Jak działa chromatografia jonowymienna?

Chromatografia jonowymienna (IEX) jest techniką, która jest powszechnie stosowana w oczyszczaniu biomolekuł. Polega ona na rozdzielaniu cząsteczek na podstawie ich ładunku.

Ta technika wykorzystuje interakcję pomiędzy naładowanymi cząsteczkami w próbce i przeciwnie naładowanymi cząsteczkami w fazie stacjonarnej matrycy chromatograficznej. Ten rodzaj separacji jest trudny przy użyciu innych technik, ponieważ ładunek jest łatwo manipulowany przez pH użytego buforu.

Dwa rodzaje separacji jonowymiennej są możliwe – wymiana kationowa i wymiana anionowa. W wymianie anionowej faza stacjonarna jest naładowana dodatnio, podczas gdy w wymianie kationowej jest naładowana ujemnie.

Zasada chromatografii jonowymiennej

Chromatografia jonowymienna jest stosowana w rozdzielaniu naładowanych biomolekuł. Surowa próbka zawierająca naładowane cząsteczki jest używana jako faza ciekła. Po przejściu przez kolumnę chromatograficzną cząsteczki wiążą się z przeciwnie naładowanymi miejscami w fazie stacjonarnej.

Cząsteczki rozdzielone na podstawie ich ładunku są eluowane przy użyciu roztworu o różnej sile jonowej. Przepuszczając taki roztwór przez kolumnę, następuje wysoce selektywne rozdzielenie cząsteczek zgodnie z ich różnymi ładunkami.

Technika

Kluczowe kroki w procedurze chromatografii jonowymiennej są wymienione poniżej:

• Nieczysta próbka białka jest ładowana do kolumny chromatografii jonowymiennej przy określonym pH.
• Naładowane białka będą wiązać się z przeciwnie naładowanymi grupami funkcyjnymi w żywicy
• Do elucji rozdzielonych białek stosuje się gradient soli. Przy niskich stężeniach soli, białka posiadające niewiele naładowanych grup są eluowane, a przy wyższych stężeniach soli, białka z kilkoma naładowanymi grupami są eluowane.
• Niepożądane białka i zanieczyszczenia są usuwane przez przemywanie kolumny.

Gradient pH może być również zastosowany do elucji poszczególnych białek na podstawie ich punktu izoelektrycznego (pI) tj. punktu, w którym aminokwasy w białku posiadają neutralny ładunek i stąd nie migrują w polu elektrycznym. Ponieważ aminokwasy są zwitterowanymi związkami jonowymi, zawierają one grupy posiadające zarówno ładunki dodatnie, jak i ujemne. W zależności od pH środowiska, białka posiadają ładunek dodatni, ujemny lub zerowy. W ich punkcie izoelektrycznym nie oddziałują one z naładowanymi cząsteczkami w żywicy kolumny i dlatego są eluowane. Malejący gradient pH można zastosować do elucji białek przy użyciu żywicy anionowymiennej, a rosnący gradient pH można zastosować do elucji białek z żywic kationowymiennych. Dzieje się tak, ponieważ zwiększenie buforowego pH fazy ruchomej powoduje, że białko staje się mniej protonowane (mniej naładowane dodatnio), więc nie może utworzyć interakcji jonowej z ujemnie naładowaną żywicą, co umożliwia elucję. I odwrotnie, obniżenie pH fazy ruchomej spowoduje, że cząsteczka stanie się bardziej protonowana (mniej ujemnie naładowana), umożliwiając jej elucję.

Wybór żywicy w chromatografii jonowymiennej

Żywice jonowymienne mają dodatnio lub ujemnie naładowane grupy funkcyjne połączone kowalencyjnie ze stałą matrycą. Matryce są zwykle wykonane z celulozy, polistyrenu, agarozy i poliakrylamidu. Niektóre z czynników wpływających na wybór żywicy to wymieniacz anionowy lub kationowy, szybkość przepływu, słaby lub silny wymieniacz jonowy, wielkość cząstek żywicy i zdolność wiązania. Stabilność interesującego nas białka dyktuje wybór wymieniacza anionowego lub kationowego – każdy z tych wymieniaczy może być użyty, jeśli stabilność nie budzi zastrzeżeń.

Zastosowanie chromatografii jonowymiennej

Wymiana jonowa jest najszerzej stosowaną metodą chromatograficzną do rozdzielania i oczyszczania naładowanych biomolekuł, takich jak polipeptydy, białka, polinukleotydy i kwasy nukleinowe. Jej szerokie zastosowanie, wysoka wydajność i prostota oraz wysoka rozdzielczość są kluczowymi przyczynami jej sukcesu jako metody separacji. Chromatografia jonowymienna jest szeroko stosowana w kilku aplikacjach przemysłowych, z których niektóre są następujące:

• Separacja i oczyszczanie składników krwi, takich jak albuminy, rekombinowane czynniki wzrostu i enzymy.
• Biotechnologia – zastosowania analityczne, takie jak kontrola jakości i monitorowanie procesów
• Badania żywności i kliniczne – do badania odmian pszenicy i korelacji białkomoczu z różnymi chorobami nerek.
• Fermentacja – żywice kationowymienne są wykorzystywane do monitorowania procesu fermentacji podczas produkcji ß-galaktozydazy.

Dalsza lektura

• Wszystkie treści dotyczące chromatografii
• Przegląd chromatografii
• Chromatografia gazowa – spektrometria mas (GC-MS) Zastosowania
• Wysokosprawna chromatografia cieczowa (HPLC)
• Chromatografia cieczowa – spektrometria mas (LC-MS).Mass Spectrometry (LC-MS) Applications

Cytaty

.