Produits chimiques et réactifs
GT a été acheté sur le marché de Taichung, Taïwan. L’IS (pureté 97%) a été obtenu auprès d’Alfa Aesar (Lancaster, UK). La 6,7-diméthoxycoumarine (6,7-DMC, pureté 98%) a été fournie par Aldrich Chemical Co. (Milwaukee, WI, U.S.A.). L’EC (pureté 90 %), l’ECG (pureté 98 %), l’EGCG (pureté 95 %), l’acide formique, le probénécide, l’acide phosphorique (glacial, 85 %) et le méthylparaben ont été achetés auprès de Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO, U.S.A.). L’EGC (pureté 92,7 %) a été obtenu auprès de ChromaDex, Inc. (Irvine, CA, U.S.A.). et l’acétate d’éthyle étaient de qualité LC et ont été obtenus auprès de ECHO Chemical Co. (Miaoli Hsien, Taiwan). L’acétonitrile était de qualité LC/MS et a été acheté auprès de Millinckrodt Baker, Inc. (Phillipsburg, NJ, U.S.A.). Le sérum fœtal de bovin a été obtenu auprès de Biological Industries Inc. (Kibbutz, Beit Haemek, Israël). Pénicilline-Streptomycine-Glutamine, milieu Eagle modifié de Dulbecco, trypsine/EDTA, solution saline équilibrée de Hank et acide 4-(2-hydroxyéthyl)-1-pipérazineéthanesulfonique ont été achetés chez Invitrogen (Carlsbad, CA, U.S.A.). Le milieu Eagle modifié F12 de Dulbecco a été obtenu auprès de Thermo Fisher Scientific Inc (Waltham, MA, U.S.A.). La 6-carboxyfluorescéine a été achetée chez AAT Bioquest Inc. (Sunnyvale, CA, U.S.A.) et la 5-carboxyfluorescéine a été obtenue auprès d’Acros Organics (Geel, Belgique). L’eau Milli-Q plus (Millipore, Bedford, MA, U.S.A.) a été utilisée pour toutes les préparations.
Préparation et caractérisation de l’infusion de GT
L’infusion a été produite par trempage de 2 ou 4 g de GT dans 50 mL d’eau chaude déionisée (98-100 °C) pendant 30 minutes. L’infusion a été filtrée avec une gaze pendant qu’elle était chaude pour obtenir des concentrations de 40 et 80 mg/mL, respectivement, qui ont été fraîchement administrées à des rats par gavage gastrique.
Pour la caractérisation de l’infusion de GT, après filtration de l’infusion de GT avec un filtre RC15 de 0,2 μm (Sartorious, Goettingen Allemagne), 100 μL du filtrat ont été mélangés avec 900 μL de méthanol et centrifugés pour éliminer le précipité. L’infusion correctement diluée (50 μL) a été combinée avec 50 μL de solution de 6,7-DMC (2,0 μg/mL dans du méthanol) comme standard interne et 5 μL ont été soumis à l’analyse LC-MS/MS. Le système HPLC comprenait une pompe Accela 1250 et un échantillonneur automatique (Thermo Fisher Scientific Inc. U.S.A.). La séparation chromatographique a été réalisée à l’aide d’une colonne analytique Phenomenex® C18 (150 mm × 1,0 mm, 5 μm) avec un préfiltre. La phase mobile était constituée d’acétonitrile contenant 0,01 % d’acide formique (A) et d’eau contenant 0,01 % d’acide formique (B) et programmée en gradient comme suit : A/B : 2/98 (0-2 min), 15/85 (4 min), 40/60 (6 min), 90/10 (8-10 min) et 2/98 (12 min). Le débit était de 0,2 mL/min. L’effluent de la colonne a été détecté par la sonde H-ESI (heated-electrospray ionization) -II avec le spectromètre de masse Quantum Access MAX triple stage quadrupole (TSQ) (Thermo Fisher Scientific Inc. U.S.A.). L’azote a été utilisé comme gaz de gaine à 35 unités arbitraires et comme gaz auxiliaire à 10 unités arbitraires. L’énergie de collision a été réglée à -19/18 V, la tension de vaporisation à -3000/3000 V, la température du capillaire à 350 °C, la température du vaporisateur à 350 °C et le décalage de la lentille du tube à -80/88 V. Les transitions de masse suivantes ont été utilisées pour l’analyse de surveillance de réaction sélectionnée (SRM) : EC (289/245), EGC (305/125), ECG (441/289), EGCG (457/169) et 6,7-DMC (207/151). Les spectres ESI-MS ont été enregistrés en mode ion négatif pour l’EC, l’EGC, l’ECG et l’EGCG et en mode ion positif pour le 6,7-DMC.
Animaux
Des rats Sprague-Dawley mâles (270-360 g) ont été achetés au National Laboratory Animal Center (Taipei, Taiwan) et logés dans un environnement conditionné avec des cycles lumière/obscurité de 12 heures. Ils ont reçu de la nourriture et de l’eau ad libitum jusqu’à 12 heures avant les expériences. Les rats ont été divisés en deux groupes. La première expérience a utilisé 28 rats pour déterminer l’effet de la GT sur les taux sériques d’IS et de PCS chez les rats CRF ; la seconde expérience a utilisé 14 rats pour évaluer l’effet de la GT sur la fonction rénale des rats CRF. Toutes les expériences sur les animaux ont été réalisées en stricte conformité avec les recommandations du « Guidebook for the Care and Use of Laboratory Animals (2002) » publié par la Chinese Society of Animal Science, Taiwan, R.O.C.. Le protocole expérimental avait été examiné et approuvé le 08/01/2014 (numéro de permis : 103-126-N) par le Comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux de l’Université médicale de Chine, