Synergie fonctionnelle positive de dimères de protéines artificielles structurellement intégrées assemblées par chimie Click

Sites d’interface de chimie Click

Nous avons supposé que les zones de la surface d’une protéine qui sont compatibles en termes d’association sont plus susceptibles de générer une structure intégrée par la formation d’interactions non covalentes mutuellement compatibles. Comme les protéines sont monomères, ces interactions sont, au mieux, faibles et transitoires et ne persisteront donc pas, nous avons pensé que nous avions besoin d’un « boulon » moléculaire faisant partie du site d’interface pour promouvoir et stabiliser toute nouvelle interaction. La première étape consiste à identifier les régions sur les protéines cibles qui ont le potentiel inhérent d’interagir. ClusPro 2.040 (cluspro.org) a été utilisé pour générer des configurations potentielles de dimères. Les modèles d’homodimères sfGFP obtenus ont été affinés, analysés et classés à l’aide de RosettaDock41,42 (tableau supplémentaire 1). La configuration la mieux classée est présentée à la figure 1b (qui est le modèle le plus proche de la structure déterminée ci-dessous ; voir ci-dessous), les 4 configurations suivantes étant présentées à la figure supplémentaire 1. Bien que différentes orientations d’une sfGFP par rapport à l’autre aient été observées, le docking a révélé que les résidus 145-148, 202-207 et 221-224 contribuaient systématiquement à l’interface du dimère. Pour verrouiller les deux protéines ensemble, la chimie Click bioorthogonale codée génétiquement a été utilisée (Fig. 1a). Les avantages par rapport, par exemple, aux liaisons disulfure comprennent des chaînes latérales plus longues pour surmonter les conflits stériques potentiels, une meilleure stabilité de la réticulation et la capacité de générer des hétérodimères et des non-symétriques (différents résidus de liaison sur différents monomères) d’une manière 1 pour 1 (voir infra).

Sur la base des modèles de dimères, trois résidus ont été sélectionnés pour être remplacés par les deux ncAA compatibles avec la chimie Click, SCO43 (alcyne tendu) et azF (azide)44,45 (Fig. 1a). H148 et Q204 ont été choisis en fonction de leur emplacement à l’interface du dimère putatif (Fig. 1b et Fig. 1 supplémentaire). Les deux résidus sont connus pour être facilement modifiés par des adduits cyclooctyne de petites molécules lors de l’incorporation de l’azF34,46, et se trouvent à proximité du centre fonctionnel, le chromophore (CRO) de la sfGFP (Fig. 1b). L’analyse du déplacement de mobilité du gel a révélé que la dimérisation était réussie (Fig. 1c, d) ; ceci a été confirmé par l’analyse de spectrométrie de masse (Fig. 2 supplémentaire). Le résidu 132 n’était pas prévu pour être à l’interface du dimère (Fig. 1b et Supplémentaire 1) mais il est connu pour être compatible avec une gamme d’adduits alcynes sous tension allant des colorants46 aux nanotubes de carbone35 à l’ADN simple brin36. Ainsi, il constitue un bon test de notre capacité à prédire les interfaces protéine-protéine et la compatibilité des réactions de clic. Bien que le résidu 132 soit exposé à la surface, aucun produit dimère n’a été observé en utilisant sfGFP132azF avec la protéine contenant SCO (figure supplémentaire 3), ce qui indique l’importance de la compatibilité de l’interface de surface et l’utilité de l’analyse in silico pour aider à identifier les sites compatibles avec la chimie click. Soit des heurts stériques et/ou des interactions protéine-protéine qui persistent plus longtemps dans d’autres régions peuvent entraver la réticulation covalente au niveau du résidu 132.

Commutation fonctionnelle positive sur la formation du dimère sfGFP148x2

H148 forme une liaison H avec CRO (Fig. 1b) et joue un rôle important dans la navette des protons qui régule la population de la forme neutre A (λmax ~ 400 nm, CRO A) et de la forme anionique B (λmax ~ 490 nm, CRO B)47 présentes dans l’état fondamental. La forme B prédomine dans la sfGFP, mais en incorporant azF à la place de H148 (sfGFP148azF), la suppression de la liaison H entraîne la prédominance de l’état A33,34 (Fig. 2a et Tableau 1). L’incorporation de SCO au niveau du résidu 148 (sfGFP148SCO) suscite un effet similaire, avec une prédominance de l’état CRO A mais avec un décalage rouge plus faible (λmax 492 nm) dans la forme mineure CRO B (Fig. 2a et Tableau 1).

