Zbieranie izolatów Citrobacter BSI
W porównaniu z innymi gatunkami Gram-ujemnymi, które regularnie wywołują BSI, dostępne są ograniczone informacje dotyczące fizjologii C. freundii w środowisku gospodarza. W celu rozwiązania tego problemu, najpierw zebraliśmy osiem izolatów należących do kompleksu C. freundii od pacjentów z BSI z University of Michigan Health System. Filogeneza oparta na rybosomalnym RNA jest w stanie wyróżnić trzy grupy gatunków Citrobacter, z których grupa I obejmuje co najmniej osiem gatunków i zawiera C. freundii23,24. Jednakże, sekwencja 16S rRNA i metody identyfikacji oparte na spektrometrii masowej oferują ograniczoną rozdzielczość filogenetyczną w obrębie tej grupy gatunków Citrobacter. Dlatego izolaty użyte w tym badaniu były dalej oceniane przy użyciu analizy sekwencji multilocus. Spośród ośmiu zebranych izolatów, sześć grupowało się blisko ustalonych szczepów C. freundii (Rys. 1) i miało średnią identyczność nukleotydów >98% z typem szczepu ATCC 8090, co jest powyżej typowo przyjętej wartości granicznej 95% dla izolatów tego samego gatunku. Z dwóch pozostałych izolatów, UMH17 grupował się najściślej ze szczepem typu Citrobacter pasteurii CIP 55.13, a UMH18 ze szczepami Citrobacter werkmanii.
Rozkład filogenetyczny szczepów zebranych w tym badaniu. Drzewo o maksymalnym prawdopodobieństwie wygenerowano na podstawie sekwencji nukleotydowych połączonych alleli fusA, leuS, rpoB i pyrG. Czerwoną czcionką zaznaczono szczepy zebrane w tym badaniu (UMH13-19 i HM38), o ile były dostępne. Drzewo zostało ręcznie ukorzenione na węźle pomiędzy C. koserii i ośmioma gatunkami należącymi do kompleksu C. freundii. Pasek skali przedstawia substytucje nukleotydowe na miejsce.
Bakteria C. freundii
Przed zbadaniem wymagań kondycyjnych Citrobacter podczas BSI, opracowano model bakteriemii u myszy w oparciu o wcześniejsze prace z innymi gatunkami jelitowymi25. Spośród izolatów Citrobacter BSI, szczepy UMH14 i UMH15 zostały wybrane jako kandydaci do wykorzystania w tym badaniu. Izolat UMH14 wykazywał bardziej spójną, zależną od dawki kolonizację śledziony i wątroby w 24 godziny po wstrzyknięciu do żyły ogonowej (Rys. S1) i został wybrany do dalszej charakterystyki. Konieczne było również przetestowanie modelu infekcji pod kątem potencjalnych wąskich gardeł kolonizacji przed oceną udziału poszczególnych genów C. freundii w kondycji przy użyciu dużej kolekcji mutantów transpozonowych. Wyizolowano spontaniczny, oporny na kwas nalidyksowy mutant UMH14 (UMH14Nal) i stwierdzono, że ma on równoważną kondycję in vitro podczas współkultury ze szczepem macierzystym w bogatej pożywce (Rys. S2). Aby określić, czy zróżnicowana populacja mutantów może zostać ustanowiona w krwiobiegu bez stochastycznej utraty poszczególnych klonów, szczepy UMH14Nal i UMH14 zostały zmieszane w różnych proporcjach i zaszczepione myszom. Po 24 godzinach, proporcje do 1:10,000 (UMH14Nal:UMH14) były tolerowane bez spontanicznej utraty niedostatecznie reprezentowanego szczepu w śledzionie (Fig. S2), wskazując, że pojedyncza mysz może pomieścić co najmniej 10,000 unikalnych mutantów transpozonowych w całkowitej dawce 5 × 107 bakterii przy użyciu tego modelu.
