4 grudnia odwiedziłem Klinikę dla Dzieci Specjalnych w sercu Pennsylvania Dutch country, gdzie maleńki personel opiekuje się ponad 2000 pacjentów z różnymi dziedzicznymi chorobami. W zeszłotygodniowym poście opisałem rodzinę, w której 5 z 6 dzieci ma zaburzenia napadowe, które zawierają cechy autystyczne. Badanie tego zespołu przez ostatnie 15 lat pięknie ilustruje ewolucję metod odkrywania genów, zanim sekwencjonowanie katapultowało nas w nową erę technologiczną. (Ostrzeżenie: przed nami żargon.)
PODŁĄCZENIE FENOTYPU DO GENOTYPU
Dziś, aby zidentyfikować gen stojący za niezdiagnozowanym schorzeniem u dziecka, badacze porównują sekwencje egzomu (część genomu kodująca białka) rodziców i ewentualnie rodzeństwa w celu zidentyfikowania wariantów (alleli) powodujących chorobę. Jest to szybkie.
W erze przedgenomowej badacze podążali pośrednią ścieżką, aby przejść od fenotypu do genotypu:
– Zauważając, że objawy „występują w rodzinach.”
– Stwierdzając, że choroba występuje częściej u bliźniąt jednojajowych niż u bliźniąt dwujajowych oraz u rodzeństwa pacjentów niż w populacji ogólnej.
– Identyfikując nieprawidłowe chromosomy u osób z chorobą.
– Wykorzystanie badań asocjacyjnych obejmujących cały genom (GWAS) w celu zidentyfikowania wzorców zmienności genetycznej (w zestawach pojedynczych miejsc bazowych zwanych polimorfizmami pojedynczego nukleotydu, lub SNP), które mogą wskazywać wariant powodujący chorobę.
– Zidentyfikowanie genu i stworzenie modelu mysiego do testowania leczenia.
Gdy Amisze opuścili Szwajcarię we wczesnych latach 1700, aby uciec przed prześladowaniami religijnymi i osiedlili się w Pensylwanii, przynieśli próbkę europejskiej puli genów. Rozmnażanie między sobą wzmocniło mutacje i spowodowało „biegi autozygotyczności” w ich genomach – sekcjach chromosomów, które mają te same sekwencje DNA na obu kopiach. Bieguny autozygotyczności wskazują, że dwaj krewni odziedziczyli zestawy wariantów genów od wspólnego przodka, tak jak drudzy kuzyni od pradziadka. Te allele, określane jako „identyczne przez pochodzenie” (IDB), stanowią potężne narzędzie do odkrywania genów, jeśli pojawiają się wyłącznie u osób cierpiących na tę samą chorobę.
THE AMISH CONNECTION
Chłopiec, którego spotkałem w Klinice i 4 z jego 5 rodzeństwa mają zespół dysplazji korowej-ogniskowej padaczki (CDFE). Wynika on z pojedynczej brakującej zasady DNA w genie zwanym CNTNAP2.
Jak wiele opowieści o odkrywaniu genów, odkrycie, że mutacje w CNTNAP2 leżą u podstaw różnych chorób mózgu – autyzmu, napadów drgawkowych, schizofrenii, zespołu Tourette’a i zaburzeń językowych – zaczęło się od różnych wątków. Skupmy się na związku z autyzmem.
Nawet najstarsze techniki genetyczne wykazują dziedziczny komponent autyzmu. Identyczne bliźnięta są znacznie bardziej prawdopodobne, aby zarówno go mieć niż bliźnięta braterskie; rodzeństwo dziecka z autyzmem mają ryzyko 75 razy, że z ogólnej populacji.
W 1998, International Molecular Genetic Study of Autism Consortium użyło GWAS do zidentyfikowania 6 regionów w genomie, które śledziły ludzi, którzy mają autyzm – główny pretendent był na długim ramieniu siódmego największego chromosomu, lub „7q.”
W 1999 r. naukowcy wskazali na CASPR2, rodzaj białka zwanego neureksyną, które, gdy jest nieprawidłowe, zakłóca wysyłanie impulsów nerwowych. Neureksyny łączą się z innymi białkami zwanymi neuroliginami, tworząc synapsy, które tworzą się, gdy małe dziecko zaczyna poznawać świat, konsolidując pamięć w naukę.
W 2003 roku pojawiły się doniesienia o rearanżacji chromosomów, które zaburzają gen kodujący CASPR2, CNTNAP2, u osób z zespołem Tourette’a, a w 2007 roku u osób, które mają niepełnosprawność intelektualną, opóźnienie rozwojowe, upośledzoną mowę i nadpobudliwość, ale nie zespół Tourette’a. Te różne warunki nie są zaskakujące – efekty różnią się w zależności od tego, gdzie w mózgu poziomy neureksyny są niezrównoważone.
