Ogólna procedura blotowania rozpoczyna się od ekstrakcji całkowitego RNA z homogenizowanej próbki tkanki lub z komórek. Eukariotyczny mRNA może być następnie wyizolowany poprzez zastosowanie chromatografii celulozowej z oligo (dT) w celu wyizolowania tylko tych RNA, które posiadają ogon poli(A). Próbki RNA są następnie rozdzielane za pomocą elektroforezy żelowej. Ponieważ żele są kruche, a sondy nie są w stanie wejść do matrycy, próbki RNA, teraz rozdzielone według rozmiaru, są przenoszone na membranę nylonową przez kapilarę lub próżniowy system blottingu.
Ustawienie kapilarnego systemu blottingu do przenoszenia RNA z żelu elektroforetycznego na membranę blottingową.
Membrana nylonowa o ładunku dodatnim jest najbardziej efektywna do stosowania w blottingu północnym, ponieważ ujemnie naładowane kwasy nukleinowe mają do nich wysokie powinowactwo. Bufor transferowy używany do blottingu zwykle zawiera formamid, ponieważ obniża on temperaturę annealingu interakcji sonda-RNA, eliminując w ten sposób potrzebę stosowania wysokich temperatur, które mogłyby spowodować degradację RNA. Po przeniesieniu RNA na membranę, jest ono unieruchamiane poprzez kowalencyjne wiązanie z membraną za pomocą światła UV lub ciepła. Po oznakowaniu sondy, jest ona hybrydyzowana do RNA na membranie. Warunki eksperymentalne, które mogą wpłynąć na wydajność i specyficzność hybrydyzacji obejmują siłę jonową, lepkość, długość dupleksu, niedopasowane pary zasad i skład zasad. Membrana jest płukana w celu zapewnienia, że sonda związała się specyficznie i aby zapobiec powstawaniu sygnałów tła. Sygnały hybrydowe są następnie wykrywane przez kliszę rentgenowską i mogą być kwantyfikowane za pomocą densytometrii. Aby utworzyć kontrole do porównania w Northern Blot, próbki nie wykazujące produktu genu zainteresowania mogą być użyte po oznaczeniu przez mikromacierze lub RT-PCR.
ŻeleEdit
RNA prowadzony na żelu agarozowym z formaldehydem w celu uwidocznienia podjednostek rybosomalnych 28S (górne pasmo) i 18S (dolne pasmo).
Próbki RNA są najczęściej rozdzielane na żelach agarozowych zawierających formaldehyd jako środek denaturujący RNA w celu ograniczenia struktury drugorzędowej. Żele mogą być barwione bromkiem etydyny (EtBr) i oglądane w świetle UV w celu obserwacji jakości i ilości RNA przed blotowaniem. Elektroforeza w żelu poliakrylamidowym z mocznikiem może być również stosowana do rozdzielania RNA, ale jest ona najczęściej używana do fragmentarycznego RNA lub mikroRNA. Drabinka RNA jest często umieszczana obok próbek na żelu elektroforetycznym w celu obserwacji wielkości uzyskanych fragmentów, ale w próbkach całkowitego RNA podjednostki rybosomalne mogą działać jako markery wielkości. Ponieważ duża podjednostka rybosomalna to 28S (około 5 kb), a mała podjednostka rybosomalna to 18S (około 2 kb), na żelu pojawiają się dwa wyraźne pasma, większe o intensywności prawie dwukrotnie większej niż mniejsze.
SondyEdit
Sondy do blottingu północnego składają się z kwasów nukleinowych o sekwencji komplementarnej do całego lub części interesującego nas RNA, mogą to być sondy DNA, RNA lub oligonukleotydy o minimum 25 zasadach komplementarnych do sekwencji docelowej. Sondy RNA (ryboproby), które są transkrybowane in vitro, są w stanie wytrzymać bardziej rygorystyczne etapy mycia, zapobiegając niektórym szumom tła. Zazwyczaj cDNA jest tworzone ze znakowanymi starterami dla interesującej nas sekwencji RNA, która ma działać jako sonda w Northern Blot. Sondy muszą być znakowane albo izotopami radioaktywnymi (32P) albo chemiluminescencją, w której fosfataza alkaliczna lub peroksydaza chrzanowa (HRP) rozkłada substraty chemiluminescencyjne powodując wykrywalną emisję światła. Znakowanie chemiluminescencyjne może zachodzić na dwa sposoby: albo sonda jest przyłączona do enzymu, albo sonda jest znakowana ligandem (np. biotyną), dla którego ligand (np. awidyna lub streptawidyna) jest przyłączony do enzymu (np. HRP). Film rentgenowski może wykrywać zarówno sygnały radioaktywne jak i chemiluminescencyjne, a wielu badaczy preferuje sygnały chemiluminescencyjne, ponieważ są one szybsze, bardziej czułe i zmniejszają zagrożenia dla zdrowia związane z etykietami radioaktywnymi. Ta sama membrana może być badana do pięciu razy bez znaczącej utraty docelowego RNA.