Problèmes initiauxEdit
ThermolabileEdit
L’application initiale de la recombinase FLP-FRT n’a pas fonctionné chez les mammifères. La protéine FLP était thermolabile (dénaturée à des températures élevées) et n’était donc pas utile dans le modèle mammifère en raison des températures corporelles élevées de ces systèmes modèles. Cependant, en raison des brevets et des restrictions sur l’utilisation de la recombinaison Cre-Lox, un grand intérêt a été porté à la production d’une cassette FLP-FRT plus thermostable. Certains des premiers résultats ont été obtenus par Buchholz et al. (1997) en utilisant la mutagenèse cyclique dans Escherichia coli. Dans leur recherche, les auteurs ont transfecté des cellules E. coli avec deux plasmides : l’un codant pour des protéines FLP mutées de façon aléatoire en aval d’un promoteur arabinose et l’autre contenant un promoteur du gène lacZ dans une cassette FRT. Les E. coli ont été cultivés sur des plaques d’arabinose à 37 °C et 40 °C. Si une recombinaison se produisait, l’expression du gène lacZ serait atténuée et les colonies apparaîtraient blanches. Les colonies blanches ont été sélectionnées dans chaque génération et cultivées sur de nouvelles plaques d’arabinose aux mêmes températures précédentes pendant huit générations. Après confirmation de la recombinaison par western-blotting et séquençage des gènes FLP mutés, cette protéine FLP de huitième génération (FLPe) a été transfectée dans une culture de cellules de mammifères, et la recombinaison dans les cellules de mammifères a été confirmée. Cette variante de FLP ne présente que 4 substitutions d’acides aminés : P2S, L33S, Y108N et S294P.
Génération de mosaïques génétiquesEdit
Le mosaïcisme génétique se produit dans un organisme lorsque des types de cellules similaires expriment des phénotypes différents en raison de génotypes dissemblables à des loci spécifiques. En termes simples, cela se produit lorsqu’un organisme contient différents génotypes, ce qui est généralement rare dans la nature. Cependant, ce phénomène peut être produit facilement (et de manière problématique) en utilisant la recombinaison FLP-FRT. Si deux sites FRT différents sont présents dans une cellule, et que FLP est présent à des concentrations appropriées, la cassette FRT continuera à être excisée et insérée entre les deux sites FRT. Ce processus se poursuit jusqu’à ce que les protéines FLP tombent en dessous des concentrations requises, ce qui fait que les cellules d’un organisme possèdent des génotypes différents. Ce phénomène a été observé de la drosophile à la souris et ne fait pas de distinction entre les chromosomes spécifiques (somatiques et sexuels) ou les types de cellules (somatiques et germinales).
Détermination des lignées cellulairesModification
Avant la publication de Dymecki et al. (1998), la recombinase Cre avait été utilisée pour la cartographie du destin cellulaire des progéniteurs neuronaux chez la souris en utilisant le promoteur En2. Les auteurs de Dymecki et al. (1998) ont donc émis l’hypothèse que la recombinase FLP pourrait être utilisée de la même manière et avec la même efficacité que la recombinase Cre chez la souris. Les auteurs ont créé deux lignées de souris transgéniques : une lignée de fusion neuronale Wnt1::Flp et une lignée qui possédait la cassette FRT flanquant le 18e exon de tm1Cwr. Les auteurs ont choisi cet exon pour l’excision car s’il est excisé, il entraîne un phénotype nul. Les auteurs ont accouplé les deux lignées et ont laissé la progéniture atteindre l’âge adulte avant de la sacrifier. L’extraction d’ARN a été effectuée sur des tissus neuronaux, musculaires, entériques et de la queue. La PCR par transcription inverse et le northern blotting ont confirmé l’excision du 18e exon de tm1Cwr en abondance dans le tissu cérébral et modérément dans le tissu musculaire (en raison des cellules de Scwhann dans le muscle). Comme prévu, l’excision n’a pas été observée dans les autres tissus. Les auteurs ont vu une efficacité égale, voire meilleure, de la recombinase FLP dans la détermination du statut cellulaire que la recombinase Cre.