Aby zidentyfikować geny fitness Citrobacter w modelu bakteriemii, wstrzyknięto myszom pięć puli losowych mutantów wstawek transpozonowych reprezentujących >44 000 unikalnych miejsc wstawek, a bakterie kolonizujące śledzionę odzyskano po 24 godzinach (ryc. S3). Względna obfitość poszczególnych mutantów transpozonowych w inokulum i wyjściach śledziony, jak określono przez sekwencjonowanie o wysokiej przepustowości, została wykorzystana do identyfikacji genów, które przyczyniają się do przeżycia bakterii w modelu. W sumie 177 genów uszkodzonych przez transpozon nadawało znaczącą utratę kondycji, a dziewięć genów było związanych ze zwiększoną kondycją bakterii, gdy zostały zmutowane (fold-change ≥2,0, Adj. P < 0,05) (Dane S1). Druga analiza z tym zestawem danych zidentyfikowała 546 chromosomalnie kodowanych putative essential genów, dla których liczba odczytów w populacji wejściowej była znacznie niższa niż oczekiwano na podstawie dostępnych miejsc TA i wielkości populacji biblioteki (logFC <-5,17) (Dane S2). Stosując ten model infekcji oportunistycznej i systemowej, przewidywano, że większość zidentyfikowanych czynników kondycji będzie reprezentować podstawowe procesy fizjologiczne, a nie prototypowe czynniki wirulencji (np. toksyny białkowe lub adhezyny). Rzeczywiście, kategoryzacja 177 genów związanych z istotnymi defektami kondycji według Clusters of Orthologous Groups (COG) odzwierciedlała przewagę szlaków metabolicznych i funkcji utrzymania komórek wymaganych podczas bakteriemii C. freundii (Rys. 2). Około połowa zidentyfikowanych genów fitness mieści się w pięciu kategoriach COG obejmujących produkcję energii, metabolizm aminokwasów, replikację i naprawę DNA, translację oraz biogenezę ściany komórkowej i błon.
Rozkład czynników fitness C. freundii według klasyfikacji COG. Sekwencje aminokwasowe bakteryjnych czynników fitness spełniających kryteria istotności analizowano pod kątem dystrybucji COG. Klasy COG, których nie pokazano, nie zawierały reprezentatywnych białek wśród 177 czynników fitness. Dwadzieścia dwa czynniki fitness nie zostały skategoryzowane tą metodą.
Weryfikacja indywidualnych mutantów genów fitness
Wkład poszczególnych produktów genowych w fitness C. freundii został potwierdzony za pomocą niezależnych mutacji delecyjno-interwencyjnych skonstruowanych w wybranych genach UMH14 (Tabela 1). Wszystkie zmodyfikowane szczepy, o których tu mowa, nie wykazywały poważnych defektów replikacyjnych, co określono na podstawie wzrostu na bogatej pożywce (Rys. S4). Dla każdego genu wymienionego w Tabeli 1, kondycja była mierzona przez współzakażanie poszczególnych mutantów szczepem rodzicielskim UMH14. Pięć z siedmiu wstępnie przebadanych mutantów wykazywało statystycznie istotne niekorzystne warunki konkurencji w śledzionie lub wątrobie (Fig. 3A), potwierdzając w ten sposób wyniki przesiewu transpozonowego. Mutant znuB został wybrany jako kontrola negatywna do walidacji w tym miejscu, ponieważ wyniki przesiewu transpozonowego wskazywały, że żaden defekt kondycji nie był związany z tym genem, pomimo dowodów z innych gatunków bakterii wykazujących udział systemu transportu cynku ZnuABC w infekcji u myszy26,27,28. W konkurencji z UMH14, mutant znuB nie wykazał znaczącego defektu kondycji, co jest zgodne z oczekiwanymi wynikami. Sąsiadujące geny znuA (fold-change = 1,5, Adj. P = 0,527) i znuC (fold-change = 2,0, Adj. P = 0,035) UMH14 również nie przyniosły żadnego defektu kondycji lub minimalny defekt, gdy zostały zmutowane przez insercję transpozonową (Dane S1).
Infekcje konkurencyjne z wybranymi mutantami C. freundii. (A) Mieszaniny (1:1) szczepu rodzicielskiego C. freundii UMH14 i pochodnych mutantów były koinokulowane myszom poprzez iniekcję do żyły ogonowej. Liczba bakterii typu dzikiego i zmutowanych obecnych po 24 godzinach została wykorzystana do obliczenia CI dla bakterii zasiedlających śledzionę (kółka) i wątrobę (kwadraty). Mutant znuB nie został przewidziany jako posiadający defekt kondycji i jest wyróżniony czarnymi symbolami. Hipotetyczny CI równy 1.0 wskazujący na brak zmian w relatywnej kondycji jest reprezentowany przez linię przerywaną. Gwiazdki wskazują mutanty, które wykazywały znaczący spadek mediany kondycji (ciągłe linie poziome) w porównaniu do wartości hipotetycznej, jak określono przez test rang Wilcoxona (n ≥ 7, P < 0.05). (B) Względna kondycja pomiędzy szczepem UMH14 typu dzikiego i uzupełnionym mutantem tatC (tatC/tatC+). Eksperymenty i analizy statystyczne przeprowadzono zgodnie z opisem dla panelu A.
