Należę do Hematology Interest Group i zawsze cieszę się widząc studia przypadków i pytania, które inni technicy zamieszczają. Ta grupa jest wielonarodowa, więc widzę posty od techników z całego świata. Interesujące jest dostrzeganie podobieństw i różnic w standardowych praktykach operacyjnych oraz roli, jaką technicy odgrywają w różnych obszarach i krajach. Interesujące jest również to, że wszyscy spotykamy się z tymi samymi typami problemów i trudnych próbek! W ciągu ostatnich kilku miesięcy w tej Hematologicznej Grupie Zainteresowań widziałem wiele pytań i komentarzy dotyczących rozwiązywania problemu zlepionych płytek krwi, dlatego korzystam z tej okazji, aby rzucić trochę światła na te trudne próbki. Przypadek, który przedstawiam, a także zdjęcia, powstały dzięki uprzejmości Abu Jad Caesara, który jest kierownikiem laboratorium w Medicare Laboratories – oddział w Tulkarm, w Palestynie.
Pacjent miał wykonaną morfologię krwi na aparacie Nihon Kohden 6410. WBC wynosiło 12.7 x 103μL, liczba płytek krwi w impedancji wynosiła 20,000/μL przy pierwszym uruchomieniu, inne parametry mieściły się w granicach normy. Próbka została ogrzana i zażądano probówki z Na Cytrynianem, aby wykluczyć pseudotrombocytopenię.Po ogrzaniu, ponownie wykonano EDTA z liczbą płytek krwi 0/μL. Probówka z Na Citrate została uruchomiona, a liczba płytek krwi z instrumentu wynosiła 189,000/μL. (Rysunek 1) Ze względu na stosunek krew:antykoagulant w probówce z Na Citrate, zastosowano mnożnik 1.1, dzięki czemu liczba płytek krwi w probówce z Na Citrate wynosiła 207,900/μL. Wykonano szkiełka mikroskopowe, zabarwiono je i zbadano. Obraz 1 pokazuje zlepianie się w probówce z EDTA. Obraz 2 pokazuje rozmaz z probówki z Na Cytrynianem, bez widocznego zbrylenia.
Kontrola morfologii krwi została zgłoszona z następującymi komentarzami: zaobserwowano zlepianie się płytek krwi, pobrano 2 próbki w celu wykluczenia małopłytkowości. Rozmaz krwi pełnej z EDTA zawierał wiele grudek płytek krwi (EDTA inducedthrombocytopenia). Wnioski: Liczba płytek krwi jest odpowiednia i szacowana na około 200 000/μL.
Liczba płytek krwi w normalnym zakresie zazwyczaj nie sprawia nam zbyt wielu problemów w raportowaniu, nawet jeśli jakieś zbrylenia są obecne, głównie dlatego, że są one normalne. Adekwatne liczby płytek mieszczą się w typowym zakresie referencyjnym około 150- 450 x 103/μL.Jeśli istnieją flagi instrumentu dla płytek nienormalnych scattergram lub plateletclumps, zaleca się powtórzenie badania inną metodą. Jeśli początkowe zliczanie jest wykonywane metodą impedancyjną, wiele analizatorów może również raportować optyczną lub fluorescencyjną liczbę płytek krwi. W przypadku liczenia impedancyjnego, bardzo małe krwinki czerwone lub ich fragmenty mogą być liczone jako płytki krwi, co daje fałszywie zwiększoną liczbę płytek krwi. W przypadku zliczania optycznego, duże płytki krwi mogą być liczone jako RBC, co daje fałszywie obniżoną liczbę płytek. Niektóre analizatory hematologiczne Sysmex wykorzystują metodę impedancji i optyczną, a także fluorescencyjną metodę liczenia płytek krwi, która wykorzystuje barwnik specyficzny dla płytek krwi i umożliwia dokładne policzenie płytek krwi bez zakłóceń występujących w innych metodach. Normalna liczba płytek krwi, nawet z clumpingseen na rozmazie, jest nadal zazwyczaj szacowana jako normalna (lub może czasami być zwiększona.)
Trombocytopenia, z drugiej strony, może być wyzwaniem w laboratorium hematologicznym. W przypadku trombocytopenii lekarze potrzebują dokładnych danych, aby diagnozować, leczyć lub monitorować pacjentów. Nawet niewielki wzrost lub spadek może być znaczący w przypadku ciężkiej małopłytkowości. Przy mniejszej liczbie płytek każda płytka się liczy!
