3.1 OMVs: Composition, Biogenesis, and Functional Roles
OMVs to odporne i dyskretne sferyczne dwuwarstwowe nanostruktury lipidowe, o średnicy od 10 do 300 nm, pochodzące z otoczki komórkowej i niezdolne do samodzielnej replikacji (Kulp i Kuehn, 2010; Huang i in., 2016) (ryc. 4). Oderwanie OMVs po raz pierwszy zaobserwowano ponad 50 lat temu na transmisyjnych mikrografach elektronowych przedstawiających ultrastrukturę ściany komórkowej bakterii (Bladen i Waters, 1963; Bayer i Anderson, 1965; Chatterjee i Das, 1967). Ustalono, że te nanosferyczne struktury składają się z pojedynczej membrany otaczającej gęste od elektronów centrum (Work i in., 1966). Inne badania z tego samego okresu również donosiły o obecności „globulek pozakomórkowych” w supernatancie bezkomórkowym E. coli hodowanej w warunkach wzrostu ograniczających składniki odżywcze (Bishop i Work, 1965; Knox i in., 1966; Work i in., 1966). Dlatego też początkowo postulowano, że tworzenie OMV zachodzi wyłącznie w warunkach stresowych. Jednakże dalsze badania wyraźnie wykazały, że OMVs mogą być również wykrywane w warunkach niestresowych, zarówno w warunkach laboratoryjnych, jak i środowiskowych (Hoekstra i in., 1976; Hellman i in., 2000). Obecnie wiadomo, że OMVs biorą udział w wielu kluczowych funkcjach biologicznych, a jedną z pierwszych ról opisanych dla OMVs jest ich udział w patogenezie, szczególnie jako nośników czynników wirulencji (patrz Ellis i Kuehn, 2010). Z biegiem lat, w zależności od gatunku i warunków hodowli, przypisywano OMV dodatkowe funkcje, w tym komunikację wewnątrzgatunkową/międzygatunkową, reaktywność na stresy otoczkowe, pozyskiwanie składników odżywczych, horyzontalny transfer genów, działanie jako „wabiki”, a także dobra publiczne (szczegółowy opis: Kulp i Kuehn, 2010 oraz Schwechheimer i Kuehn, 2015). Ogólnie rzecz biorąc, OMVs wydają się promować przetrwanie bakterii w określonej niszy środowiskowej, co podkreśla ich znaczenie dla bakteryjnej homeostazy.
Fig. 4. Pęcherzyki błony zewnętrznej z bakterii Gram-ujemnych. (A) Przedstawienie pęcherzyka błony zewnętrznej (OMV-górny panel) pochodzącego z otoczki komórki bakteryjnej (dolny panel). Pokazane są szczegóły błony zewnętrznej (OM) i wewnętrznej (IM), w tym białka transmembranowe. W przestrzeni peryplazmatycznej, w której znajduje się warstwa peptydoglikanu (PG), widoczne są rozpuszczalne białka peryplazmatyczne, błędnie złożone białka i kwasy nukleinowe. Zawartość OMV ilustruje część biomolekuł, które zostały zidentyfikowane zarówno na ich błonie jak i w świetle. (B i C) Transmisyjne mikrografy elektronowe negatywnie wybarwionej octanem uranylu komórki Synechocystis sp. PCC 6803 uwalniającej OMV (B, 120 000 × powiększenie), oraz wolne od komórek stężone medium pozakomórkowe Synechocystis sp. PCC 6803 ukazujące kilka OMV (C, 40 000 × powiększenie).
(A)Based on Jan, A.T., 2017. Outer membrane vesicles (OMVs) of Gram-negative bacteria: a perspective update. Front. Microbiol. 8, 1053.
