Une procédure générale de blotting commence par l’extraction de l’ARN total d’un échantillon de tissu homogénéisé ou de cellules. L’ARNm eucaryote peut ensuite être isolé par l’utilisation de la chromatographie sur cellulose oligo (dT) pour isoler uniquement les ARN ayant une queue poly(A). Les échantillons d’ARN sont ensuite séparés par électrophorèse sur gel. Comme les gels sont fragiles et que les sondes ne peuvent pas pénétrer dans la matrice, les échantillons d’ARN, maintenant séparés par leur taille, sont transférés sur une membrane de nylon par un système de buvardage capillaire ou sous vide.
Mise en place d’un système de blotting capillaire pour le transfert d’ARN d’un gel d’électrophorèse à une membrane de blotting.
Une membrane de nylon avec une charge positive est la plus efficace pour une utilisation en northern blotting puisque les acides nucléiques chargés négativement ont une grande affinité pour eux. Le tampon de transfert utilisé pour le buvardage contient généralement du formamide car il abaisse la température d’annelage de l’interaction sonde-ARN, éliminant ainsi le besoin de températures élevées, qui pourraient entraîner une dégradation de l’ARN. Une fois que l’ARN a été transféré sur la membrane, il est immobilisé par liaison covalente à la membrane par la lumière UV ou la chaleur. Une fois qu’une sonde a été marquée, elle est hybridée à l’ARN sur la membrane. Les conditions expérimentales qui peuvent affecter l’efficacité et la spécificité de l’hybridation comprennent la force ionique, la viscosité, la longueur du duplex, les paires de bases non appariées et la composition des bases. La membrane est lavée pour s’assurer que la sonde s’est liée spécifiquement et pour empêcher l’apparition de signaux de fond. Les signaux hybrides sont ensuite détectés par un film radiographique et peuvent être quantifiés par densitométrie. Pour créer des contrôles pour la comparaison dans un northern blot, des échantillons ne présentant pas le produit génique d’intérêt peuvent être utilisés après une détermination par microarrays ou RT-PCR.
GelsEdit
RNA passé sur un gel d’agarose formaldéhyde pour mettre en évidence les sous-unités ribosomiques 28S (bande supérieure) et 18S (bande inférieure).
Les échantillons d’ARN sont le plus souvent séparés sur des gels d’agarose contenant du formaldéhyde comme agent dénaturant de l’ARN pour limiter la structure secondaire. Les gels peuvent être colorés avec du bromure d’éthidium (EtBr) et visualisés sous lumière UV pour observer la qualité et la quantité d’ARN avant le blotting. L’électrophorèse sur gel de polyacrylamide avec urée peut également être utilisée pour la séparation de l’ARN, mais elle est le plus souvent utilisée pour l’ARN fragmenté ou les microARN. On fait souvent passer une échelle d’ARN à côté des échantillons sur un gel d’électrophorèse pour observer la taille des fragments obtenus, mais dans les échantillons d’ARN total, les sous-unités ribosomiques peuvent servir de marqueurs de taille. Puisque la grande sous-unité ribosomale est 28S (environ 5kb) et la petite sous-unité ribosomale est 18S (environ 2kb) deux bandes proéminentes apparaissent sur le gel, la plus grande à près de deux fois l’intensité de la plus petite.
SondesEdit
Les sondes pour le northern blotting sont composées d’acides nucléiques avec une séquence complémentaire à tout ou partie de l’ARN d’intérêt, elles peuvent être de l’ADN, de l’ARN ou des oligonucléotides avec un minimum de 25 bases complémentaires à la séquence cible. Les sondes d’ARN (ribosondes) qui sont transcrites in vitro sont capables de supporter des étapes de lavage plus rigoureuses, ce qui permet d’éviter une partie du bruit de fond. En général, l’ADNc est créé avec des amorces marquées pour la séquence d’ARN d’intérêt qui servira de sonde dans le Northern Blot. Les sondes doivent être marquées soit avec des isotopes radioactifs (32P), soit par chimioluminescence, ce qui signifie que la phosphatase alcaline ou la peroxydase de raifort (HRP) décompose les substrats chimioluminescents en produisant une émission de lumière détectable. Le marquage chimioluminescent peut se produire de deux façons : soit la sonde est fixée à l’enzyme, soit la sonde est marquée avec un ligand (par exemple la biotine) pour lequel le ligand (par exemple l’avidine ou la streptavidine) est fixé à l’enzyme (par exemple la HRP). Les films radiographiques peuvent détecter à la fois les signaux radioactifs et chimioluminescents et de nombreux chercheurs préfèrent les signaux chimioluminescents car ils sont plus rapides, plus sensibles et réduisent les risques sanitaires liés aux marqueurs radioactifs. La même membrane peut être sondée jusqu’à cinq fois sans perte significative de l’ARN cible.