W 2006 roku badacze z Kliniki dla Dzieci Specjalnych i Translational Genomics Research Institute dopasowali mutację w CNTNAP2 do zespołu CDFE w blisko spokrewnionych dzieciach Amiszów. Napady zaczynają się mniej więcej w wieku, w którym pojawiają się cechy autystyczne – 14 do 20 miesięcy.
Przed rozpoczęciem napadów, objawy CDFE są subtelne: niewielkie opóźnienia ruchowe, słabe głębokie odruchy ścięgniste i lekko powiększone głowy. Dzieci mają trudności z koncentracją, naśladowaniem osób i planowaniem ruchów, takich jak raczkowanie, chodzenie i poruszanie się. Napady są częste i ciężkie, a ich początek zwiastuje zanikanie umiejętności – językowych, poznawczych i społecznych. Po kilku latach napady ustają, ale intelekt pozostaje w miejscu w dzieciństwie i osoba wymaga opieki przez całe życie.
Kevin Strauss, MD, Erik Puffenberger, PhD, i Holmes Morton, MD, z Kliniki i ich koledzy użyli 100,000-SNP urządzeń mikromacierzy do analizy DNA czterech dzieci z zespołem CDFE z trzech rodzin amiszów. Znaleźli oni autozygotyczny region o długości 7,1 miliona zasad w podejrzanym obszarze na 7q. (Obecnie algorytmy szybko wykrywają autozygotyczność w sekwencjach egzomu.)
W skład 7,1 miliona baz wchodzą 83 geny, ale tylko kilka z nich miało sens. Zespół najpierw zsekwencjonował gen o nazwie CENTG3, znany z wywoływania innych zaburzeń mózgu. Ale chore dzieci nie miały w nim mutacji.
Wtedy dr Puffenberger, genetyk w zespole, znalazł skrót: zauważył jeden SNP w środku CENTG3, który był heterozygotyczny u dwojga dzieci (dwa różne warianty), a nie homozygotyczny (ten sam wariant w obu kopiach chromosomu), oznaczając koniec regionu identycznego przez potomstwo. „Zdarzenie rekombinacji w środku genu pozwoliło Ericowi pozbyć się dużej jego części, aby znaleźć mutację. To doskonały przykład na to, że 'przypadek sprzyja przygotowanemu umysłowi'” – powiedział mi dr Morton. To odkrycie skróciło region zainteresowania na 7q do 3,8 miliona zasad.
Drugi gen kandydujący, CNTNAP2, pokrywa się z regionem zainteresowania. Każdemu dziecku brakowało jednej bazy w obu kopiach chromosomu 7, a każde z rodziców miało tę samą mutację, ale tylko w jednej kopii. Są nosicielami. To było pierwsze prawo Mendla w pracy.
Zespół znalazł swój gen. Następnie szukali dalej w społeczności, i wśród 105 zdrowych Amiszów, czterech było nosicielami. Dziewięciu z 18 pacjentów, którzy mieli napady częściowe, ale bez konkretnej diagnozy, z 7 rodzin, miało zespół CDFE.
Napady były zastanawiające. „Jedna mutacja może powodować różne rodzaje napadów. Czworo dzieci w jednej rodzinie reaguje inaczej. Niektóre są bardzo upośledzone, inne nie” – powiedział dr Morton. Troje dzieci przeszło operację, aby złagodzić ataki, ale ulga nie była trwała. Jednak operacje dostarczyły próbek tkanki mózgowej, które pozwoliły badaczom lepiej opisać, co jest nie tak.
Połączenia w mózgach podatnych na napady są w rozsypce. Granice istoty szarej i białej zacierają się, a niektóre części kory mózgowej są pogrubione. Same neurony nie są do końca prawidłowe. Są zbyt okrągłe, zbyt ciasno upakowane, z powykręcanymi drzewami dendrytycznymi. Kropki na neuronach wskazują na zbyt wiele jąder z glii, komórek pomocniczych, które tworzą większość układu nerwowego. Raport z badań z 2006 roku był poetycki, opisując migdałek, siedzibę emocji, w mózgach epileptycznych jako „ekscentryczne mikroskopijne wyspy częściowo dojrzałych prekursorów neuronów w ciasnych skupiskach”, zamaskowane w gliach.