Numeryczne badania wykazały, że OMVs są wzbogacone w składniki OM, a mianowicie LPS i OMP, a także białka peryplazmatyczne, fragmenty PG, a nawet kwasy cytoplazmatyczne i nukleinowe (Biller i in., 2014, 2017; Lee i in., 2016). Wczesne doniesienia właściwie nie odróżniały MVs sztucznie utworzonych w roztworze (ze względu na naturalne zachowanie lipidów polegające na przegrupowywaniu się w pęcherzyki, bezkrytycznie porywające materiał z lizy bakteryjnej) od nienaruszonych OMVs. Ostatnio, ulepszone metodologie izolacji i najnowocześniejsze techniki omiczne pozwoliły na dokładną analizę składu OMVs. Co ciekawe, OMVs są w rzeczywistości wzbogacone w specyficzne składniki komórkowe, podczas gdy są zubożone w inne (Lee i in., 2008), wspierając ideę, że wybór zawartości ładunku nie jest procesem losowym. Na przykład, zawartość OMVs Salmonella sp. zmieniała się w zależności od badanych warunków wzrostu: w OMVs izolowanych z komórek w warunkach obfitujących w składniki odżywcze preferencyjnie wykrywano białka cytozolowe zaangażowane w translację i metabolizm komórkowy, podczas gdy w warunkach ograniczających odżywianie OMVs były wzbogacone w białka błonowe zaangażowane w transport składników odżywczych (Bai i in., 2014). Ponadto, podejście oparte na spektrometrii mas wskazało, że żaden szeroko konserwowany specyficzny składnik nie został wykryty w OMVs (Schwechheimer i in., 2013), po raz kolejny wskazując na zmienny skład. Podsumowując, oczekuje się, że zróżnicowany skład OMVs jest związany zarówno z zależnymi od szczepu cechami otoczki komórkowej, jak i z odmiennymi niszami ekologicznymi (Yoon, 2016).
Zaproponowano trzy niewykluczające się wzajemnie mechanizmy powstawania OMVs. W jednym modelu pęcherzykowanie zachodzi, gdy kowalencyjne wiązania krzyżowe między białkami błonowymi a warstwą PG zostają lokalnie przerwane, albo przez tymczasowe zmniejszenie ogólnej obfitości wiązań krzyżowych, albo przez zlokalizowane przemieszczenie wiązań krzyżowych, promując wybrzuszenie małych porcji OM. Inny model obejmuje nanoterytoria peryplazmatyczne, w których gromadzą się źle złożone białka i inne składniki otoczki (LPS lub fragmenty PG). W następstwie tego nieprawidłowego, zamkniętego gromadzenia się składników komórkowych, integralność otoczki zmniejsza się lokalnie, wywołując pękanie porcji OM wypełnionych treścią lumenalną. Wreszcie, zaproponowano również, że szczególne cechy biofizyczne niektórych lipidów OM mogą promować pęcherzykowanie, wskazując na specyficzną integrację LPS lub fosfolipidów, co prowadzi do zmian w płynności i elastyczności błony. Zakłada się również, że wiele innych czynników wpływa na wielkość, tempo produkcji i skład OMVs, a jeśli istnieje konsensusowy proces biogenezy OMVs, to nie jest on do końca scharakteryzowany (Kulp i Kuehn, 2010; Schwechheimer i Kuehn, 2015; Yoon, 2016).
W badaniach nad sinicami, dziedzina OMVs jest wciąż dość świeża i wiele pozostaje do zbadania. Szczególnie dobrze ilustruje to fakt, że najwcześniejsza publikacja poświęcona wyłącznie badaniu sinicowych OMVs pochodzi z 2014 roku (Biller i in., 2014). W tej przełomowej pracy nie tylko wykazano, że kontrolowane laboratoryjnie kultury morskiej cyjanobakterii Prochlorococcus w sposób ciągły uwalniają OMVs, ale również, że pęcherzyki te można znaleźć obficie w próbkach wody morskiej. Ponadto wykazano, że OMVs Prochlorococcus są w stanie wspierać wzrost heterotroficznych kultur bakteryjnych, co wskazuje na udział tych struktur w morskim przepływie węgla. Ponadto, zaobserwowano interakcje fag-cząsteczka, co wskazuje na potencjał OMVs jako „wabików”. Ogólnie, autorzy zilustrowali niektóre z fundamentalnych ról OMVs i ich niezliczone implikacje dla ekosystemów mikrobiologicznych (Biller i in., 2014). W nowszej publikacji, OMVs Prochlorococcus zostały porównane z OMVs trzech innych morskich heterotrofów, w próbie odsłonięcia częstotliwości pakowania DNA do pęcherzyków i zróżnicowania pomiędzy różnymi taksonami (Biller i in., 2017). Badając ilość i dystrybucję DNA związanego z OMVs, wykazano, że DNA jest różnie enkapsulowany w obrębie i pomiędzy populacjami OMVs. Co bardziej zdecydowane, praca ta sugeruje, że mechanizm, który pakuje DNA do OMVs nie działa jednakowo u wszystkich bakterii (Biller i in., 2017). Oprócz Prochlorococcus i morskich szczepów Synechococcus, wykazano, że inne sinice również tworzą i uwalniają OMVs, w tym jednokomórkowe Synechococcus sp. PCC 7002 (Xu i in., 2013) i Synechocystis sp. PCC 6803 (Pardo i in., 2015; Oliveira i in., 2016), nitkowate Jaaginema litorale LEGE 07176 (Brito i in., 2017), oraz nitkowate, heterocystotwórcze Anabaena sp. PCC 7120 (Oliveira i in., 2015a) i Cylindrospermopsis raciborskii (CYRF-01) (Zarantonello i in., 2018).
