shRNA – Applications – Qu’est-ce que le shRNA, comment il fonctionne et ses applications.

Qu’est-ce que le shRNA et comment l’utiliser ?

Les séquences d’ARN en épingle à cheveux courtes (shRNA) sont généralement codées dans un vecteur d’ADN qui peut être introduit dans les cellules par transfection plasmidique ou par transduction virale. Les molécules de shRNA peuvent être divisées en deux catégories principales en fonction de leur conception : les shRNA simples à tige-boucle et les shRNA adaptés aux microARN. Un simple shRNA à tige et boucle est souvent transcrit sous le contrôle d’un promoteur ARN polymérase III (Pol III). Le transcrit de 50 à 70 nucléotides forme une structure tige-boucle constituée d’une région de 19 à 29 pb d’ARN double brin (la tige) pontée par une région d’ARN principalement simple brin (la boucle) et un surplomb dinucléotidique en 3′. Le shRNA simple tige-boucle est transcrit dans le noyau et entre dans la voie de l’ARNi comme un pré-microARN. Le shRNA adapté au microARN plus long (> 250 nucléotides) est un modèle qui ressemble plus étroitement aux molécules de pri-microARN natives, et consiste en une structure de tige de shRNA qui peut inclure des mésappariements de type microARN, pontée par une boucle et flanquée de séquences de microARN endogènes 5′ et 3′. Le shRNA adapté au microARN, comme la simple épingle à cheveux à tige-boucle, est également transcrit dans le noyau mais on pense qu’il entre plus tôt dans la voie de l’ARNi, comme un pri-microARN endogène.

Les technologies shRNA sont basées sur l’ADN, ce qui offre une certaine flexibilité dans la conception du vecteur. La plupart des systèmes shRNA à base de vecteurs contiennent un marqueur sélectionnable pour permettre l’élimination des cellules qui n’ont pas été transfectées ou transduites avec succès, et le maintien des cellules avec un knockdown génétique soutenu. Les cassettes d’expression du shRNA peuvent également être incorporées dans des systèmes de vecteurs viraux, notamment les rétrovirus, les virus adéno-associés, les adénovirus et les lentivirus, qui permettent une intégration stable dans le génome de l’hôte et une expression à partir de celui-ci. Ces stratégies virales permettent de délivrer des shRNA à des lignées cellulaires réfractaires à la transfection. Des marqueurs fluorescents (tels qu’une protéine fluorescente verte ou rouge) peuvent également être inclus pour suivre les cellules exprimant des shRNA. La performance des shRNA est influencée par de nombreux facteurs, notamment l’efficacité de la transduction ou de la transfection, le promoteur qui dirige l’expression du shRNA et les modifications épigénétiques (qui peuvent entraîner l’extinction de l’expression du shRNA). En outre, l’influence de chacun de ces facteurs sur les performances du vecteur peut varier en fonction de la lignée ou du type de cellule . Les options de promoteur et de rapporteur SMARTchoice sont disponibles pour aider les chercheurs à sélectionner les promoteurs optimaux pour l’expression du shRNA et l’extinction des gènes. Enfin, lorsque ces cassettes d’expression shRNA sont couplées à des promoteurs inductibles, comme avec SMARTvector Inducible Lentiviral shRNA ou le système de vecteur TRIPZ, les chercheurs peuvent concevoir des études pour moduler temporellement et spatialement l’expression des gènes .

Vidéo d’animation : Interférence ARN

Comment le shRNA est-il délivré à une cellule ?

Il existe deux options pour la délivrance de shRNA à base d’ADN aux cellules. Pour les plasmides, des méthodes de transfection typiques telles que l’utilisation de réactifs de transfection lipidique ou l’électroporation peuvent être employées. Les particules lentivirales constituent un excellent choix pour les cellules difficiles à transfecter et dans les situations où une efficacité élevée est nécessaire ou lorsque plusieurs constructions par cellule doivent être délivrées. La plupart des vecteurs modernes ont des marqueurs sélectionnables qui permettent de tuer sélectivement les cellules de la culture qui n’ont pas été transfectées ou transduites avec succès, de sorte qu’une culture pure peut être développée.

Qu’est-ce qui affecte la fonction et la spécificité du shRNA ?