Mutacja genu tatC, kodującego składnik systemu translokacji bliźniaczejargininy, spowodowała największą utratę kondycji wśród wszystkich badanych mutantów (Fig. 3). W celu określenia, czy obniżona kondycja tego mutanta może być przywrócona poprzez komplementację genetyczną, plazmid pBBR1MCS-5 zawierający otwartą ramkę odczytu tatC został wprowadzony do mutanta tatC i przetestowano względną kondycję powstałego szczepu. Mutant tatC początkowo wykazywał 67-krotny defekt kondycji w śledzionie w konkurencji ze szczepem typu dzikiego (Fig. 3A), podczas gdy uzupełniony mutant tatC wykazywał tylko 2-krotny defekt kondycji w tych samych warunkach (Fig. 3B). Podobnie, uzupełniony mutant tatC nie był znacząco mniej konkurencyjny w wątrobie w porównaniu do UMH14. Wiadomo, że macierzysty plazmid pBBR1MCS-5 jest stabilnie utrzymywany podczas infekcji przy braku selekcji29 , a hodowla in vitro mutanta C. freundii tatC z plazmidem pBBR1MCS-5 lub plazmidem uzupełniającym tatC+ nie wykazała znacznej utraty plazmidu w ciągu 24 godzin przy braku selekcji (Rys. S5). Łącznie, wyniki te zdecydowanie potwierdzają wymóg funkcji TatC podczas bakteriemii Citrobacter.
Zachowanie genów fitness wśród izolatów Citrobacter
W trakcie tego badania określono pełną sekwencję genomu każdego izolatu Citrobacter i porównano przewidywany proteom każdego szczepu z UMH14 jako odniesieniem. Z 4,666 przewidywanych produktów genowych kodowanych na chromosomie UMH14, 3,742 są konserwowane przy ≥95% identyczności pomiędzy wszystkimi izolatami C. freundii w tym badaniu (Rys. 4A). Liczba konserwowanych białek (≥95% identyczności) pomiędzy wszystkimi szczepami zmniejsza się do 2545, gdy uwzględnimy przewidywane proteomy UMH17 i UMH18, co jest zgodne z umieszczeniem tych izolatów poza gałęzią C. freundii na podstawie analizy sekwencji multilocus (Ryc. 1). Konserwacja czynników kondycji UMH14 była również wysoka, z 145 z przewidywanych 177 białek zachowanych przy ≥95% identyczności aminokwasów wśród ośmiu szczepów bakteryjnych (Ryc. 4B), w tym wszystkich siedmiu początkowych czynników kondycji, które zostały wybrane do walidacji (Tabela 1 i Ryc. 3). Usunięcie UMH17 i UMH18 z rozważań zwiększyło liczbę konserwatywnych czynników fitness do 162 (92%). Wyniki te sugerują, że strategia przeżycia Citrobacter podczas bakteriemii jest w dużej mierze zależna od konserwatywnych białek w obrębie gatunku. Co ciekawe, niewiele czynników kondycji było całkowicie unikalnych (<30% identyczności) dla UMH14 w tym podzbiorze szczepów. Jednym z wartych uwagi przykładów jest przypuszczalny operon trzech genów (CUC46_23440-CUC46_23450) z obserwowanymi defektami kondycji w zakresie od 6 do 14 razy. Wszystkie trzy otwarte ramki odczytu kodują hipotetyczne białka, a wśród nich tylko CUC46_23450 koduje konserwatywną domenę z przypisaną funkcją (cd01713, reduktaza fosfosiarczanu fosfoadenozyny).
