PMC

Representative Results

Zdolność testów plazmidowych do dokładnej oceny miana wirusów zależy od wielu czynników: odpowiedniej selekcji komórek gospodarza, odpowiednich mediów i warunków wzrostu dla komórkowej i wirusowej żywotności, unieruchomionej propagacji wirusów i dokładnego określenia okresu inkubacji wirusów, aby zapewnić odpowiedni czas na wyraźne i policzalne formowanie plastrów.

Do tego badania wybrano wirusy z trzech reprezentatywnych rodzin, aby wykazać różnice w: selekcji nakładek, okresach inkubacji i morfologii płytek w różnych typach próbek. Venezuelan Equine Encephalitis (VEEV) został wybrany jako (+)ssRNA model wirusowy, który może powodować znaczące choroby u koni i ludzi i reprezentuje rodzinę Togaviridae. Szczep grypy B Taiwan, segmentowany (-)ssRNA wirus zakażający głównie ludzi, reprezentuje rodzinę Orthomyxoviridae. Wirus gorączki doliny Rift (RVFV), wirus (-)ssRNA przenoszony przez stawonogi, pierwotnie zakażający stawonogi, przeżuwacze i ludzi, został wybrany jako przedstawiciel rodziny Bunyaviridae.

Dla RVFV (rysunek 1), miana oznaczano z roztworu podstawowego rekombinowanego żywego atenuowanego szczepu MP12 RVFV w formacie 12-dołkowej płytki wykorzystującej CMC, agarozę lub nakładki Avicel, które inkubowano obok siebie przez 72 h po zakażeniu (hpi). Reprezentatywna płytka pokazująca rozcieńczenia od 10-4 do 10-7 jest widoczna w panelu A. Płytki z nakładkami CMC i agarozowymi wykazywały małe, jasne i wyraźne płytki z dobrze zdefiniowaną okrągłą granicą. Płytki z płynną warstwą były nieco bardziej obfite i większe w porównaniu z płytkami agarozowymi i CMC, i miały mniej wyraźną granicę. Miana wirusów zostały porównane w panelu B ze wszystkimi nakładkami o porównywalnych wynikach.

W celu uzyskania wyraźniejszego porównania wizualnego pomiędzy nakładkami dla MP12 wraz z większym rozmiarem próbki w celu określenia odtwarzalności, 6-dołkowa płytka została również przetestowana w trzech egzemplarzach (Figura 2). W formacie płytki 6-dołkowej, użycie nakładki CMC wykazało mniejsze płytki niż nakładki agarozowe lub płynne, które były porównywalnej wielkości do siebie. Podczas gdy miana wirusów były podobne między wszystkimi trzema nakładkami (Panel D), blaszki utworzone w nakładkach agarozowych i płynnych okazały się łatwiejsze do policzenia ze względu na ich większy rozmiar.

W przeciwieństwie do RVFV, miana VEEV i morfologia blaszek między różnymi nakładkami różniły się znacznie (Rysunek 3A). Blaszki utworzone w nakładkach CMC wykazywały jasną i wyraźną morfologię przy zastosowaniu formatu płytki 12-dołkowej, kosztem wielkości i czułości blaszki (panel B). W przeciwieństwie do CMC, zastosowanie nakładek agarozowych i płynnych spowodowało powstanie znacznie większych blaszek, wskazując na niższą inhibicję wirusową i zwiększoną wrażliwość na replikację VEEV. Zostało to wcześniej potwierdzone podczas porównywania wyłącznie agarozy z CMC w pracy opublikowanej przez Juarez et al.4. Podczas gdy agaroza i płynne nakładki wytworzyły większe płytki niż CMC, płytki miały słabo zdefiniowane granice i były trudne do policzenia w formacie 12 studzienek, przy czym płynne nakładki zapewniały największą dyfuzję granic. Kiedy płytki testowano na płytkach 6-dołkowych (Rysunek 4), większy format 6-dołkowy zanegował kwestię wyraźnie dużych płytek, które były trudne do rozróżnienia w formacie 12-dołkowym, przy czym nakładki agarozowe i płynne okazały się lepsze od nakładek CMC pod względem definicji płytek i czułości (Rysunek 4D).

W porównaniu z RVFV lub VEEV, grypa stwarza kilka unikalnych wyzwań przy tworzeniu płytek, takich jak wymóg zewnętrznej proteazy. Wrażliwość wirusa grypy na różne selekcje nakładek została również dobrze udokumentowana w przeszłości, ponieważ zauważono znaczące zmiany, gdy zastosowano tak niewielkie modyfikacje, jak różne marki agarozy9.

Co ciekawe, w przypadku szczepu grypy B Taiwan, zastosowanie CMC jako nakładki spowodowało powstanie wyraźnie mniejszych płytek, które trudno było policzyć i które trudno było wiarygodnie ocenić (rysunek 5A). Zastosowanie nakładki agarozowej dostarczyło najlepszych płytek (panel C) i spowodowało ciemniejsze zabarwienie tła (prawdopodobnie z powodu zwiększonej żywotności monowarstwy) oraz pokazało wyraźniejsze i ostrzejsze płytki w bezpośrednim porównaniu z zastosowaniem nakładki płynnej (panel B).