Un knockdown optimal des gènes est une condition pour réussir l’ARNi en utilisant des systèmes shRNA. La conception rationnelle des séquences shRNA a été largement basée sur les algorithmes développés avec les siRNA. Bien que certaines règles de conception du siRNA s’appliquent au shRNA, des algorithmes de conception du shRNA plus raffinés amélioreront probablement l’extinction du gène cible pour les shRNA à l’avenir. Afin de prédire des séquences shRNA fonctionnelles, l’algorithme SMARTvector™ shRNA de Dharmacon sélectionne les séquences cibles sur la base de nombreux critères, notamment les préférences nucléotidiques dépendant de la position, la structure secondaire et les profils de stabilité thermodynamique spécifiques à l’échafaudage SMARTvector à base de microARN. En outre, l’algorithme SMARTvector comprend plusieurs critères pour augmenter la spécificité.

Comme pour les siRNA, des approches bioinformatiques peuvent être appliquées pour créer des shRNA spécifiques à la cible tout en minimisant le potentiel d’effets hors cible. On sait que des concentrations élevées d’intermédiaires de silençage contribuent aux événements hors cible, mais le niveau des intermédiaires est difficile à contrôler lorsque les shRNA sont exprimés de manière exogène. Plusieurs publications ont démontré que, dans des conditions spécifiques, des niveaux élevés d’expression d’un simple shRNA à tige-boucle peuvent saturer la voie de l’ARNi endogène et conduire à des phénotypes involontaires. D’autres études ont suggéré que l’utilisation d’un shRNA adapté aux microARN peut réduire la toxicité cellulaire pour les expériences d’ARNi in vivo, en raison du fait que ces échafaudages sont traités plus efficacement à la fois par Drosha-DGCR8 et Dicer .

applications shRNA

Les shRNA offrent la possibilité d’un silençage prolongé des gènes. La transduction de shRNA à base virale permet d’accéder à des cellules, telles que les cellules primaires et neuronales, qui sont difficiles à transfecter par les stratégies traditionnelles à base de lipides cationiques. Les shRNA d’origine virale ont également été utilisés pour évaluer la fonction des gènes à l’échelle du génome entier en utilisant des pools de constructions silencieuses. Les cribles groupés ou en réseau sont maintenant largement utilisés pour réaliser des cribles à haut débit afin d’identifier les gènes requis dans une variété de processus tels que la survie et la prolifération des cellules cancéreuses, les composants de la voie de suppression des tumeurs, les modulateurs de l’horloge circadienne des mammifères, les suppresseurs de la transition épithélio-mésenchymateuse, les médiateurs de la réplication du VIH-1 et les régulateurs de la migration cellulaire. La puissance du criblage RNAi groupé a également été étendue au criblage de la fonction des gènes dans des modèles animaux pour étudier la biologie in vivo .

Quel outil shRNA est adapté à vos besoins ?

Guide de sélection shRNA

Nous proposons une sélection de réactifs et de bibliothèques shRNA. Ce guide de sélection rapide vous aidera à déterminer la meilleure option pour vos besoins particuliers.

Produits vedettes

shRNA – Produits

• Réactifs à base de vecteurs lentiviraux pour l’interférence ARN.

SMARTvector Lentiviral shRNA

• Faites des choix intelligents et éclairés pour réussir l’extinction des gènes dans vos cellules d’intérêt.

SMARTvector Inducible shRNA

• Le shRNA inductible à vecteur unique le plus avancé et le plus flexible disponible pour une extinction de gène étroitement contrôlée.

Libres de criblage lentivirales poolées

• Une construction optimisée de pools de haute qualité, des outils d’analyse complets et des protocoles validés sont essentiels pour un résultat réussi lors du criblage avec des bibliothèques lentivirales poolées.

Ressources vedettes

shRNA – Ressources

• Trouver des guides de produits, des FAQ et plus encore.

SMARTvector Lentiviral shRNA – Note technique

• Note technique décrivant le flux de travail expérimental SMARTchoice shRNA dans des cellules en suspension.

SMARTvector Lentiviral shRNA – Manuel technique

• La plateforme est un système innovant idéalement adapté aux études médiées par l’ARNi.

GIPZ Lentiviral shRNA – Manuel technique

• Protocoles expérimentaux pour le knockdown de gènes en utilisant GIPZ lentiviral shRNA.

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