Immunoelektroforeza

Agaroza jako 1% płyty żelowe o grubości około 1 mm buforowane przy wysokim pH (około 8,6) jest tradycyjnie preferowana do elektroforezy, jak również do reakcji z przeciwciałami. Agaroza została wybrana jako matryca żelowa, ponieważ ma duże pory pozwalające na swobodne przejście i rozdzielenie białek, ale zapewnia kotwicę dla immunoprecypitatów białek i specyficznych przeciwciał. Wysokie pH zostało wybrane, ponieważ przeciwciała są praktycznie nieruchome w wysokim pH. Sprzęt do elektroforezy z poziomą płytą chłodzącą był zwykle zalecany do elektroforezy.

Immunoprecypitaty mogą być widoczne w mokrym żelu agarozowym, ale są barwione barwnikami białkowymi, takimi jak Coomassie Brilliant Blue w wysuszonym żelu. W przeciwieństwie do elektroforezy w żelu SDS, elektroforeza w agarozie pozwala na zachowanie natywnych warunków, zachowując natywną strukturę i aktywność badanych białek, dlatego immunoelektroforeza pozwala na scharakteryzowanie aktywności enzymów, wiązania ligandów itp. oprócz rozdziału elektroforetycznego.

Analiza immunoelektroforetyczna ad modum Grabar jest klasyczną metodą immunoelektroforezy. Białka są rozdzielane metodą elektroforezy, następnie w rynience obok rozdzielanych białek nanoszone są przeciwciała i po okresie dyfuzji rozdzielanych białek i przeciwciał względem siebie powstają immunoprecypitaty. Wprowadzenie analizy immunoelektroforetycznej dało ogromny impuls do rozwoju chemii białek, jednymi z pierwszych wyników były badania nad rozdzielaniem białek w płynach biologicznych i ekstraktach biologicznych. Wśród ważnych obserwacji była duża liczba różnych białek w surowicy, istnienie kilku klas immunoglobulin i ich heterogeniczność elektroforetyczna.

Dehydrogenaza glutaminianowa Plazmodium (pGluDH) rozdzielona metodą immunoelektroforezy krzyżowej

Immunoelektroforeza krzyżowa nazywana jest również dwuwymiarową immunoelektroforezą ilościową ad modum Clarke i Freeman lub ad modum Laurell. W tej metodzie białka są najpierw rozdzielane podczas elektroforezy w pierwszym wymiarze, a następnie zamiast dyfuzji w kierunku przeciwciał, białka są poddawane elektroforezie w żelu zawierającym przeciwciała w drugim wymiarze. Immunoprecypitacja będzie miała miejsce podczas elektroforezy drugiego wymiaru i immunoprecypitaty mają charakterystyczny kształt dzwonu, każdy osad reprezentuje jeden antygen, pozycja osadu jest zależna od ilości białka, jak również od ilości specyficznego przeciwciała w żelu, tak więc może być przeprowadzona względna kwantyfikacja. Czułość i zdolność rozdzielcza immunoelektroforezy skrzyżowanej jest większa niż klasycznej analizy immunoelektroforetycznej i istnieje wiele odmian tej techniki, przydatnych do różnych celów. Immunoelektroforeza krzyżowa była stosowana do badań białek w płynach biologicznych, szczególnie w surowicy ludzkiej, oraz w ekstraktach biologicznych.

Immunoelektroforeza kieszeniowa jest jednowymiarową immunoelektroforezą ilościową. Metoda ta była stosowana do ilościowego oznaczania białek surowicy ludzkiej, zanim dostępne stały się metody zautomatyzowane.

Immunoelektroforeza rakietowa jest modyfikacją jednowymiarowej immunoelektroforezy ilościowej stosowaną do szczegółowego pomiaru białek we frakcjach pochodzących z eksperymentów rozdzielania białek.

Immunoelektroforeza powinowactwa opiera się na zmianach we wzorze elektroforetycznym białek w wyniku specyficznej interakcji lub tworzenia kompleksów z innymi makrocząsteczkami lub ligandami. Immunoelektroforeza powinowactwa jest stosowana do szacowania stałych wiązania, jak na przykład w przypadku lektyn, lub do charakteryzowania białek o specyficznych cechach, takich jak zawartość glikanów lub wiązanie ligandów. Niektóre warianty immunoelektroforezy powinowactwa są podobne do chromatografii powinowactwa poprzez wykorzystanie unieruchomionych ligandów.

Otwarta struktura immunoprecypitatu w żelu agarozowym pozwoli na dodatkowe wiązanie znakowanych radioaktywnie przeciwciał w celu ujawnienia specyficznych białek. Ta odmiana została wykorzystana do identyfikacji alergenów poprzez reakcję z IgE.

Dwa czynniki decydują o tym, że metody immunoelektroforetyczne nie są szeroko stosowane. Po pierwsze są one dość pracochłonne i wymagają pewnej wiedzy manualnej. Po drugie wymagają raczej dużych ilości przeciwciał poliklonalnych. Obecnie elektroforeza żelowa, po której następuje elektroblotting, jest preferowaną metodą charakteryzacji białek ze względu na łatwość obsługi, wysoką czułość i niskie zapotrzebowanie na specyficzne przeciwciała. Ponadto białka są rozdzielane w elektroforezie żelowej na podstawie ich pozornej masy cząsteczkowej, co nie jest osiągane przez immunoelektroforezę, ale mimo to metody immunoelektroforetyczne są nadal przydatne, gdy potrzebne są warunki nieredukujące.

.

Dodaj komentarz

Twój adres e-mail nie zostanie opublikowany.