La dimérisation de sfGFP148azF et sfGFP148SCO produit deux effets positifs significatifs : (i) l’allumage de la fluorescence à ~490 nm en raison de la promotion de la forme CRO B ; (ii) une luminosité grandement améliorée par l’augmentation du coefficient d’absorbance molaire à 490 nm (Fig. 2a et Tableau 1). Le principal pic d’excitation est décalé vers le rouge lors de la dimérisation (λmax 492 nm) par rapport à sfGFPWT (λmax 485 nm) (tableau supplémentaire 3). Le rapport d’absorbance 490:400 nm se déplace d’un ordre de grandeur de ~0,5 pour les monomères à ~5 pour le dimère, la forme CRO B dominant le spectre d’absorbance du dimère (Fig. 2a) malgré l’absence apparente d’une espèce pouvant remplacer le rôle du groupe imidazole H148. Les exemples précédents de modification de la sfGFP148azF avec des adduits de petites molécules ou la photoactivation aboutissent au mieux à une conversion partielle en forme CRO B33,34. Le changement de 10 fois de l’absorbance se reflète dans l’émission de fluorescence ; l’excitation à 490 nm entraîne une émission environ 20 fois plus élevée que celle des deux monomères (Fig. 2a). En outre, le dimère présente une fonction améliorée même par rapport au superfolder original sfGFPWT (Fig. 2b et Tableau 1). L’absorbance molaire et la luminosité ont augmenté de ~320% pour sfGFP148x2 (~160% sur une base par CRO) (Fig. 2b) plus que prévu pour une simple augmentation additive si les unités monomères agissent indépendamment les unes des autres.

Pour étudier l’importance du lien biorthogonal, nous avons construit un lien classique à base de disulfure en mutant H148 en cystéine. Les variantes sfGFPH148C se sont dimérisées mais seulement en présence de Cu2+ (figure supplémentaire 4). Les propriétés spectrales suggèrent que le dimère est moins fluorescent que le sfGFP148x2 et le sfGFPWT (figure supplémentaire 4). Le monomère sfGFPH148C présentait le passage attendu de l’état CRO B à l’état CRO A. Bien qu’un passage de l’état CRO A à l’état CRO B ait été observé lors de la dimérisation de sfGFPH148C, le dimère présentait une absorbance molaire par CRO inférieure à celle de sfGFPWT et nettement inférieure à celle de sfGFP148x2 ; une population importante de l’état A était toujours observée. L’émission de fluorescence à l’excitation à 490 nm pour le dimère sfGFPH148C était environ la moitié de celle du sfGFPWT. Ainsi, l’approche biorthogonale a généré une espèce dimérique plus performante que la liaison classique par liaison disulfure.

Base moléculaire de la commutation fonctionnelle dans sfGFP148x2

La structure cristalline de sfGFP148x2 (voir le tableau supplémentaire 2 pour les statistiques) révèle que les monomères forment une interface dimère étendue avec des interactions à longue portée reliant les deux centres CRO. Les unités monomères de la sfGFP148x2 sont disposées selon un arrangement quasi-symétrique tête-à-queue décalé de ~45° l’un par rapport à l’autre (Fig. 3a). La disposition antiparallèle des monomères côte à côte est la plus proche de celle du modèle le mieux classé (figure 1 supplémentaire et tableau 1 supplémentaire). La densité électronique de la nouvelle réticulation triazole est clairement définie (Fig. 3b) et forme la liaison anti-1,4-triazole allongée qui est partiellement enterrée et intimement associée aux deux unités monomères, formant ainsi une partie intégrante de l’interface du dimère (Fig. 3c). Les CRO sont séparés de 15 Å pointant l’un vers l’autre (Fig. 3a).