Porównanie proteomów ośmiu izolatów Citrobacter bacteremia. (A) Przewidywane sekwencje białek ze wszystkich izolatów Citrobacter zebranych w tym badaniu zostały porównane z sekwencjami kodowanymi chromosomowo i plazmidowo (p1 i p2) szczepu referencyjnego UMH14 przy użyciu PATRIC webserver. (B) Sekwencje aminokwasowe 177 czynników fitness C. freundii zostały użyte jako odniesienie do identyfikacji homologów w innych izolatach Citrobacter. Poziom identyczności sekwencji aminokwasowej jest oznaczony kolorem. Ścieżki od zewnątrz do wewnątrz: 1, UMH14; 2, UMH13; 3, UMH15; 4, UMH16; 5, UMH19; 6, HM38; 7, UMH17; 8, UMH18.
Scieżki rekombinacji i naprawy DNA
Jednym z celów tego badania była identyfikacja konserwowanych ścieżek biologicznych, które angażowały wiele czynników fitness bakterii. Kompleksy enzymatyczne RecBCD i RuvABC, które są zaangażowane w rekombinację i naprawę DNA reprezentują taki przykład. Enzym RecBCD jest aktywny na końcach dupleksowego DNA i jest wymagany w procesach rekombinacji homologicznej i rekombinacyjnej naprawy DNA. Związany z tymi funkcjami, enzym RuvABC ułatwia migrację i rozwiązywanie rozgałęzień skrzyżowania Hollidaya30,31. Wprowadzenie transpozonu do recB, recC lub recD spowodowało 6-8-krotne obniżenie kondycji i podobnie, przerwanie zarówno ruvA jak i ruvC przez wprowadzenie transpozonu spowodowało >30-krotną utratę kondycji (Dane S1). Co ważne, defekt kondycji ruvA został potwierdzony przez infekcję konkurencyjną przeciwko szczepowi typu dzikiego przy użyciu niezależnie skonstruowanego mutanta (Fig. 3A). W obrębie dwóch kompleksów wielobiałkowych, tylko RuvB nie został zidentyfikowany jako znaczący czynnik fitness w naszym zbiorze danych. Oba kompleksy białkowe są znane z udziału w rozwiązywaniu zahamowanych lub zawalonych widełek replikacyjnych DNA, które występują podczas normalnej syntezy chromosomalnej30, choć co ważne, mutant ruvA rósł podobnie do szczepu typu dzikiego podczas szybkiej replikacji w bogatym podłożu (Rys. S4). Kuszące jest spekulowanie, że uszkodzenia bakteryjnego DNA występujące w środowisku gospodarza, potencjalnie poprzez indukowaną przez komórki odpornościowe produkcję reaktywnych form tlenu, mogą również przyczyniać się do wymagania dla tych kompleksów.
System translokacji bliźniaczejargininy
System translokacji bliźniaczejargininy funkcjonuje u Gram-ujemnych gatunków bakterii w celu wydzielania złożonych białek przez błonę cytoplazmatyczną. Rola TatC w tym konserwatywnym systemie wielobiałkowym polega na rozpoznawaniu sekwencji sygnałowych dla białek eksportowanych tą drogą. Po ustaleniu znaczącego wpływu genu tatC na kondycję in vivo C. freundii (ryc. 3), uznano, że białka wydzielane przez system Tat mogą być również wymagane dla kondycji w modelu murine. Aby zidentyfikować przypuszczalne białka wydzielane przez Tat, przeanalizowano N-końcową sekwencję każdego ze 177 czynników fitness przy użyciu oprogramowania do przewidywania TatP 1.032. Dwa geny, CUC46_16565 i CUC46_16060, zostały zidentyfikowane jako kodujące zależne od Tat peptydy sygnałowe zawierające motywy podwójnejargininy. Produkt CUC46_16565 wykazuje 94% identyczność aminokwasową z białkiem SufI E. coli, w tym 100% konserwację motywu podwójnejargininy i hydrofobowej części peptydu sygnałowego33. Zmutowano gen sufI C. freundii i oceniono kondycję w konkurencji ze szczepem macierzystym UMH14 w celu określenia, czy jakikolwiek defekt kondycji związany z utratą TatC można przypisać zaburzeniu funkcji SufI (Rys. 5A). Rzeczywiście, szczep mutanta sufI był 7-krotnie bardziej konkurencyjny w śledzionie i 17-krotnie w wątrobie w porównaniu do szczepu typu dzikiego. Jednakże, ponieważ koszt fitness mutacji tatC wahał się od 67-krotnego do 112-krotnego w konkurencji z bakteriami typu dzikiego (Fig. 3), stosunkowo niski koszt fitnessowy mutacji sufI sugerował, że dodatkowe substraty zależne od Tat mogą również przyczyniać się do fitnessu. Próby ustanowienia zależnego od Tata wydzielania SufI w C. freundii nie powiodły się z powodu widocznych problemów z toksycznością związanych z ekspresją C-końcowej konstrukcji SufI znakowanej epitopem FLAG, szczególnie w szczepie mutanta tatC (dane nie pokazane). Jednakże, SufI był używany jako modelowe białko wydzielane przez Tat w licznych badaniach charakteryzujących system Tat E. coli.