Chez Drosophila melanogaster (mouche à fruits)Edit
À ce jour, la recombinase Flp a été utilisée de nombreuses fois chez D. melanogaster. Une comparaison entre la recombinase Flp et la recombinase Cre chez D. melanogaster a été publiée par Frickenhaus et al. (2015). Les auteurs de Frickenhaus et al. (2015) avaient un double objectif : caractériser et comparer l’efficacité de la recombinase Flp « knock-out » à la recombinase Cre « knock-out » et au knockdown RNAi et révéler la fonction de cabeza (caz), l’orthologue de FUS chez la mouche, dans les neurones et le tissu musculaire de D. melanogaster. Le FUS a été fortement impliqué dans la sclérose latérale amyotrophique (SLA) et la démence frontotemporale chez l’homme. Les auteurs ont utilisé un système elav-Gal4/UAS-Flp ou Cre pour exprimer la recombinase spécifiquement dans les neurones et un système Mef2-Gal4/UAS-Flp ou Cre pour l’exprimer spécifiquement dans les muscles. Les auteurs concluent que la recombinase Flp est plus efficace que l’ARNi et la recombinase Cre pour éliminer des gènes spécifiques dans des tissus ou des lignées cellulaires spécifiques, en raison de l’absence de fuite d’expression observée dans la protéine Cre et le transcrit ARNi. De plus, les auteurs ont été témoins d’une toxicité de la protéine Cre qui n’est pas observée avec la protéine Flp.
Chez Danio rerio (Zebrafish)Edit
L’efficacité du système de recombinase FLPe a été évaluée chez le poisson zèbre par Wong et al. (2009). Des embryons, qui étaient hémizygotes pour une protéine fluorescente verte améliorée (EGFP) flanquée de FRT en aval d’un promoteur spécifique aux muscles, ont été injectés avec la protéine FLPe. Sans FLPe, ces embryons devraient exprimer l’EGFP dans tous les tissus musculaires, et s’ils sont croisés avec un brin de type sauvage, 50% de la descendance résultante devrait également exprimer l’EGFP dans les tissus musculaires. Les embryons, injectés avec FLPe, avaient une expression significativement réduite de l’EGFP dans le tissu musculaire, et le mosaïcisme était également observé. Lorsque ces embryons ont atteint l’âge adulte, ils ont été accouplés avec une souche de type sauvage, et les clutchs résultants avaient significativement moins de descendants exprimant l’EGFP dans le tissu musculaire (0-4%). Ces résultats montrent, que non seulement FLPe est très efficace dans les cellules somatiques, mais aussi dans la lignée germinale du poisson zèbre,
Dans les plantesEdit
Création de « phytocapteurs » ou « sentinelles » dans Arabidopsis thaliana et TobaccoEdit
Les phytocapteurs sont des plantes génétiquement modifiées qui peuvent signaler la présence de contaminants biotiques ou abiotiques. De toute évidence, la production de ces plantes modifiées est très prometteuse en agriculture et en laboratoire. Cependant, la création d’un vecteur rapporteur approprié s’est avérée problématique. Les éléments cis-régulateurs jouent un rôle majeur dans l’activation transcriptionnelle des gènes chez les plantes, et nombre d’entre eux ne sont pas bien compris. De nombreux phytocapteurs sous-expriment leurs gènes rapporteurs ou signalent des faux positifs en raison de promoteurs synthétiques. Les auteurs de Rao et al. (2010) ont utilisé l’outil FLP recombinase pour la production d’un phytocapteur très efficace. Les auteurs ont utilisé un promoteur de choc thermique pour induire la production de FLP tandis qu’un vecteur flanqué de FRT séparait le promoteur CaMV 35S du gène de la bêta-glucuronidase (GUS). Lorsque les plantes ont été exposées à un choc thermique, l’induction de la FLP a entraîné l’excision du vecteur flanqué de FRT, déplaçant ainsi le gène GUS directement en aval du promoteur CaMV 35S. L’activation du GUS a conduit les feuilles des plantes à passer du vert au bleu ; ainsi, le phytocapteur a effectivement signalé le stress au système modèle !
Avec la Cre-recombinaseEdit
Production du système d’expression du MiRNA inductible prêt à l’emploi (GRIM)Edit
L’interférence par ARN (ARNi) a provoqué un changement de paradigme dans l’expression des gènes et les knockouts potentiels de gènes chez les Eucaryotes. Avant la production du système d’expression GRIM, la création de vecteurs ARNi était coûteuse et prenait du temps. Les vecteurs étaient produits par la méthode traditionnelle de clonage moléculaire par copier-coller. Garwick-Coppens et al. (2011) ont mis au point une méthode beaucoup plus efficace pour la production de vecteurs ARNi, dans laquelle l’expression de l’ARNi peut être activée par la Cre-recombinase et désactivée par la Flp-recombinase. Le nouveau système d’expression GRIM permet de générer beaucoup plus rapidement des vecteurs d’expression contenant des constructions ARNi artificielles. Les auteurs ont ensuite montré que leur système d’expression fonctionne assez efficacement dans les cellules de rein embryonnaire humain (HEK), une lignée cellulaire immortalisée humaine courante dans la recherche moléculaire.