Poza rolami opisanymi powyżej dla OMVs pochodzących z sinic morskich (Biller i in., 2014), zaproponowano inne funkcje dla tych zewnątrzkomórkowych pęcherzyków. Uwalnianie OMVs przez sinice może działać jako efektywna droga sekrecji. Wykazano, że zmodyfikowany metabolicznie szczep Synechococcus sp. PCC 7002 pozbawiony dwóch genów syntazy glikogenu, glgA-I i glgA-II, uwalnia znacząco więcej OMV niż szczep typu dzikiego (Xu i in., 2013). Autorzy wysunęli hipotezę, że ponieważ u tego mutanta zaobserwowano spontaniczny eksport cukrów rozpuszczalnych do podłoża, obserwowane OMVs mogą być związane z tym mechanizmem sekrecji, mimo że nie oceniano zawartości cukrów w obserwowanych OMVs (Xu i in., 2013). Ponadto wykazano, że szczep Synechocystis sp. PCC 6803 pozbawiony homologu TolC (niezbędnego dla mechanizmów sekrecji zależnych od błony; patrz Rys. 1 i 3) również uwalnia znacząco więcej OMV niż szczep rodzicielski (Oliveira i in., 2016). Ponieważ tolC-knockout był silnie upośledzony w wydzielaniu białek wewnątrzkomórkowych, metabolitów i związków egzogennych, zaproponowano, że hipervesikulacja może zaspokoić potrzebę wydzielania. Podobnie, sugeruje się, że OMV cyjanobakterii mogą transportować materiał niezbędny do rozwoju biofilmu. Zostało to zaproponowane po zaobserwowaniu pęcherzyków pochodzących od cyjanobiontów w sporokarpach paproci wodnej Azolla microphylla (Zheng i in., 2009). Ponadto, jako że materiał genetyczny został zaobserwowany wewnątrz tych pęcherzyków, mogły one być wektorami dla bocznego transferu genów pomiędzy cyjanobiontem a paprocią (Zheng i in., 2009). Jednakże, OMVs mogą również działać jako mechanizm rozpraszania stresu otoczki cyjanobakterii: Gonçalves i wsp. scharakteryzowali zestaw szczepów Synechocystis sp. PCC 6803 pozbawionych kilku komponentów translokaz IM zaangażowanych w systemy sekrecyjne zależne od TolC (Gonçalves i wsp., 2018). Co ciekawe, wśród różnych szczepów prezentujących różne zdolności uwalniania OMVs, tolC-knockout (najwyższy producent OMV w badaniu) był jedynym wykazującym wybitnie wysoki poziom transkryptów spy i degQ, kodujących białka zaangażowane w odpowiedzi na stres otoczki, oraz nadekspresję Spy i DegP (Gonçalves i in., 2018). Autorzy zasugerowali więc, że delecja tolC wywołuje stres otoczki, a hipervesikulacja w tolC-knockout reprezentuje niezależny mechanizm radzenia sobie z takimi stresującymi warunkami (Gonçalves i in., 2018).
.