Jednym z pierwszych pytań, które musimy zadać przy pozornej małopłytkowości jest to, czy jest to prawdziwa małopłytkowość, czy też jest to pseudotrombocytopenia (PTCP). Prawdziwa trombocytopenia oznacza pacjenta z niską liczbą płytek krwi, który może wymagać monitorowania lub interwencji medycznej. Błędne rozpoznanie małopłytkowości może być niebezpieczne, ale równie niebezpieczne jest zgłoszenie niskiej liczby płytek krwi u pacjenta z fałszywą małopłytkowością, który w rzeczywistości nie ma małopłytkowości. Pseudotrombocytopenia, lub pozorna małopłytkowość, jest definiowana jako sztucznie lub błędnie niska liczba płytek krwi. W PTCP, niska liczba płytek krwi jest spowodowana zbitkami, które są liczone jako 1 płytka. (Te duże grudki mogą być również liczone jako WBC, dając w ten sposób fałszywie zwiększoną liczbę WBC).
Możemy podzielić PTCP na 2 kategorie Zlepianie się płytek krwi jest najczęściej spowodowane błędami przedanalitycznymi, takimi jak przepełnione lub niedopełnione probówki EDTA, skrzepnięte próbki lub opóźnienie czasowe pomiędzy pobraniem próbki a badaniem. Technicy powinni sprawdzić probówkę pod kątem obecności skrzepów i objętości próbki oraz przeprowadzić kontrolę delta, aby ułatwić różnicowanie małopłytkowości i PTCP. Jednak w przypadku pozornie „dobrej” próbki, następnym krokiem będzie przegląd rozmazu. Jeśli na rozmazie widoczne są grudki, musimy zdecydować, co je spowodowało. Czy jest to pierwsza kategoria, jeden z tych powszechnych problemów przedanalitycznych, czy też jest to druga kategoria PTCP, aglutynacja płytek krwi in vitro? Warunki, które mogą powodować aglutynację płytek krwi in vitro obejmują zimne aglutyniny, szpiczaka mnogiego, infekcje, przeciwciała antykardiolipinowe, wysoki poziom immunoglobulin, terapię abciximabem i pseudotrombocytopenię wywołaną EDTA. Pseudotrombocytopenia wywołana EDTA jest najczęstszą przyczyną (EDTA-PTCP). (Nakashima,2016).
Kiedy technicy mówią o problemach związanych z kępkami płytek krwi, to zwykle dlatego, że szukamy sposobów na rozwiązanie lub dokładne oszacowanie liczby płytek krwi w tych próbkach, a nie wydaje się, aby istniała jedna łatwa odpowiedź.Krzepnięcie uniemożliwia precyzyjne liczenie, a nawet szacunki mogą być bardzo trudne. Jak możemy oszacować te liczby? Czy po prostu informujemy o obecności zlepiania za pomocą słów „wydają się normalne”, „zmniejszone” lub „zwiększone”? A może powinniśmy podzielić nasze szacunki na więcej zakresów, aby dostarczyć lekarzom bardziej wartościowych informacji? A co, jeśli świadczeniodawca chce uzyskać rzeczywistą liczbę, aby zapewnić pacjentowi najlepszą możliwą opiekę, a my nie możemy rozwiązać problemu zlepiania? Co możemy zrobić, aby zapewnić liczenie? Niektóre z zalecanych pierwszych kroków obejmują wirowanie próbki przez 2 minuty w celu rozbicia zlepków płytek krwi, a następnie ponowną analizę. Ogrzanie próbki może również pomóc w usunięciu zlepków płytek krwi, szczególnie w przypadku próbek z zimnymi aglutyninami lub próbek, które zostały przetransportowane lub przechowywane w temperaturze pokojowej lub niższej. Jeśli grudki utrzymują się, a ponowne pobranie próbki nadal powoduje zlepianie się płytek, wówczas można wykluczyć błąd przedanalityczny i podejrzewać pseudotrombocytopenię wywołaną EDTA. Wiele laboratoriów zleci pobranie innej probówki lub zastosuje inną metodę, aby pomóc w rozwiązaniu problemu zlepiania się płytek.
