw z kompleksem regulacyjnym dynein związanym z dubletem, a na swych końcach z białkami związanymi z mikrotubulami w innym rzędzie dubletów lub w korowym cytoszkielecie pojedynczych mikrotubul. Bior±c pod uwagę prawdopodobieństwo, że dyneiny flagellarne wyewoluowały z dynein cytoplazmatycznych, wydaje się niezwykłe, że nie znamy wspólnych mechanizmów regulacyjnych dla tych dwóch rodzin dynein. Może to jednak odzwierciedlać raczej nasz obecny brak wiedzy niż brak konserwatywnych mechanizmów. Niedawna analiza molekularna białka w kompleksie regulacyjnym dyneiny Chlamydomonas ujawniła pierwotną strukturę, która wykazuje podobieństwo do białek cytoplazmatycznych, ale związek z dyneiną cytoplazmatyczną nie został ustalony (Rupp i Porter, 2003).
Wyodrębnienie specyficznych wzorów interakcji pomiędzy projekcjami z centralnej pary mikrotubul a promienistymi szprychami, które wywołują specyficzne zmiany w aktywności dyneiny pozostaje wielką zagadką. Ostatnie wyniki z naszego laboratorium, w tym analiza normalnej struktury pary centralnej, charakterystyka mutantów z defektem montażu pary centralnej oraz określenie orientacji pary centralnej podczas propagacji zakrętu, ograniczają modele tego, jak CP reguluje dyneinę. Tutaj próbujemy zsyntetyzować hipotezę regulacji pary centralnej zgodną z tymi wynikami.
Wcześniejsza mikroskopia elektronowa cienkich przekrojów aksonów Chlamydomonas i Tetrahymena, wraz z preparatami barwnika negatywnego kompleksów pary centralnej z rzęsek Tetrahymena (Chasey, 1969) i flagelli plemników szczura (Olson i Linck, 1977) ujawniła asymetryczną strukturę kompleksów pary centralnej i określiła mikrotubulę CP z dłuższymi projekcjami w przekroju poprzecznym i okresowością powtórzeń 32 nm jako C1, podczas gdy druga (C2) ma krótsze projekcje z powtórzeniami tylko 16 nm. Porównując poprzeczne i podłużne cienkie przekroje kompleksów pary centralnej typu dzikiego z kompleksami pary centralnej z mutantów asocjacyjnych pf6 i cpc1, określiłam strukturalne relacje i okresy powtórzeń dla większości projekcji związanych z C1 i C2 w Chlamydomonas. Widoki powierzchniowe dostarczone przez obrazy stereo z szybko zamrożonych, głęboko wytrawionych preparatów potwierdziły i rozszerzyły te wnioski i doprowadziły do dość kompletnej 3-d rekonstrukcji pary centralnej (Mitchell, 2003a). Badania te dostarczają modelu potencjalnych miejsc interakcji szprych na parze centralnej, a w szczególności ukazują nieciągłości w cylindrycznej skądinąd powierzchni CP wzdłuż powierzchni mikrotubul, które skierowane są w stronę sąsiednich główek szprych. Podkreślono również ogólną asymetrię kompleksu CP, która sugeruje unikalne interakcje szprych w różnych pozycjach radialnych wokół cylindra CP. Klonowanie genów pf6 (Rupp i in., 2001) i cpc1 (Mitchell i Sale, 1999; Zhang i Mitchell, 2004) oraz identyfikacja produktów ich genów nie wskazały oczywistych kandydatów na białka oddziałujące z promienistymi szprychami, ale białko podobne do kinezyny (Klp1) na mikrotubuli C2 (Bernstein i in., 1994) jest atrakcyjnym kandydatem na białko wiążące szprychy. Ostatnio wykazaliśmy, że flagelle w komórkach pozbawionych Klp1 biją z dramatycznie zmniejszoną częstotliwością (Mitchell i Yokoyama, 2003).
Badania EM wykazują, że CP utrzymuje stałą orientację w odniesieniu do ciała komórki i zewnętrznych dubletów u niektórych organizmów, podczas gdy u innych CP ma zmienną orientację. Filogenetycznie, stała orientacja wydaje się być pochodnym uproszczeniem w organellach, które mają stałą płaszczyznę zgięcia, takich jak rzęski płytek grzebieniowych kenoforów (Tamm i Tamm, 1981) i wiele plemników metazoanów (Sale, 1986). W skrajnych przykładach, mikrotubule C1 i C2 s± poł±czone z dubletami 8 i 3, odpowiednio, trwałymi poł±czeniami (zmodyfikowanymi szprychami lub strukturami pomocniczymi). Na przeciwnym biegunie znajdują się rzęski i chorągiewki organizmów jednokomórkowych, które w odpowiedzi na wskazówki środowiskowe polegają na szybkich zmianach kształtu fali, częstotliwości uderzeń i efektywnej orientacji skoku. CP w tych organellach są skręcone, tak że nie utrzymują stałej orientacji od podstawy do końca w obrębie otaczających je 9 dubletów. Ponadto, te skręcone CP obracają się podczas propagacji zakrętu (Omoto i in., 1999). Ostatnio wykazaliśmy, że CP Chlamydomonas jest zorientowany równolegle do płaszczyzny zagięcia w obrębie każdego zagięcia (Rys. 1D) i skręca się o 180° pomiędzy kolejnymi zagięciami głównymi i odwrotnymi, oraz że mikrotubula C1 jest zawsze najbliżej dubletów po zewnętrznej stronie każdego zagięcia (Mitchell, 2003b). Ta stała orientacja CP względem zagięcia w Chlamydomonas pozwala jednemu zestawowi projekcji CP oddziaływać z promienistymi szprychami przymocowanymi do dubletów z aktywnymi dyneinami, podczas gdy inny zestaw projekcji CP oddziałuje z promienistymi szprychami na dubletach z nieaktywnymi dyneinami.