Portret amiszowego mózgu epileptycznego miał sens w świetle pracy nad białkiem neureksyny CASPR2 (co oznacza białko związane z kontaktem 2). Neurexin tworzy rusztowanie w węzłach Ranviera. Węzły to odsłonięte miejsca na aksonie pomiędzy poduszkami mieliny, materiału izolacyjnego, który w rzeczywistości jest błoną komórkową glii owiniętą wokół neuronu jak bandaż wokół palca. Impulsy nerwowe targają węzły, wysyłając wiadomości wystarczająco szybko, aby podtrzymać życie.
Białka CASPR2 w dzieciach Amiszów są oszołomione. Nie przemierzają one błon komórkowych neuronów i nie zanurzają się w cytoplazmie tak, jak powinny, w wyniku czego pobliskie kanały potasowe zawalają się. Kanały te normalnie umożliwiają jonom potasu wydostanie się z komórek nerwowych w momencie przejścia impulsu, resetując je. Zatem bez rusztowania z neureksyny neuron nie może się zresetować. Transmisja zostaje zatrzymana. I w jakiś sposób zaczynają się drgawki. Nie sądzę, że wiadomo, czy napady wywołują cechy autystyczne, czy też powstają bezpośrednio – dalsze badania genetyczne powinny to wskazać.
MODEL MYSZKI
Daniel Geschwind, MD, PhD i profesor neurologii w David Geffen School of Medicine na UCLA, pracował nad genami autyzmu i przeczytał pracę z 2006 roku w New England Journal of Medicine. „Zadzwonił i powiedział: 'znalazłeś mój gen!’. Rozpoczęła się miła współpraca, a on stworzył mysz z mutacją Amish” – powiedział dr Morton. Myszy mają znokautowany gen CNTNAP2, i podobnie jak ludzie, mają napady drgawek i cechy autystyczne.
„Mysz zwykle biega po klatce, normalnie towarzyska i gawędzi. Te myszy nie były ani jednym, ani drugim” – wyjaśnił dr Morton. Myszy również wyświetlane powtarzające się zachowania i miał seizures.
Mózgi myszy mutantów wykazały nieprawidłowy wzór łączności przypominający wcześniejszej pracy histologii. „Przednia część mózgu rozmawia głównie z samym sobą. Nie komunikuje się tak bardzo z innymi częściami mózgu i brakuje mu połączeń dalekiego zasięgu z tylną częścią mózgu” – powiedział dr Geschwind. Grupa wykazała podobne nieprawidłowości w mózgach dzieci z autyzmem.
Uderzające podobieństwo między dziećmi Amiszów a myszami stanowi poligon doświadczalny dla leków. Risperidon, przepisany do leczenia powtarzających się zachowań u dzieci, miał ten sam efekt na myszach, poprawiając jednocześnie ich zdolność budowania gniazd. Ale lek nie pomaga dzieciom socialize.
An oczywisty lek kandydat do poprawy umiejętności społecznych jest „hormon miłości” oksytocyna. Jest ona obfita w tych samych neuronach mózgu, które są bogate w białko CASPR2. Czy zbyt mała ilość oksytocyny może powodować cechy autystyczne? Wyniki uzupełniania oksytocyny są obiecujące, zarówno u myszy, jak i u dzieci.
Dr Geschwind i współpracownicy odkryli, że rozpylona do nosa oksytocyna „radykalnie poprawia deficyty społeczne” u myszy. Ponieważ nieautystyczne myszy nie zareagowały, hormon rzeczywiście wydaje się kompensować deficyt.
Amiszowi farmerzy już podają oksytocynę krowom, aby skurczyć ich mięśnie macicy, a ja przypominam sobie, że dostałem ją, aby ożywić zastój w pracy. Ale nie próbuj tego w domu. Trwa kilka badań klinicznych nad oksytocyną lub lekami, które zwiększają jej aktywność w mózgu w celu poprawy socjalizacji u dzieci z autyzmem.
Autism Speaks sfinansował pierwsze badanie kliniczne oksytocyny w 2010 roku, a NIH sponsoruje większe trwające badanie oksytocyny w sprayu do nosa. Ale o ile mogę powiedzieć, pacjenci byli zapisywani na podstawie diagnozy klinicznej zgodnie z DSM-IV – a nie bardziej specyficznego kryterium genotypu.
Ale pomysł wypróbowania oksytocyny w celu poprawy objawów społecznych w autyzmie nie wymagał znajomości mutacji leżącej u podstaw, taka informacja może dodać precyzji do wszelkich wniosków poprzez rozważenie mechanizmu – co może prowadzić do opracowania innych metod leczenia. W innym poście przyjrzę się, w jaki sposób precyzja genetyczna umożliwiła dr Mortonowi opracowanie leków na pewne wrodzone błędy metabolizmu, które są znacznie bardziej powszechne wśród Amiszów, ale nadal pojawiają się na ekranach noworodków wszystkich ludzi.
.