L’interface a des caractéristiques similaires aux dimères naturels48. La surface enterrée de l’interface est ~1300 Å2, avec généralement les mêmes résidus de chaque monomère contribuant (Fig. 3c, d). Les liaisons H jouent un rôle important avec les résidus E142, N146, S147, N149 et N170 des deux monomères contribuant à huit liaisons H inter-sous-unités (Fig. 3b). La structure montre que les interfaces naturelles des dimères peuvent être imitées et stabilisées par l’utilisation de monomères liés par des clics, ce que la modélisation originale suggérait comme étant faisable mais qui était probablement trop faible ou transitoire pour persister sans le lien incorporé. Ainsi, il se peut que notre approche puisse être utilisée pour stabiliser plus largement les interactions faibles et transitoires protéine-protéine formant ainsi des interfaces définies.

La dimérisation induit une série de changements conformationnels pour former un réseau d’interaction à longue portée qui sous-tend le mécanisme par lequel la sfGFP est allumée et la luminosité améliorée. La structure de sfGFP148azF (PDB 5BT0)34 montre que 148azF occupe une position similaire à H148 dans sfGFPWT mais ne peut pas de la liaison H critique au groupe OH phénolique CRO qui favorise la formation de l’état B CRO. Lors de la dimérisation, la modification de 148azF par la formation de la liaison triazole avec 148SCO dans le monomère apparenté entraîne un changement de position de son squelette et de sa chaîne latérale, provoquant un trou qui peut maintenant être occupé par une molécule d’eau dans le dimère (W1azF sur la figure 4a). L’eau peut se lier par H à CROazF et au carbonyle du squelette de 148azF (Fig. 4). Une eau équivalente est présente dans l’unité monomère sfGFP148SCO, (W1SCO) qui forme des interactions similaires. Ces molécules d’eau structurées ont le potentiel de remplacer l’interaction de la liaison H perdue lors de l’élimination de H148, activant ainsi le dimère en favorisant la formation de CRO B dans l’état fondamental. Les molécules d’eau sont également enfouies à l’interface du dimère, de sorte que l’échange dynamique avec le solvant de masse sera considérablement réduit. De plus, les deux CRO sont maintenant liés par un réseau étendu à prédominance d’eau qui s’étend sur l’interface du dimère (Fig. 4b, c). L’analyse de la composition du tunnel a révélé que trois molécules d’eau dans chaque unité (W1azF/SCO, W2azF/SCO et W3azF/SCO) sont symétriques ; W4 combiné avec le squelette de F145SCO fournit le pont à travers l’interface du dimère pour relier les deux réseaux d’eau ensemble. Ainsi, la dimérisation génère un réseau étendu de liaisons H riches en eau inter-monomères favorisant ainsi un passage de l’état A CRO à la forme B.

Analyse de la fluorescence d’une seule molécule de sfGFP148x2

La microscopie de fluorescence par réflexion interne totale (TIRF) a été utilisée pour étudier le comportement fluorescent des dimères de sfGFP148x2 au niveau d’une seule molécule. L’évolution de l’intensité de la fluorescence des dimères sfGFP148x2 a montré une gamme d’états d’intensité, avec une fluorescence à ~80-100 comptes prédominante et présentant une plus grande longévité que la sous-population d’états d’intensité plus élevée, caractérisée par de brèves incursions dans une gamme d’intensités allant de ~100 à 300 comptes (Fig. 2c). Les traces de fluorescence démontrent également une photostabilité prolongée avec de longues périodes de photoblanchiment (Fig. 2c et Fig. 5 supplémentaire). En comparaison, la sfGFPWT subit un photoblanchiment plus rapide, les traces de fluorescence montrant un état d’intensité unique dans lequel les états activés durent généralement moins longtemps (figure supplémentaire 6). En outre, on a parfois constaté que la sfGFPWT monomère existait dans un état initial sombre et non fluorescent, avant l’initiation de la fluorescence et le photoblanchiment ultérieur (figure supplémentaire 6). L’extraction du temps moyen de fluorescence consécutive avant le photoblanchiment et l’occupation d’états non fluorescents transitoires (clignotement) montre que la sfGFP148x2 présente de plus longues périodes de fluorescence continue (moyenne de 0,9 s), par rapport à la sfGFPWT (0,65 s). Étant donné la similarité de l’intensité de fluorescence mesurée de la molécule unique, l’augmentation des temps d’activation et de la durée de vie du photoblanchiment contribue probablement à l’augmentation de la fluorescence observée dans les mesures d’ensemble à l’état stable de sfGFP148x2 (Fig. 2a).

