Choroba Albersa-Schönberga (autosomalnie dominująca osteopetroza, typ II) wynika z mutacji w genie kanału chlorkowego ClCN7

Abstract

Choroba Albersa-Schönberga, lub autosomalnie dominująca osteopetroza typu II (ADO II), jest najczęstszą postacią osteopetrozy, grupy schorzeń charakteryzujących się zwiększoną masą szkieletu z powodu upośledzonej resorpcji kości i chrząstek. Po przypisaniu genu wywołującego ADO II do chromosomu 16p13.3, obecnie donosimy o siedmiu różnych mutacjach w genie kodującym kanał chlorkowy ClCN7 we wszystkich 12 analizowanych rodzinach ADO II. Dodatkowo zidentyfikowano pacjenta z ciężką, autosomalną recesywną, niemowlęcą postacią osteopetrozy (ARO) jako homozygotycznego dla mutacji ClCN7. Z korelacji genotyp-fenotyp wynika, że ADO II odzwierciedla dominujący efekt negatywny, podczas gdy mutacje typu loss-of-function w ClCN7 nie powodują zaburzeń u osób heterozygotycznych. Ponieważ niektórzy pacjenci z ARO mają mutacje w obu kopiach genu ClCN7, ADO II jest alleliczne z podzbiorem przypadków ARO.

Received October 2, 2001; Revised and Accepted October 11, 2001.

WPROWADZENIE

W zdrowiu przebudowa tkanki kostnej wynika ze zrównoważonych procesów tworzenia i resorpcji kości. Nadmierna resorpcja powoduje osteoporozę, która odpowiada za większość złamań nieurazowych (1). I odwrotnie, wadliwa resorpcja kości powoduje osteopetrozę charakteryzującą się gęstymi, ale zazwyczaj kruchymi kośćmi. U ludzi opisano co najmniej osiem typów osteopetrozy (2). Niedobór izoenzymu anhydrazy węglowej II powoduje autosomalną recesywną osteopetrozę (ARO) z kwasicą cewek nerkowych i zwapnieniami mózgu (3; MIM 259730), podczas gdy większość przypadków złośliwej ARO (4; MIM 259700) odzwierciedla mutacje w genie TCIRG1 (5,6). Niektóre rzadkie przypadki osteopetrozy, najwyraźniej o autosomalnym recesywnym sposobie dziedziczenia, charakteryzują się łagodniejszym fenotypem i dlatego nazywane są formą „pośrednią” (7,8; MIM 259710).

Autosomalna dominująca osteopetroza (ADO) jest znacznie częstsza niż jej recesywne odpowiedniki (9). Jednak ze względu na stosunkowo łagodny obraz kliniczny, u wielu pacjentów przebiegający bezobjawowo i wykrywany jedynie na podstawie przypadkowego badania radiologicznego, częstość występowania ADO jest niedoszacowana. Wśród rodzin, w których występuje ADO, wyróżnia się dwa podtypy, głównie na podstawie cech radiograficznych (10,11). Typ I (ADOI) charakteryzuje się uogólnioną, rozproszoną osteosklerozą obejmującą przede wszystkim sklepienie czaszki (11). Typ II (ADO II; MIM 166600), postać pierwotnie opisana w 1904 roku przez Albersa-Schönberga (12), jest najczęstszą postacią z szacowaną częstością występowania do 5,5/100 000 (13). Objawy kliniczne obejmują nieurazowe złamania, zwłaszcza kości długich, porażenia nerwów czaszkowych, chorobę zwyrodnieniową stawu biodrowego i zapalenie kości żuchwy (14). ADO II objawia się radiologicznie segmentarną osteosklerozą, głównie na płytach końcowych kręgów (objaw „rugger jersey spine”), skrzydłach kości biodrowych (objaw „bone within bone”) i podstawie czaszki (9) (ryc. 1).

Niedawno poszukiwania obejmujące cały genom doprowadziły nas do przypisania genu leżącego u podłoża ADO II do chromosomu 16p13.3 (15). Co ciekawe, gen kodujący kanał chlorkowy ClCN7 rezyduje w obrębie regionu kandydackiego o długości 8,4 cM (16). W rzeczywistości, kanał chlorkowy jest niezbędny do zakwaszania zewnątrzkomórkowej luki resorpcyjnej koniecznej do degradacji tkanki kostnej przez osteoklasty (17) i jest zmutowany u jednego pacjenta z ARO (17). Dlatego uznaliśmy ClCN7 zarówno za pozycyjny, jak i funkcjonalny gen kandydujący do wywołania choroby Albersa-Schönberga.