Uszkodzenia sprawności putatywnych mutantów białek wydzielanych przez Tat i zaangażowanie systemu Tat w ruchliwość C. freundii. (A) Mieszaniny (1:1) szczepu rodzicielskiego C. freundii UMH14 i mutantów sufI lub pepP użyto do koinokulacji myszy poprzez wstrzyknięcie do żyły ogonowej. Liczba bakterii typu dzikiego i zmutowanych obecnych po 24 godzinach została wykorzystana do obliczenia CI dla bakterii zasiedlających śledzionę (kółka) i wątrobę (kwadraty). Hipotetyczne CI równe 1,0 wskazujące na brak zmian we względnej kondycji jest reprezentowane przez linię przerywaną. Gwiazdki wskazują mutanty, które wykazywały statystycznie istotne obniżenie mediany kondycji (ciągłe linie poziome) w porównaniu do wartości hipotetycznej, jak określono w teście rang Wilcoxona (n ≥ 8, P < 0,05). (B) Ilościowa ocena ruchliwości pływackiej dla szczepów typu dzikiego, mutanta tatC i uzupełnionego mutanta tatC (tatC/tatC+). Bakterie inokulowano na podłoże LB z 0,3% agarem, a ruchliwość pływaków oceniano ilościowo mierząc średnicę strefy wzrostu po inkubacji w 37 °C przez 16 godzin. Słupki przedstawiają średnią z trzech płytek ± odchylenie standardowe. Mutant tatC wykazywał znacząco mniejszą ruchliwość niż szczepy typu dzikiego i uzupełnione mutanty za pomocą testu t (gwiazdki, P < 0,001). (C) Reprezentatywne płytki agarowe wykazujące ruchliwość pływacką.
Drugim zidentyfikowanym potencjalnym czynnikiem fitness wydzielanym przez Tat, kodowanym przez CUC496_16060, jest przewidywana aminopeptydaza prolinowa (PRK10879) należąca do nadrodziny PepP. Zmutowany szczep pozbawiony genu pepP był ok. 3-krotnie bardziej konkurencyjny w śledzionie i ok. 2-krotnie w wątrobie, ale obserwowane upośledzenie kondycji w porównaniu do typu dzikiego nie było statystycznie istotne (Ryc. 5A). Niemniej jednak, subkomórkowa lokalizacja PepP została określona przy użyciu C-końcowej pochodnej znakowanej epitopem FLAG przeniesionej na plazmid o wielu kopiach (PepPFLAG). Nieoczekiwanie niski poziom PepPFLAG wykryto w mutancie tatC w porównaniu do UMH14; jednakże białko fuzyjne PepPFLAG znajdowało się głównie we frakcji cytoplazmatycznej obu badanych szczepów (Rys. S6) i nie uzyskano dowodów na zależną od Tat lokalizację subkomórkową białka PepP. Wraz z wynikami infekcji konkurencyjnej mutanta sufI, dane te dalej wspierają koncepcję, że dodatkowe czynniki fitness zależne od Tat są obecne w C. freundii lub że skumulowana utrata translokacji białka przez system Tat przewyższa utratę funkcji dla pojedynczego substratu.
Jednym z dominujących fenotypów związanych z utratą funkcji mutantów tat u różnych gatunków jest upośledzenie ruchliwości34,35,36,37. C. freundii jest bakterią posiadającą flagellę, zdolną do pływania w miękkiej matrycy agarowej. Mutant C. freundii tatC wykazywał około 2-krotne zmniejszenie ruchliwości pływackiej w porównaniu do szczepu typu dzikiego, a ruchliwość pływacka została w pełni przywrócona przez komplementację genetyczną w trans (Fig. 5B,C). Wyniki te wyraźnie wskazują na defekt ruchliwości przy braku funkcji TatC; jednakże, ponieważ pływanie na niskim poziomie było nadal obserwowane u mutanta tatC, niektóre funkcje flagellarne są prawdopodobnie zachowane. Z wyjątkiem fliQ, ogólny brak genów związanych z flagą, zidentyfikowanych podczas bakteriemii sugeruje, że znaczenie tatC dla kondycji C. freundii może być w dużej mierze niezależne od dysfunkcji flagi obserwowanej w tym szczepie.