Więc, czym jest małopłytkowość wywołana EDTA (EDTA-PTCP)? Nie jest ona reprezentatywna dla konkretnego obrazu klinicznego i nie jest diagnostyczna dla żadnego zaburzenia lub terapii lekowej, ale jest zjawiskiem laboratoryjnym spowodowanym obecnością zależnych od EDTA autoprzeciwciał IgM/IgG.Przeciwciała te wiążą się z glikoproteinami błony płytkowej w obecności EDTA. EDTAindukuje i wzmacnia to wiązanie poprzez wystawienie tych glikoprotein na działanie przeciwciał.(Geok Chin Tan, 2016) Chociaż jest to zjawisko in vitro, pacjenci z pewnymi schorzeniami, takimi jak nowotwory złośliwe, przewlekłe choroby wątroby, zakażenia, ciąża i choroby autoimmunologiczne, mają zwiększone ryzyko EDTA-PTCP. Jednak EDTA-PTCP obserwowano również u pacjentów, którzy nie chorują. (Zhang, 2018)
Jakie są niektóre alternatywne metody pomagające rozwiązać problemy związane z zlepianiem się płytek wywołanym EDTA? Prawdopodobnie najczęstszą z nich jest ponowne pobranie próbki w probówce z Na Citrate. Należy pobrać zarówno probówki z EDTA jak i z cytrynianem. W prawdziwym badaniu EDTA-PTCP, jak pokazano w naszym studium przypadku, powinieneś zobaczyć grudki na rozmazie z probówki z EDTA i żadnych grudek na rozmazie z probówki z cytrynianem Na. Ze względu na objętość antykoagulantu w probówce z Na Cytrynianem, musisz również zastosować współczynnik rozcieńczenia 1.1 do liczby z probówki z Na Cytrynianem, aby uzyskać dokładną liczbę płytek krwi. Należy jednak pamiętać, że analizatory hematologiczne są zatwierdzone przez FDA i walidowane do użytku z probówkami z EDTA. Jeśli chcesz użyć innego antykoagulantu, metoda musi być zatwierdzona w Twoim laboratorium. Należy również pamiętać, że metody alternatywne będą generalnie rozwiązywać tylko EDTA -PTCP, a nie zlepianie się spowodowane innymi zimnymi aglutyninami, lekami lub zaburzeniami. Dodatkowo, trombocytopenia wywołana antykoagulantami nie jest ograniczona do EDTA. Może ona również wystąpić w przypadku cytrynianu i heparyny. W jednym z badań stwierdzono, że do 17% pacjentów z EDTA -PTCPalso wykazywało to zjawisko z cytrynianem. W rzeczywistości badacze stwierdzili, a my stwierdziliśmy to w naszych własnych walidacjach, że niektóre próbki, które nie zlepiają się w EDTA w rzeczywistości zlepiają się w Na Citrate. Tak więc, alternatywne probówki mogą nie rozwiązać wszystkich problemów związanych z zlepianiem się płytek krwi. (Geok Chin Tan, 2016)
Niektóre laboratoria zwalidowały probówki z antykoagulantem ACD (kwas cytrynowy, cytrynian trisodowy, dekstroza) dla EDTA-PTCP. Używając tej metody, probówka z EDTA i ACD muszą być przeprowadzone równolegle i zastosowany musi być współczynnik konwersji, odzwierciedlający różnicę w rozcieńczeniu próbki w tych dwóch probówkach. W celu dokonania tego porównania należy wybrać parametr taki jak RBC. Zastosowanie wzoru, który dzieli RBC w EDTA przez RBC w ACD daje stosunek, który odzwierciedla różnice w rozcieńczeniu pomiędzy antykoagulantami. Stosunek ten można następnie pomnożyć przez liczbę płytek krwi w ACD, aby uzyskać liczbę płytek krwi skorygowaną o ACD. (CAP Today, 2014). Niektóre źródła zalecają probówki ACD, ponieważ częstość zbrylania się przy użyciu NaCitrate może być frustrująco wysoka. Uważa się, że bardziej kwaśna probówka ACD może zapobiegać zlepianiu się płytek krwi lepiej niż Na Citrate. (Manthorpe, 1981)
Mniej powszechnie używanymi rurkami są CTAD (cytrynian trisodowy, teofilina, adenozyna, dipirydamol) i heparyna. CTAD działa bezpośrednio na płytki krwi i hamuje czynnik płytkowy 4, minimalizując w ten sposób aktywację płytek. Wadą probówek CTAD jest to, że są wrażliwe na światło i muszą być przechowywane w ciemności, a także mogą być kosztowne. Zmieniają one również stosunek rozcieńczenia krwi do rozcieńczeń dodatkowych, co jest widoczne w przypadku Na Citrate i ACD. Probówki z heparyną są rzadziej uznawane za korzystne w rozwiązywaniu problemów związanych z zlepianiem się płytek krwi, ponieważ heparyna może aktywować płytki krwi. Probówki z heparyną są również droższe, więc nie były na ogół pierwszym wyborem dla EDTA-PTCP.