WYNIKI

Analiza mutacji w rodzinach ADO II

Ponieważ sekwencja genomowa obejmująca gen ClCN7 jest dostępna w sekwencyjnych bazach danych (GenBank accession nos AL031600 i AL031705), analiza mutacji eksonów i granic intron-ekson jest możliwa przy użyciu genomowego DNA. Analiza ta ujawniła siedem charakterystycznych mutacji w ClCN7 (ryc. 2) w 12 niespokrewnionych rodzinach ADO II (tab. 1). Pięć mutacji to mutacje typu missense, jedna skutkuje delecją jednego aminokwasu, a jedna usuwa dwa nukleotydy, powodując przesunięcie ramki wpływające na C-końcowy koniec białka. Żadna z tych mutacji nie została znaleziona w 100 chromosomach kontrolnych.

Cztery mutacje są mutacjami redundantnymi. Mutacja 2423delAG została zidentyfikowana w rodzinie z Francji oraz w rodzinie amerykańskiej. Mutacja G215R wystąpiła w rodzinie francuskiej, duńskiej i amerykańskiej. Mutację P249L stwierdzono w rodzinie francuskiej i niemieckiej. Wreszcie mutacja R767W została zidentyfikowana w rodzinie francuskiej i amerykańskiej (tab. 1). Różne pochodzenie geograficzne badanych rodzin, jak również analiza markerów mikrosatelitarnych flankujących gen ClCN7 (dane nie pokazane) wskazują, że są to mutacje niezależne, tzn. nie dziedziczone od wspólnego przodka.

Analiza mutacji u pacjentki z ARO

Analiza połączeń z markerami z chromosomu 16p13.3 wyraźnie wykazała homozygotyczność dla wszystkich markerów u pacjentki z ARO urodzonej z pokrewieństwa zdrowych rodziców (dane nie pokazane). W związku z tym przeprowadzono analizę mutacji ClCN7, wykazując homozygotyczną mutację typu missense w pozycji 766 (L766P) (ryc. 2). Oboje rodzice są heterozygotyczni dla tej mutacji.

Położenie i konserwacja zmutowanych aminokwasów

Topologia transmembranowa zaproponowana dla kanałów chlorkowych ClC sugeruje 10-12 domen transmembranowych (18). Pięć aminokwasów zaangażowanych w mutacje missense ADO II, jak również mutacja implikowana u pacjenta z ARO, są wszystkie wysoce konserwowane wśród różnych członków rodziny genów kanałów chlorkowych ClC (Rys. 3). Mutacje G215R i P249L są mutacjami powtarzającymi się, występującymi odpowiednio u pacjentów z trzech i dwóch niespokrewnionych rodzin (Tabela 1). G215 jest wysoce konserwowaną resztą zlokalizowaną pomiędzy D2 i D3 (Ryc. 4), w regionie, o którym wiadomo, że wpływa na właściwości porów kanałów (19), podczas gdy P249 bierze udział w wysoce konserwowanym, strukturalnym elemencie tworzącym znaczną część porów kanałów ClC (20). R286 zlokalizowany jest w przestrzeni zewnątrzkomórkowej, tuż za domeną transmembranową D5. Ten aminokwas jest konserwowany wśród różnych białek ClC, z wyjątkiem ClC1 i ClC2, które mają rozbieżną sekwencję w tym regionie białka. Dwie pozostałe mutacje ADO II oraz mutacja ARO znajdują się w cytozolowej, C-końcowej części białka, obejmując sąsiadujące aminokwasy. G765, L766 i R767 zlokalizowane są w obrębie odcinka D13, który pokrywa się z drugą domeną CBS (cystathionine-β-synthase) opisaną w białku CLCN7 (21). Wszystkie trzy mutacje lokalizują się w obrębie pasma β2 domeny CBS, w której mutacje są przyczyną chorób u ludzi (22). Dokładna funkcja tej domeny jest nadal niejasna, ale zasugerowano rolę w sortowaniu białek (21).

Wreszcie, dwie małe delecje dotyczą aminokwasów z wewnątrzkomórkowej C-końcowej części ClCN7. Aminokwas L688, usunięty u jednego pacjenta, znajduje się między dwiema domenami CBS, podczas gdy delecja dwóch nukleotydów rozpoczynających się w pozycji nukleotydowej 2423 powoduje, w dwóch niespokrewnionych rodzinach, białko, które różni się od dzikiego typu ClCN7 tylko w ostatnich 10 aminokwasach.

