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Résultats représentatifs

La capacité des essais en plaques à évaluer avec précision les titres viraux repose sur de nombreux facteurs : sélection appropriée des cellules hôtes, milieux et conditions de croissance adéquats pour la viabilité cellulaire et virale, propagation virale immobilisée et détermination précise de la période d’incubation virale afin de laisser suffisamment de temps pour la formation de plaques distinctes et dénombrables.

Pour cette étude, les virus de trois familles représentatives ont été choisis pour démontrer les différences dans : la sélection des superpositions, les périodes d’incubation, et la morphologie des plaques à travers différents types d’échantillons. L’encéphalite équine vénézuélienne (VEEV) a été sélectionnée comme modèle viral à ARNs (+), qui peut causer une maladie importante chez les espèces équines et les humains et représente la famille des Togaviridae. La souche de l’influenza B de Taiwan, un virus à ARNs (-) segmenté infectant principalement les humains, représente la famille des Orthomyxoviridae. Le virus de la fièvre de la vallée du Rift (RVFV), un virus à ARN (-)ss né chez les arthropodes et infectant principalement les arthropodes, les ruminants et les humains, a été sélectionné comme représentant de la famille des Bunyaviridae.

Pour le RVFV (figure 1), les titres ont été déterminés à partir d’une solution mère d’une souche MP12 recombinante vivante atténuée du RVFV dans un format de plaque à 12 puits utilisant des superpositions de CMC, d’agarose ou d’Avicel qui ont été incubées côte à côte pendant 72 h post-infection (hpi). Une plaque représentative montrant des dilutions allant de 10-4 à 10-7 est visible dans le panneau A. Les plaques utilisant les couches de CMC et d’agarose ont montré des plaques petites, claires et distinctes avec une bordure circulaire bien définie. Les plaques avec une superposition liquide étaient légèrement plus abondantes et plus grandes que les plaques d’agarose et de CMC, et présentaient une bordure moins distincte. Les titres viraux ont été comparés dans le panneau B et tous les recouvrements ont donné des résultats comparables.

Afin d’obtenir une comparaison visuelle plus claire entre les recouvrements pour MP12 ainsi qu’une taille d’échantillon plus importante pour déterminer la reproductibilité, une plaque à 6 puits a également été testée en trois exemplaires (figure 2). Dans le format de plaque à 6 puits, l’utilisation d’un recouvrement de CMC a montré des plaques plus petites que les recouvrements d’agarose ou de liquide, qui étaient comparables en taille les uns aux autres. Alors que les titres viraux étaient similaires entre les trois recouvrements (panneau D), les plaques formées dans les recouvrements d’agarose et de liquide se sont avérées plus faciles à compter en raison de leur taille accrue.

Contrairement au RVFV, les titres de VEEV et la morphologie des plaques entre les différents recouvrements variaient de façon marquée (Figure 3A). Les plaques formées dans les recouvrements CMC ont montré une morphologie claire et distincte lors de l’utilisation d’un format de plaque de 12 puits, au détriment de la taille de la plaque et de la sensibilité (panneau B). Contrairement à la CMC, l’utilisation de superpositions d’agarose et de liquide a produit des plaques significativement plus grandes, indiquant une inhibition virale plus faible et une sensibilité accrue à la réplication du VEEV. Cela a été confirmé précédemment en comparant uniquement l’agarose et la CMC dans un article publié par Juarez et al.4. Alors que l’agarose et les liquides superposés ont produit des plaques plus grandes que la CMC, les plaques avaient des bords mal définis et étaient difficiles à compter dans un format de 12 puits, les liquides superposés fournissant la plus grande diffusion des bords. Lorsque les plaques ont été testées dans des plaques de 6 puits (figure 4), le format plus grand de 6 puits a annulé le problème des plaques manifestement grandes qui étaient difficiles à différencier dans le format de 12 puits, les recouvrements d’agarose et de liquide s’avérant supérieurs aux recouvrements de CMC en termes de définition des plaques et de sensibilité (figure 4D).

Par rapport au RVFV ou au VEEV, la grippe présente plusieurs défis uniques lors du plaquage, tels que la nécessité d’une protéase externe. La sensibilité du virus de la grippe à différentes sélections de recouvrement a également été bien documentée dans le passé, car des changements significatifs ont été notés lorsque des modifications aussi mineures que différentes marques d’agarose ont été utilisées9.

Intéressant pour la souche Influenza B Taiwan, l’utilisation de CMC comme recouvrement a entraîné des plaques nettement plus petites qui étaient difficiles à compter et se sont avérées difficiles à marquer de manière fiable (Figure 5A). L’utilisation d’une surcouche d’agarose a fourni les meilleures plaques (panneau C), et a donné lieu à une coloration de fond plus sombre (probablement due à une viabilité accrue de la monocouche), et a montré des plaques plus claires et plus nettes en comparaison directe avec l’utilisation de la surcouche liquide (panneau B).