Ale chociaż otoczka beleczkowania jest prawie planarna w Chlamydomonas, a kierunek głównych zagięć nie zmienia się dramatycznie z dala od stałej płaszczyzny, nie jest to prawdą u innych organizmów. Jeśli u tych organizmów orientacja CP również podąża za orientacją zgięć, jak proponuję, to CP jest zawsze ustawiony tak, by zapewnić elastyczną kontrolę ruchliwości. Nasze ostatnie wyniki wskazują, że orientacja CP pasywnie dostosowuje się do zagięć, gdy te tworzą się u podstawy flagellum Chlamydomonas, a następnie ta zależna od zagięcia orientacja przemieszcza się, gdy każde zagięcie rozprzestrzenia się od podstawy do końca. Analogią z inżynierii jest przekładnia ślimakowa, w której obrót ślimaka (pary centralnej) jest kluczowany do prostopadłego ruchu (propagacji wygięcia) współzależnych trybików zębatej przekładni (wygięcia aksonalne). Kierunek zakrętu głównego nie może być zatem określony przez orientację pary centralnej, która pasywnie dostosowuje się do zakrętów, ale musi być regulowany na poziomie dubletów zewnętrznych, poprzez wzorce inicjacji u podstawy flagelli. Sygnały regulacyjne z CP mogą więc determinować kształt i częstotliwość pobudzeń poprzez bezpośrednią modulację wzorów aktywności dynein w obrębie rozwijających się i propagujących zakrętów. Hipoteza ta jest zgodna z wynikami wibracyjnej reorientacji płaszczyzny pobudzenia aksonów jeżowców (Shingyoji i in., 1991; Takahashi i in., 1991). Jeśli nowa płaszczyzna zakrętu indukowana przez wibrację wymusza nową orientację pary centralnej, to relaksacja układu po usunięciu wibracji z tych komórek wymagałaby stopniowej rotacji pary centralnej z powrotem do pozycji spoczynkowej. Niestety, w tych eksperymentach nie udało się uzyskać informacji o rzeczywistej orientacji CP. Hipoteza ta jest również zgodna z wzorcem przesuwania się dubletów obserwowanym w aksonach Chlamydomonas poddanych działaniu proteazy, w których wzorce przesuwania się dubletów zachowują stałą relację do orientacji pary centralnej (Wargo i Smith, 2003; Wargo i in.., 2004), oraz z badaniami aktywności dyneiny w zaburzonych aksonach Chlamydomonas (Smith, 2002) i jeżowca (Yoshimura i Shingyoji, 1999; Nakano i in., 2003), które wykazują zależną od wapnia i pary centralnej modulację aktywności.
Jaką wartość predykcyjną mają te spekulacje na temat ewolucji rzęsek i flagelli? Po pierwsze, stawiamy hipotezę, że rozwój ruchliwości powierzchniowej flagelli jest prymitywny i prawdopodobnie będzie spotykany na szeroką skalę, nawet u pochodnych rzęsek, które nie biją. Wyraźnie widać, że IFT jest niezbędną i uniwersalną ruchliwością dla składania zarówno ruchliwych, jak i niemotylnych organelli, więc powiązanie tej maszynerii z ruchem zewnątrzkomórkowym może być równie powszechne. Po drugie, sekwestracja receptorów na błonach rzęskowych jest również prymitywna i prawdopodobnie stanowi główny nacisk selekcyjny na dalsze istnienie niemotylnych rzęsek pierwotnych, jak również bardziej zmodyfikowanych rzęsek narządów zmysłów. Ponieważ pochodne rzęsek pełni± zasadnicze funkcje w neuronach czuciowych wielu organizmów, wystarczy tylko niewielki skok my¶lowy, by zasugerować, że protocilium również stanowiło rodowód dla wszystkich procesów czuciowych, a dodatkowe cechy tej organelli mog± być wspólne dla kaskad transdukcji czuciowej. Po trzecie, orientacja centrosomu jako wskaźnika polaryzacji komórek i kierunku migracji komórek ruchliwych jest również bardzo prymitywna. Jeżeli tak, to znaczenie protocilium jako wczesnego wyznacznika polarno¶ci komórek i kierunku migracji sugeruje, że należy szukać dalszych powi±zań między mechanizmami determinuj±cymi polarno¶ć komórek a mechanizmami orientuj±cymi centrosomy/centriole wraz z cytoplazmatycznym układem mikrotubul. Wreszcie, regulacja rzęsek i flagelli przez centralną parę musiała również powstać bardzo wcześnie w ewolucji eukariotycznej, przed radiacją wszystkich wymarłych eukariotycznych filii. Chociaż niewątpliwie istnieją różnice w szczegółowej regulacji wymaganej przez te organelle w różnych organizmach i typach komórek, powinniśmy oczekiwać znalezienia wielu uniwersalnych cech w sposobie, w jaki interakcje para centralna-szprychy promieniste regulują aktywność dyneiny, i możemy jeszcze znaleźć wspólne tematy w regulacji aksonalnych i cytoplazmatycznych silników dyneinowych.