Pour tenter de rationaliser la gamme d’états de fluorescence observés dans les traces du dimère, un histogramme de toutes les intensités mesurées a été généré (Fig. 2c). Contrairement à sfGFPWT (Fig. 6 supplémentaire) qui montre une distribution log-normale unique49, sfGFP148x2 a favorisé un ajustement à deux composantes50 (Fig. 2c). La distribution d’intensité mesurée montre un pic prédominant de faible intensité (~90 comptes) et un pic d’intensité plus élevée qui se chevauche partiellement, en conséquence des brèves incursions vers des états d’intensité plus élevée observés dans les traces de fluorescence de la molécule unique. Alors que l’on pourrait normalement s’attendre à une distribution bimodale de l’intensité dans un dimère composé de deux fluorophores actifs indépendamment et situés au même endroit, chaque fluorophore subissant séquentiellement le photoblanchiment, les traces temporelles de l’intensité de la molécule unique ne correspondent pas à ce modèle et montrent l’absence de deux états bien définis. Le comportement simple de l’état marche/arrêt de la sfGFPWT est rarement observé dans les traces de dimères qui elles-mêmes ne se présentent pas comme l’adduit anticipé de deux traces monomères, montrant plutôt un comportement plus complexe.

Fonction accrue lors de la formation du dimère sfGFP204x2

Pour explorer comment différents sites de liaison peuvent susciter des affects fonctionnels, nous avons étudié le dimère alternatif sfGFP204x2 (Fig. 5a) construit ci-dessus (Fig. 1d). Nous avons constaté que la dimérisation améliorait les propriétés spectrales par rapport à la simple addition des protéines monomères ou sfGFPWT, soulignant à nouveau les avantages synergiques de la dimérisation. L’incorporation de l’azF ou du SCO au niveau du résidu 204 a eu peu d’effet sur les propriétés spectrales par rapport à la protéine sfGFPWT 46 (Fig. 5b et Tableau 1). La forme B CRO a prédominé dans les formes monomères ; l’absorbance molaire et les intensités d’émission étaient similaires entre elles et à celles de sfGFPWT. L’émission de fluorescence de sfGFP204SCO était légèrement réduite (80 % de sfGFPWT ; tableau 1). Lors de la formation du dimère sfGFP204x2 (voir la figure 1d et la figure supplémentaire 2 pour la preuve), l’analyse spectrale a montré une amélioration fonctionnelle en termes de paramètres spectraux essentiels : coefficient d’absorbance molaire (ε) et émission de fluorescence (figure 5b et tableau 1). Lors de la dimérisation, ε a augmenté jusqu’à 400 % par rapport aux monomères de départ, pour atteindre 160 000 M-1 cm-1. Cela équivaut à une absorbance molaire moyenne par CRO de 80 000 M-1 cm-1, soit presque le double de la luminosité par rapport aux monomères de départ, et 31 000 M-1 cm-1 de plus par rapport à sfGFPWT. Conformément à la capacité accrue d’absorption de la lumière, l’émission de fluorescence a également été augmentée ; l’émission normalisée par CRO était 180 % plus élevée que celle du monomère sfGFP204azF. En utilisant le calcul de Strickler-Berg51 (site Web huygens.science.uva.nl/Strickler_Berg/), les durées de vie de la fluorescence passent de 3,2 ns pour sfGFPWT à 0,92 ns pour sfGFP204x2. Ainsi, comme pour sfGFP148x2, la structure dimérique de sfGFP204x2 présente une probabilité accrue d’excitation électronique et d’émission de fluorescence par rapport aux formes monomères (voir la figure supplémentaire 8 pour la comparaison spectrale des dimères). Ceci est d’autant plus impressionnant pour les deux formes dimères que sfGFPWT est une référence en matière de performance des protéines fluorescentes vertes.