DISCUSSION

Osteopetrozy u ssaków obejmują heterogenną grupę schorzeń, w tym co najmniej osiem różnych jednostek klinicznych u ludzi (2) i około dziewięciu spontanicznych mutacji zwierzęcych (23). Co więcej, mysie modele knockout dla kilku genów powodują fenotypy osteopetrotyczne, ilustrując różnorodność czynników zaangażowanych w różnicowanie i aktywację osteoklastów (23).

Ostatnio heterogenność ludzkich osteopetroz została podkreślona przez genetyczną heterogenność nawet w obrębie podtypu ADO II (24,25). Odkrycie to oparte było na badaniu powiązań obejmującym rozszerzoną duńską rodzinę, które przypisało gen ADO II do chromosomu 1p21 (26). Przypisanie to nie zostało jednak potwierdzone w badaniach innych rodzin ADO II. W rzeczywistości, w naszym ostatnim badaniu powiązań, obejmującym sześć rodzin ADO II, zlokalizowaliśmy gen wywołujący chorobę na chromosomie 16p13.3 i znaleźliśmy w tej samej duńskiej rodzinie cosegregację między ADO II i haplotypem chromosomu 16p13.3 (15). Dlatego spekulowaliśmy, że dowody na powiązanie z chromosomem 1p21 w tej rodzinie odzwierciedlały przypadkową cosegregację. W obecnym badaniu potwierdziliśmy tę hipotezę poprzez zidentyfikowanie mutacji powodującej chorobę (G215R) w genie ClCN7 w tej duńskiej rodzinie. To, oraz fakt, że mutacje w tym genie zostały znalezione we wszystkich 12 analizowanych rodzinach ADO II, sugeruje, że ADO II jest genetycznie jednorodna.

Nasze wyniki ilustrują również, że ADO II jest alleliczne z podgrupą pacjentów z ciężką, autosomalną recesywną, niemowlęcą formą osteopetrozy. Poprzednio jeden pacjent z ARO został opisany jako heterozygota złożona dla mutacji nonsensownej (Q555X) i mutacji missense (R762Q) w genie ClCN7 (17). Obecnie znajdujemy homozygotyczną mutację (L766P) u innego pacjenta z ARO.

Rycina 5 ilustruje naszą korelację między różnymi genotypami i fenotypami. Jak wykazano w fenotypie myszy z nokautem ClC-7, całkowita utrata funkcji kanału chlorkowego ClC-7 powoduje ciężką osteopetrozę obserwowaną u pacjentów z ARO. Ponieważ mutacje ClCN7 zostały scharakteryzowane tylko u dwóch pacjentów z ARO, nie jest możliwe stwierdzenie, czy jakiekolwiek różnice fenotypowe odzwierciedlają charakter ich mutacji. Niektóre rzadkie przypadki osteopetrozy mają postać „pośrednią”. W tych przypadkach proponowany jest autosomalny recesywny sposób dziedziczenia, ale fenotyp jest łagodniejszy niż w ARO (7,8). Być może przypadki te wynikają z kombinacji dwóch mutacji w ClCN7, z których każda tylko łagodnie zmniejsza zdolność do przewodzenia Cl-.

Opisane tu mutacje ADO II to przede wszystkim mutacje typu missense obejmujące konserwowane aminokwasy (ryc. 3 i 4). Dwie pozostałe mutacje są małymi delecjami, które również zachowują główną anatomię kanału chlorkowego, a zatem najprawdopodobniej powodują efekty porównywalne z mutacjami typu missense. Ponieważ kanały chlorkowe wydają się być zorganizowane jako multimery, prawdopodobnie dimery (27), mutacje te prawdopodobnie upośledzają ich funkcję z powodu dominujących efektów negatywnych. Przy takich efektach większość kanałów chlorkowych nie będzie funkcjonować, tłumacząc nieprawidłowości fenotypowe.

Ogólnie rzecz biorąc, rodzice pacjentów z ARO są fenotypowo normalni. Zakładamy, że odzwierciedla to fakt, że haploinsufficiency dla tego genu najprawdopodobniej nie powoduje powikłań klinicznych lub wyników radiograficznych. Alternatywnie, w niektórych przypadkach może to wynikać z obniżonej penetracji ADO II. Rodzice pacjenta z ARO przedstawionego w tym badaniu nie mają żadnych objawów klinicznych ADO II, ale badanie radiograficzne nie było dostępne.