Wyraźna przewaga płynnych polimerów nad stałymi i półstałymi nakładkami, takimi jak agaroza i CMC, polega na łatwości usuwania i stosowania. Nakładki półstałe wymagają ogrzewania, a zestalenie może okazać się problematyczne podczas przenoszenia i usuwania. Aby wykorzystać te zalety i określić praktyczność wykorzystania Avicelu w sposób wysokowydajny dla RVFV, wypróbowano 96 dołkowy format płytek przy różnych stężeniach nakładek (Rysunek 6). W przypadku RVFV MP-12, rozcieńczenia przeprowadzono w czterech powtórzeniach zarówno przy 0,6 jak i 1,2% końcowym stężeniu Avicelu. Nakładanie i usuwanie warstw okazało się proste, bez widocznych różnic między powtórzeniami lub między stężeniami, co świadczy o wysokim stopniu odtwarzalności. Podczas punktacji, płytki były wyraźne i możliwe do policzenia gołym okiem, wykazując wykonalność wykorzystania płynnych nakładek w sposób wysokowydajny dla RVFV.

Rysunek 1:Porównania nakładek RVFV wykorzystujące płytki 12-dołkowe. Veros umieszczono w liczbie 2,5 x 105 komórek na 12 dołkowych płytkach i zakażono 200 µl przy użyciu tej samej seryjnie rozcieńczonej próbki wyjściowej MP12. Po zakażeniu nakładano 1,5 ml 0,3% agarozy, 0,6% Avicelu lub 1% CMC (stężenia końcowe) w celu bezpośredniego porównania nakładek, jak pokazano w panelu A. Płytki były liczone i miareczkowane w panelu B .

Rysunek 2:Porównania nakładek płytek RVFV wykorzystujące płytki 6 dołkowe. Veros umieszczono w liczbie 5 x 105 komórek na 6 dołkowych płytkach i zakażono 400 µl przy użyciu tej samej seryjnie rozcieńczonej próbki wyjściowej MP12. Zastosowano trzy ml nakładek z 0,3% agarozy, 0,6% Avicelu lub 1% CMC w celu bezpośredniego porównania nakładek, jak pokazano w panelu A, B i C. Oddzielne eksperymenty przeprowadzono identycznie, jak opisano dla paneli A-C, z blaszkami policzonymi i miareczkowanymi w panelu D (N = 3).

Rysunek 3:Porównania nakładek blaszek VEEV wykorzystujące płytki 12 dołkowe. Veros w liczbie 2,5 x 105 komórek umieszczano na płytkach 12-dołkowych i zakażano 200 µl tej samej seryjnie rozcieńczonej próbki wyjściowej szczepu szczepionkowego VEEV TC-83. Po zakażeniu nakładano 1,5 ml 0,3% agarozy, 0,6% Avicelu lub 1% CMC w celu bezpośredniego porównania nakładek, jak pokazano w panelu A. Płytki były liczone i miareczkowane w panelu B.

Ryc. 4: Porównanie nakładek płytek VEEV z wykorzystaniem płytek 6-dołkowych. Veros umieszczano w liczbie 5 x 105 komórek na płytkach 6-dołkowych i zakażano 400 µl przy użyciu tej samej seryjnie rozcieńczonej próbki wyjściowej VEEV TC-83. Po zakażeniu nakładano 3 ml 0,3% agarozy, 0,6% Avicelu lub 1% CMC w celu bezpośredniego porównania nakładek, jak pokazano w panelach A, B i C. Oddzielne eksperymenty przeprowadzono identycznie jak opisano dla paneli A – C, z blaszkami liczonymi i miareczkowanymi w panelu D (N = 3).

Rysunek 5:Porównanie nakładek blaszek grypy. Komórki MDCK umieszczono w liczbie 5 x 105 komórek na 6-dołkowych płytkach i zakażono 400 µl inokulum przy użyciu tej samej seryjnie rozcieńczonej próbki wyjściowej grypy B Taiwan. W pożywkach wzrostowych i podłożach nie stosowano płodowej surowicy bydlęcej (FBS), ponieważ FBS może hamować rozmnażanie grypy poprzez hamowanie niektórych proteaz, które są wymagane do syntezy wirusowej. TPCK-trypsyna była dodawana do wszystkich nakładek przed zastosowaniem w celu ułatwienia fuzji wirusowej i wejścia wirusa do komórek gospodarza. Po infekcji nałożono 3 ml warstw 0,3% agarozy, 0,6% Avicelu lub 1% CMC w celu bezpośredniego porównania warstw, jak pokazano w Panelu A, B i C. Oddzielne eksperymenty przeprowadzono identycznie, jak opisano w Panelach A – C, a płytki policzono i oznaczono w Panelu D (N = 3). Podczas gdy średnia została przyjęta dla płytek CMC, okazały się one trudne do wiarygodnego policzenia, ponieważ wykazywały rozproszone granice i bardzo małe rozmiary płytek.

Figura 6:Nakładki płytek o wysokiej przepustowości. 96 dołkowe płytki Veros z 3 x 104 komórkami na dołek, zostały zainfekowane 50 µl inokulum przy użyciu tej samej seryjnie rozcieńczonej próbki wyjściowej RVFV MP12 przez 1 h, w czterokrotnym powtórzeniu. Dla nakładek, wypróbowano 0,6 i 1,2% końcowe stężenia Avicelu w celu określenia wykonalności i odtwarzalności wykorzystania płynnych nakładek w sposób wysokowydajny, panele A i B.

Tabela 1:Warunki inokulacji w teście Plaque Assay i typy komórek

Tabela 2:Plaque and Viral/Cellular Growth Medias

Roztwory do nakładania nie tracą ważności po sporządzeniu tak długo, jak długo zachowana jest sterylność.

Tabela 3:Zapasy nakładek

Tabela 4: Formaty płytek

.