L’importance de la symétrie pour la synergie

Les homodimères protéiques naturels sont généralement symétriques1,52 et une telle symétrie a été imitée dans notre dimère artificiel par un résidu de réticulation commun. Nous avons étudié l’importance d’un résidu de réticulation commun (en tant que mimétique de la symétrie structurelle) pour la synergie fonctionnelle. L’avantage de la chimie biorthogonale est que les poignées de réaction mutuellement compatibles permettent la construction de paires définies (c’est-à-dire 148 + 204 = 148-204 et non 148-148 ou 204-204) empêchant ainsi la formation de produits indésirables qui seront difficiles à séparer.

Des dimères ont été générés qui reliaient les résidus 148 et 204 dans les deux combinaisons disponibles (148SCO+204azF et 148azF+204SOC). La fluorescence à l’état stable a révélé que dans les deux formes dimères, les formes protonées et déprotonées de CRO étaient clairement présentes (Fig. 6a, b). Le dimère lié à 148azF-204SCO a présenté un changement dans les populations relatives des formes A et B, avec une augmentation significative du coefficient d’absorbance molaire à 490 nm (Fig. 6a) ; il était presque le double du sfGFP204SCO original et ~30% plus élevé que celui prédit par la simple addition des spectres des monomères. La hauteur relative du pic de 400 nm reste similaire dans le dimère lié sfGFP148azF et 148azF-204SCO, ce qui suggère que la population de la forme déprotonée est similaire dans le dimère et dans le monomère original. La dimérisation via la combinaison 148SCO-204azF a changé les populations relatives des formes protonées et déprotonées mais la réduction du pic d’absorbance à 400 nm n’a pas été compensée par une augmentation concomitante du pic à 490 nm (Fig. 6b). En fait, la dimérisation a été largement préjudiciable car les deux pics d’absorption majeurs avaient un coefficient d’absorption molaire plus faible que les spectres de simple addition des monomères (Fig. 6b). Il est clair que les dimères liés de manière asymétrique sont moins fluorescents et contiennent une population mixte significative des deux états CRO par rapport aux dimères liés de manière symétrique donc dans ce cas, la symétrie a des implications fonctionnelles importantes.

Hétérodimères et intégration fonctionnelle

Les hétérodimères, dans lesquels un dimère est composé de deux protéines différentes, est un état de dimérisation alternatif couramment observé1,2. Il nous permet également de concevoir de nouveaux complexes dans lesquels des protéines fonctionnellement distinctes peuvent être liées. L’avantage du couplage bioorthogonal est la possibilité de générer des (hétéro)dimères définis, d’une seule espèce, composés de deux unités protéiques différentes (c’est-à-dire A + B = A-B et non pas un mélange A-A, B-B, A-B qui peut être difficile à séparer). La protéine fluorescente jaune Venus29 a été choisie comme protéine partenaire de la sfGFP, étant donné le chevauchement spectral entre les deux (figure 9 supplémentaire). Les différences de séquence sont indiquées dans la figure supplémentaire 10.