Un avantage distinct des polymères liquides par rapport aux surcouches solides et semi-solides, telles que l’agarose et la CMC, réside dans la facilité de retrait et d’application. Les overlays semi-solides nécessitent un chauffage, et la solidification peut s’avérer problématique lors de la manipulation et du retrait. Afin de tirer parti de ces avantages et de déterminer l’aspect pratique de l’utilisation d’Avicel à haut débit pour le RVFV, un format de plaque de 96 puits a été testé à différentes concentrations de recouvrement (Figure 6). Pour le RVFV MP-12, des dilutions ont été réalisées en quadruplicat à des concentrations finales d’Avicel de 0,6 et 1,2 %. L’application et le retrait de la surcouche se sont avérés simples, sans qu’aucune différence apparente ne soit notée entre les répliques ou entre les concentrations, ce qui démontre un haut degré de reproductibilité. Lors de la notation, les plaques étaient distinctes et dénombrables à l’œil nu, démontrant la faisabilité de l’utilisation de superpositions liquides à haut débit pour le RVFV.

Figure 1:Comparaisons de superpositions de plaques de RVFV utilisant des plaques à 12 puits. Veros ont été plaqués à 2,5 x 105 cellules dans des plaques à 12 puits et infectés avec 200 µl en utilisant le même échantillon de départ dilué en série de MP12. Après l’infection, des superpositions de 1,5 ml d’agarose à 0,3 %, d’Avicel à 0,6 % ou de CMC à 1 % (concentrations finales) ont été appliquées afin de comparer directement les superpositions, comme le montre le panneau A. Les plaques ont été comptées et titrées dans le panneau B .

Figure 2:Comparaisons de superpositions de plaques de RVFV en utilisant des plaques à 6 puits. Veros ont été plaqués à 5 x 105 cellules dans des plaques à 6 puits et infectés avec 400 µl en utilisant le même échantillon de départ dilué en série de MP12. Des superpositions de trois ml d’agarose à 0,3 %, d’Avicel à 0,6 % ou de CMC à 1 % ont été appliquées afin de comparer directement les superpositions comme démontré dans les panneaux A, B et C. Des expériences distinctes ont été réalisées de manière identique à celle décrite pour les panneaux A-C, avec des plaques comptées et titrées dans le panneau D (N = 3).

Figure 3:Comparaisons de superposition de plaques de VEEV en utilisant des plaques à 12 puits. Veros ont été plaqués à 2,5 x 105 cellules dans des plaques à 12 puits et infectés avec 200 µl en utilisant le même échantillon de départ dilué en série de la souche vaccinale VEEV TC-83. Après l’infection, des superpositions de 1,5 ml d’agarose à 0,3 %, d’Avicel à 0,6 % ou de CMC à 1 % ont été appliquées afin de comparer directement les superpositions, comme le démontre le panneau A. Les plaques ont été comptées et titrées dans le panneau B.

Figure 4 : Comparaisons de superpositions de plaques de VEEV utilisant des plaques à 6 puits. Veros ont été plaqués à 5 x 105 cellules dans des plaques à 6 puits et infectés avec 400 µl en utilisant le même échantillon de départ dilué en série de VEEV TC-83. Après l’infection, des superpositions de 3 ml d’agarose à 0,3 %, d’Avicel à 0,6 % ou d’une CMC à 1 %, ont été appliquées afin de comparer directement les superpositions comme démontré dans les panneaux A, B et C. Des expériences séparées ont été réalisées de manière identique à celle décrite pour les panneaux A – C, avec des plaques comptées et titrées dans le panneau D (N = 3).

Figure 5:Comparaisons de superpositions de plaques de grippe. Les cellules MDCK ont été placées à 5 x 105 cellules dans des plaques à 6 puits et infectées avec 400 µl d’inoculum en utilisant le même échantillon de départ dilué en série d’Influenza B Taïwan. Aucun sérum bovin fœtal (FBS) n’a été utilisé dans les milieux de croissance ou les superpositions, car le FBS peut inhiber la propagation de l’influenza par l’inhibition de certaines protéases qui sont nécessaires à la fusion virale. De la TPCK-trypsine a été ajoutée à toutes les superpositions avant l’application afin de faciliter la fusion et l’entrée du virus dans les cellules hôtes. Après l’infection, des recouvrements de 3 ml d’agarose à 0,3 %, d’Avicel à 0,6 % ou de CMC à 1 % ont été appliqués afin de comparer directement les recouvrements, comme le montrent les panneaux A, B et C. Des expériences distinctes ont été réalisées de manière identique à celle décrite dans les panneaux A à C, les plaques étant comptées et numérotées dans le panneau D (N = 3). Bien qu’une moyenne ait été prise pour les plaques de CMC, elles se sont avérées difficiles à compter de manière fiable car elles ont démontré des frontières diffuses et de très petites tailles de plaques.

Figure 6:Superpositions de plaques à haut débit. Une plaque de 96 puits de Veros plaqués à 3 x 104 cellules par puits, ont été infectés avec 50 µl d’inoculum en utilisant le même échantillon de départ dilué en série de RVFV MP12 pendant 1 h, en quadruplicat. Pour les superpositions, des concentrations finales de 0,6 et 1,2% d’Avicel ont été testées afin de déterminer la faisabilité et la reproductibilité de l’utilisation de superpositions liquides à haut débit, panneaux A et B.

Tableau 1 :Conditions d’inoculation du test des plaques et types de cellules

Tableau 2 :Plaques et milieux de croissance viraux/cellulaires

Les solutions de recouvrement ne se périment pas lorsqu’elles sont fabriquées tant que la stérilité est maintenue.

Tableau 3:Stock de superpositions

Tableau 4 : Formats de plaques

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