Scieżki metaboliczne
Jak zauważono wcześniej, znaczna część zidentyfikowanych genów kondycji Citrobacter została przewidziana do funkcjonowania w ścieżkach metabolicznych (Rys. 2). Trzy różne geny reprezentujące składniki centralnego metabolizmu węgla (pfkA), metabolizmu fruktozy i mannozy (mtlD) oraz biosyntezy aminokwasów (cysE) zostały wybrane do dalszych badań. Bakteryjna biosynteza cysteiny zachodzi z L-seryny poprzez pośredni etap O-acetylo-L-seryny (OAS). Ten pierwszy krok w modelowej ścieżce E. coli jest katalizowany przez enzym CysE O-acetylotransferazę, a utrata cysE skutkuje auksotrofią cysteiny38,39. Mutant C. freundii cysE jest również niezdolny do replikacji w zdefiniowanym podłożu pozbawionym cysteiny (Rys. 6A), ale może osiągnąć gęstość zbliżoną do typowej, gdy podłoże było uzupełnione albo OAS (Rys. 6B) albo cysteiną (Rys. 6C). Genetyczna komplementacja mutacji cysE spowodowała częściowe przywrócenie wzrostu przy braku cysteiny. Co ciekawe, całkowity brak wzrostu bakterii zmutowanych cysE przy braku OAS lub cysteiny w warunkach in vitro kontrastuje z częściowym defektem kondycji obserwowanym podczas infekcji (Rys. 3A). Sugeruje to, że Citrobacter może być w stanie uzyskać te metabolity ze środowiska krwiobiegu, jednak nadal istnieje koszt kondycji związany z zaburzeniem szlaku biosyntezy.
Wzrost mutantów metabolicznych C. freundii w określonym podłożu. Dziki (WT) szczep C. freundii UMH14, mutanty niosące plazmidy kontrolne wektora i mutanty komplementarne hodowano w pożywce M9. Wzrost bakterii był mierzony przez gęstość optyczną (600 nm) w 15-minutowych odstępach, a każdy punkt reprezentował średnią z trzech hodowli ± odchylenie standardowe. Dodatki dodawano do podstawowego roztworu soli M9 w następujący sposób: (A) 22 mM glukozy; (B) 22 mM glukozy i 10 mM OAS; (C) 22 mM glukozy i 1 mM cysteiny; (D) 22 mM glukozy; (E) 22 mM mannitolu; (F) 22 mM glukozy.
W ramach naszych badań nad metabolizmem Citrobacter związanym z gospodarzem, zbadano zdolność tej bakterii do wykorzystania różnych źródeł węgla. Enzym fosfofruktokinaza PfkA innych gatunków jelitowych został obszernie scharakteryzowany i reprezentuje pierwszy zaangażowany krok w glikolizie, katalizując fosforylację fruktozo-6-fosforanu do fruktozo-1,6-bisfosforanu. W przypadku UMH14, mutacja pfkA wyeliminowała zdolność tego szczepu do replikacji na glukozie jako jedynym źródle węgla (Rys. 6D), co można było częściowo przywrócić poprzez dostarczenie pfkA na plazmidzie wielokopijnym. Ta całkowita utrata utylizacji glukozy in vitro korelowała z dwukrotnym spadkiem kondycji podczas bakteriemii (Rys. 3A). Ponieważ glukoza jest obfitym źródłem węgla w surowicy ssaków40, wyniki te są zgodne z rolą, jaką Citrobacter odgrywa w wykorzystaniu glukozy podczas infekcji, ale również sugerują, że repertuar metaboliczny Citrobacter może ułatwiać wykorzystanie alternatywnych źródeł węgla i energii.