Alleliczny charakter ADO II i ARO jest poparty doniesieniem o rozszerzonej rodzinie segregującej ADO II, w której jeden osobnik manifestował ARO (28). Być może w tej rodzinie zmutowany gen ClCN7 o dominującym efekcie ujemnym powoduje ADO II, które następnie zbiega się z mutacją de novo lub mutacją odziedziczoną od drugiego rodzica powodującą ARO. Proponowane wyjaśnienie zarówno dominujących, jak i recesywnych form osteopetrozy związanych z mutacjami ClCN7 jest analogiczne do mutacji w genie ClC-1 powodujących miotonię. Mutacje powodujące utratę ClC-1 powodują autosomalną, recesywną formę (typ Becker) (29), podczas gdy mutacje missense manifestują się mniej ciężką, autosomalną dominującą formą (typ Thomsen) (30).

Podsumowując, pokazujemy, że większość, jeśli nie wszystkie, przypadki ADO II są spowodowane mutacjami w genie ClCN7. W oparciu o charakter mutacji ClCN7, fenotyp ADO II prawdopodobnie wynika z dominującego negatywnego efektu. Nasze wyniki potwierdzają hipotezę, że kanały chlorkowe generalnie działają jako homomultimery. Ponadto, nasze badanie ilustruje alleliczny charakter ADO II i podzbiór przypadków ARO.

MATERIAŁY I METODY

Rodziny i pacjenci

Rodziny A-F zostały wcześniej opisane, ponieważ zostały wykorzystane do zlokalizowania genu choroby Albersa-Schönberga na chromosomie 16p13.3 (15). Próbki G-L pochodzą od dotkniętych osób z rodzin z historią choroby Albersa-Schönberga, a kilka z nich zostało również opisanych (31-33) (Tabela 1).

Rodzina M mieszka w Stanach Zjednoczonych, ale ma chińskie pochodzenie. Propozycja jest dzieckiem zdrowej pary i urodziła się po pełnym okresie ciąży. Rodzice są drugimi kuzynami. ARO zostało zdiagnozowane w wieku 3 miesięcy, kiedy zgłosiła się do New York Hospital Medical Center of Queens z porażeniem Bella. Badanie radiologiczne szkieletu ujawniło ciężką osteopetrozę i kilka nie przemieszczonych złamań skośnych. U dziewczynki stwierdzono niedokrwistość, retikulocytozę, hepatosplenomegalię oraz łagodny zanik nerwu wzrokowego. Dziecko przeszło niedopasowany allogeniczny przeszczep szpiku, ale zmarło w wieku 18 miesięcy z powodu sepsy i niewydolności oddechowej.

Analiza mutacji

DNA zostało wyizolowane z krwi przy zastosowaniu standardowych procedur. Startery intronowe (Tabela 2), amplifikujące wszystkie kodujące eksony i granice intron-ekson ClCN7, zostały zaprojektowane z sekwencji genomowych (GenBank accession nos AL031600 i AL031705). 25 eksonów amplifikowano z genomowego DNA polimerazą Taq lub przy użyciu systemu PCR enhancer (Gibco BRL), przy stężeniu enhancera 1×. Dla wszystkich amplifikacji wykonano 30 cykli w temperaturze określonej w Tabeli 2.

Produkty PCR oczyszczano przy użyciu systemu oczyszczania Concert Rapid PCR (Life Technologies) i bezpośrednio sekwencjonowano przy użyciu primerów użytych do amplifikacji, stosując chemię terminatora Big-Dye (Perkin-Elmer) na automatycznym sekwenatorze ABI 3100. Amplifikacja eksonu 9 spowodowała powstanie fragmentu o zmiennej długości, ponieważ ekson ten następuje po tandemowym powtórzeniu sekwencji 50 bp o zmiennej liczbie kopii. W naszym zestawie próbek liczba kopii wahała się od czterech do siedmiu powtórzeń. Powtórzenie to również koliduje w niektórych próbkach z sekwencjonowaniem tego eksonu w kierunku do przodu.

Wszystkie eksony, w których wykryto domniemane mutacje, zostały zsekwencjonowane w 100 chromosomach kontrolnych bez znalezienia mutacji.

ACKNOWLEDGEMENTS

Dziękujemy pacjentom i rodzinom, a także klinicystom, którzy dostarczyli materiał. Badania te były wspierane przez grant (G.0404.00) z „Fonds voor Wetenschappelijk onderzoek” (FWO) dla W.V.H. Badania te były również wspierane przez granty z „Société Française de Rhumatologie” (SFR), „Fonds d’Etude et de Recherche du Corps Médical des Hôpitaux de Paris” (FERCMHP) i Shriners Hospital for Children (nr 8540).