Słyszałem od techników, że ich laboratoria mają bardzo dobre wyniki stosując amikacynę dodawaną do probówek EDTA, aby zapobiec złośliwie niskim liczbom płytek krwi u pacjentów z EDTA-PTCP. Amikacyna powinna być dodana do probówki EDTA w ciągu 1 godziny po pobraniu, a testy są stabilne do 4 godzin w temperaturze pokojowej. Wyniki badania przeprowadzonego w 2011 roku wykazały, że dodanie amikacyny do probówki z EDTA spowodowało szybką dysocjację zlepków płytek krwi z niewielkim lub żadnym wpływem na morfologię lub wskaźniki. Metoda ta okazała się bardzo obiecująca dla uzyskania dokładnej liczby płytek krwi u pacjentów z PTCP indukowaną wieloma antykoagulantami. (Zhou, 2011)
Ostatnia probówka z antykoagulantem, którą widziałem wymienioną przez wielu techników w grupie interesującej się hematologią, to probówki Sarstedt ThromboExact. Widziałam wiele postów od techników, którzy ich używają i wydaje się, że mają bardzo dobry wskaźnik sukcesu. Probówki ThromboExact zawierają sole magnezu i są specjalnie zaprojektowane do określania liczby płytek krwi w przypadkach PTCP. Są one obecnie zatwierdzone wyłącznie do liczenia płytek krwi, a próbki są stabilne przez 12 godzin po pobraniu.Co ciekawe, przed automatycznymi analizatorami hematologicznymi, magnez był antykoagulantem z wyboru do ręcznego liczenia płytek krwi. EDTA-PTCP zostało rozpoznane od czasu wprowadzenia automatycznej metody liczenia płytek krwi EDTA w latach 70-tych. W badaniu przeprowadzonym w 2013 roku w Niemczech zastosowano probówki ThromboExact, uzyskując doskonałe wyniki w rozwiązywaniu PTCP wywołanej wieloma antykoagulantami. Probówki te stały się komercyjnie dostępne w czasie trwania badania, w 2013 roku. (Schuff-Werner, 2013) Niestety dla nas w Stanach Zjednoczonych, te rurki nie są dostępne w USA. Byłem ostatnio na konferencji i podszedłem do przedstawicieli firmy Sarstedt i zapytałem o te rurki. Powiedziano mi, że są one dostępne w niektórych częściach Europy i Azji, ale nie są zatwierdzone przez FDA w USA. Zapytałem z nadzieją, czy zamierzają uzyskać zatwierdzenie FDA i niestety powiedziano mi, że „nie sądzą, aby mieli rynek, na którym mogliby uzyskać zatwierdzenie.”
Wszelkie alternatywne metody, które wybierze laboratorium, zaleca się pobieranie EDTA i alternatywnej probówki razem. W ten sposób 2counts i obecność albo brak zbrylenia w probówkach może być porównany. Mamy wielu pacjentów, którzy mieli jeden przypadek zlepiania się, ale kiedy świadczeniodawca zleca policzenie płytek krwi z użyciem Na Cytrynianu, otrzymujemy nowe losowanie obu probówek EDTA i Na Cytrynianu razem, i nie ma żadnych znaczników ani zlepiania się w probówce EDTA. W tych przypadkach należy wykorzystać wyniki EDTA, ponieważ nie ma dowodów na istnienie EDTA-PTCP.