Druga aktywność enzymatyczna angażująca fruktozo-6-fosforan została również zbadana pod kątem udziału w bakteriemii Citrobacter. Białko mannitol-1-fosforan-5-dehydrogenaza, MtlD, ułatwia dwukierunkową konwersję mannitol-1-fosforanu i fruktozo-6-fosforanu przy użyciu NAD+ lub NADH jako kofaktora41,42. Wiele gatunków bakterii jelitowych może wykorzystywać alkohol cukrowy mannitol jako jedyne źródło węgla po transporcie przez system fosfotransferaz zależnych od heksitolu fosfoenolopirogronianu, co prowadzi do wewnątrzkomórkowego gromadzenia się mannitol-1-fosforanu43,44. Jednym z możliwych przeznaczeń mannitol-1-fosforanu jest zależne od MtlD utlenianie do fruktozo-6-fosforanu, a następnie skierowanie go do szlaku glikolitycznego. Mutant C. freundii mtlD wykazywał pięciokrotny spadek kondycji w wątrobie myszy (Rys. 3A) i ta obserwacja skłoniła do przeprowadzenia eksperymentów w celu określenia, czy C. freundii jest zdolny do tego typu metabolizmu in vitro. Szczepy UMH14 i pochodne mtlD hodowano w podłożu zdefiniowanym zawierającym mannitol, a uzyskane krzywe wzrostu wykazały, że bakterie typu dzikiego i mutant komplementarny były zdolne do proliferacji w tych warunkach, podczas gdy szczep mtlD nie był w stanie (Fig. 6E). Jak oczekiwano, mutant mtlD był w stanie replikować do poziomu zbliżonego do dzikiego, gdy dostarczono mu glukozę jako źródło węgla w warunkach tlenowych (Fig. 6F). Razem te wyniki ustalają zarówno zdolność C. freundii do wykorzystania mannitolu jako jedynego źródła węgla, jak i wymóg dla mtlD w tym procesie.
Wspólne strategie fitness między patogenami w środowisku krwiobiegu
Wcześniej oceniliśmy wymagania fitness innego oportunistycznego patogenu, S. marcescens, używając podobnego modelu bakteriemii u myszy. Wyniki badania S. marcescens obejmowały identyfikację 212 genów fitness przy użyciu technik podobnych do obecnej pracy45. W celu określenia, czy te gatunki mają wspólne ścieżki dla zachowania kondycji podczas BSI, najpierw porównano przewidywane proteomy obu gatunków. Białka uznano za homologiczne między C. freundii i S. marcescens, jeśli miały ≥70% identyczności aminokwasów na ≥50% sekwencji. W sumie, 42 homologiczne białka zostały zidentyfikowane jako znaczące czynniki kondycji u obu organizmów (Tabela S1), z wieloma różnymi funkcjami reprezentowanymi na tej liście wspólnych czynników kondycji. Warto zauważyć, że białko RuvA, którego utrata powodowała >10-krotny spadek kondycji C. freundii przez infekcję konkurencyjną (Fig. 3A), zostało zidentyfikowane razem z RuvC jako czynniki kondycji u S. marcescens. Wyniki te dodatkowo wspierają hipotezę, że rozwiązywanie kompleksów złącza Hollidaya, potencjalnie podczas rekombinacyjnej naprawy uszkodzeń DNA, jest ważne dla kondycji in vivo tych organizmów. Enzym fosfofruktokinaza PfkA został również zidentyfikowany jako czynnik fitness u obu gatunków. Jak zaobserwowano w przypadku Citrobacter, pfkA S. marcescens jest wymagana do wykorzystania glukozy jako jedynego źródła węgla, a ponadto była wymagana do optymalnej replikacji bakterii w inaktywowanej termicznie surowicy ludzkiej45. U obu organizmów, pfkA przyczynia się do wzrostu kondycji w śledzionie, jak oceniono w przesiewie transpozonowym, chociaż, co ciekawe, mutant S. marcescens pfkA wykazywał również około 9-krotnie zmniejszoną kondycję w nerce w wyniku infekcji konkurencyjnej ze szczepem typu dzikiego. W trakcie tej pracy zaobserwowano, że szczep C. freundii UMH14 typu dzikiego wykazywał stosunkowo słabą kolonizację nerek w modelu BSI, ale wykazano, że gen pfkA Proteus mirabilis przyczynia się do poprawy kondycji w nerkach w następstwie zakażenia dróg moczowych46. Łącznie wyniki te pokazują, że możliwa jest identyfikacja konserwatywnych strategii kondycyjnych u różnych organizmów w określonym środowisku. Konieczne będą dalsze prace w celu ustalenia, czy te produkty genowe są również wymagane u innych organizmów powodujących BSI i czy te konserwatywne ścieżki kondycji mogą być wykorzystane.
.