SfGFP148SCO a été combinée avec la Venus équivalente contenant azF (Venus148azF) pour générer GFVen148 (voir la figure supplémentaire 11 pour la preuve). De nouvelles caractéristiques spectrales apparaissent, suggérant qu’un système intégré a été généré. La formation de GFVen148 génère un dimère qui présente une luminosité améliorée par rapport à la sfGFP148SCO ou à Venus148azF (Fig. 7a et Tableau supplémentaire 3). Il est intéressant de noter que le dimère a des propriétés spectrales intermédiaires des monomères individuels sans aucun élargissement significatif du pic (Fig. 7a, b et Fig. 12a supplémentaire), ce qui suggère que les deux centres CRO sont devenus fonctionnellement intégrés en termes d’émission de fluorescence. Le principal λmax est de 505 nm, intermédiaire entre la sfGFP (492 nm) et Venus (517 nm). L’équivalent ε de la forme B CRO (région 490-510 nm) augmente significativement (~4-5 fois), plus que les spectres additifs simples des monomères, tandis que la population A CRO diminue mais est toujours observée (Fig. 7a). Cela correspond à une augmentation d’environ 4 fois de l’intensité d’émission lors de l’excitation à 505 nm (Fig. 7b). Un pic d’émission unique est observé qui est également intermédiaire entre les deux monomères, indépendamment de la longueur d’onde d’excitation (λEM à 517 nm ; Fig. 7b, c) ; un pic unique plutôt que double ou élargi a été observé lors de l’excitation à 490 nm (capable d’exciter les deux CRO) suggérant qu’une seule espèce est émise. Un spectre additif des spectres de monomères individuels qui simule deux protéines agissant indépendamment soutient l’idée d’une nouvelle fonction intégrée car il est plus large et décalé vers le rouge par rapport au profil d’émission mesuré du GFVen148x2 (figure supplémentaire 12b). L’émission lors de l’excitation à 400 nm a également été mesurée car Venus148azF a une faible absorbance à cette longueur d’onde par rapport à GFVen148. L’intensité de l’émission était 30 fois plus élevée pour GFVen148 par rapport à Venus148azF monomère, avec un pic d’émission à 517 nm (Fig. 7c et Fig. 12c supplémentaire). Plutôt que de présenter un FRET classique, comme on pourrait s’y attendre (voir supra), le GFVen148 semble agir comme une entité unique en termes d’émission de fluorescence. Cela pourrait suggérer que deux CROs agissent maintenant principalement comme une seule espèce, les aspects structurels observés pour sfGFP148x2 (tels que le réseau d’eau) jouant un rôle. La présence d’un état neutre A significatif de l’ORC suggère que les deux unités monomères ne sont pas entièrement synchronisées. Cependant, cela n’annule pas l’impact clair que la dimérisation peut avoir dans la génération de nouvelles propriétés spectrales telles que celles observées dans GFVen148.

Comme pour la sfGFP, l’incorporation de azF à la place de Q204 (appelée Venus204azF) a eu peu d’effet sur les propriétés spectrales de Venus (tableau supplémentaire 3). La liaison covalente via 204 SPAAC (ce qui donne GFVen204) a permis de générer un dimère (figure supplémentaire 11). GFVen204 a combiné les caractéristiques spectrales des deux monomères générant une espèce avec λMax à la fois à 490 et 514 nm (rapport de 1:1,2) (Fig. 7e, f et Tableau supplémentaire 3). Venus204 absorbe également à 490 nm mais dans un rapport de 1:2,7 par rapport à 514 nm. La formation de dimères a de nouveau augmenté l’absorbance molaire au-dessus de celle des monomères individuels ; notamment ε a augmenté de ~26 000 M-1 cm-1 (~27%) pour le λmax associé à Venus (514 nm) où il y a peu de contribution pour sfGFP. Pour étudier la communication entre les monomères, l’émission de fluorescence sur l’excitation à quatre longueurs d’onde distinctes a été surveillée : 400 nm (sfGFP uniquement) ; 450 nm (sfGFP, Venus mineur) ; 490 nm (sfGFP λmax, épaulement de Venus) ; 510 (Venus, sfGFP mineur). À toutes les longueurs d’onde d’excitation, le seul pic d’émission clair était à 528 nm (figure 7b), correspondant à Venus indiquant la communication par transfert d’énergie par résonance de Förster (FRET). Un pic d’émission corrélé à la sfGFP204SCO (~510 nm) n’a pas été observé, même lors de l’excitation aux longueurs d’onde inférieures spécifiques à la sfGFP. Le pic d’émission intermédiaire caractéristique de GFVen148 n’a pas non plus été observé, ce qui met en évidence les nouvelles caractéristiques de l’hétérodimère 148. La différence la plus significative a été observée lors de l’excitation à 400 nm où l’intensité d’émission à 528 nm est 14 fois plus élevée pour le GFVen204 que pour le Venus204azF (Fig. 7f, encart). L’efficacité FRET relative calculée après décomposition spectrale était d’environ 90 %. Ainsi, les deux centres fonctionnels communiquent par transfert d’énergie (Fig. 7g) de manière très efficace.