Gdy pacjent ma niską liczbę PLT bez stwierdzonej chorobyhematologicznej, wywiadu rodzinnego i/lub skłonności do krwawień, a błędy przedanalityczne zostały wykluczone, należy rozważyć PTCP. Nie oznacza to jednak, że pacjent z PTCP będzie miał prawidłową liczbę płytek krwi po ustąpieniu zlepiania. Jak stwierdzono powyżej, wielu pacjentów z EDTA-PTCP ma zaburzeniahematologiczne lub inne i może być naprawdę trombocytopenicznych. Wyeliminowanie zlepiania się płytek u tych pacjentów pozwala nam na podanie świadczeniodawcy dokładnej liczby płytek krwi, co jest bardzo ważne u pacjentów z małopłytkowością.
Poniższy schemat blokowy (Rycina 4) pokazuje kilka rzeczy, które należy rozważyć, gdy mamy do czynienia z zlepianiem się płytek krwi. Naszym celem jest rozwiązanie problemu zlepiania się płytek, abyśmy mogli w odpowiednim czasie podać dokładną liczbę płytek krwi. W laboratorium, w którym pracuję, zwalidowałem probówki z cytrynianem Na, ale wydaje się, że rozwiązują one problem zlepiania się płytek u mniej niż 50% pacjentów. W ostateczności, aby uzyskać dokładną liczbę płytek krwi, w niektórych artykułach sugerowano pobranie próbki z palca i wykonanie ręcznego liczenia. Uwzględniłem to w karcie jako opcję dla wielokrotnego stosowania PTCP, jednak ze względu na trudności z pobraniem próbki i subiektywność liczenia, a także problemy związane z koniecznymi obliczeniami, nasi patolodzy zdecydowali, że nie będziemy wykonywać ręcznego liczenia płytek krwi. Z tego powodu jestem obecnie zaangażowany w monitorowanie krzepnięcia płytek krwi i będę prowadził małe wewnętrzne badanie mające na celu równoległe porównanie probówek zACD, CTAD i Na Citrate. W zależności od tych wyników możemy również przetestować amikacynę. Jeśli dojdziemy do jakichś oświeconych wniosków, napiszę kolejnego krótkiego bloga z naszymi wynikami!
Podziękowania ponownie dla Abu Jad Caesara, kierownika laboratorium w Medicare Laboratories – oddział Tulkarm, w Palestynie, który dostarczył mi ten podręcznikowo doskonały przypadek PCTP, który został łatwo rozwiązany przez pobranie w Na Citrate. Życzymy wszystkim, aby czytali podręczniki i byli tak chętni do współpracy!
- CAPToday, January 2014. accessed online http://www.captodayonline/qa-column-0114
- ManthorpeR, Kofod B, et al. Pseudothrombocytopenia, In vitro studies on the underlyingmechanisms. Scand J Haematol 1981; 26:385-92
- NakashimaMO, Kottke-Marchant K. Platelet Testing: In: Kottke-Marhchant K, ed. AnAlgorithmic Approach to Hemostasis Testing, 2nd ed. CAP Press;2016:101
- Schuff-Werner,Peter, et al.Effective estimation of correct platelet counts in pseudothrombocytopenia usingan alternative anticoagulant based on magnesium salt. Brit J of Haematol Vol162, Issue 5. June 29, 2013
- Tan,Geok Chin et al. Pseudothrombocytopenia due to platelet clumping: A Case Reportand Brief Review of the Literature. Case Reports in Hematology. Tom 2016
- Lixia Zhang, MMed,* Jian Xu, MD,* LiGao, MMed, Shiyang Pan, MD, PhD. Spurious Thrombocytopenia in AutomatedPlatelet Count. Medycyna Laboratoryjna 49:2:130-133. 2018
- Zhou,Xiamian,et al. Amikacin can be added to blood to reduce the fall in platelet count. AmJournal of Clinical pathology, Vol 136, Issue 4, Oct 2011.
-Becky Socha, MS, MLS(ASCP)CM BB CM ukończyła Merrimack College w N. Andover, Massachusetts z BS w Technologii Medycznej i ukończyła MS w Clinical Laboratory Sciences na University of Massachusetts, Lowell. Pracuje jako Technolog Medyczny od ponad 30 lat. Pracowała we wszystkich obszarach laboratorium klinicznego, ale jej szczególnym zainteresowaniem cieszy się hematologia i bankowanie krwi. Kiedy nie jest zajęta byciem szalonym naukowcem, można ją znaleźć na zewnątrz jeżdżącą na rowerze.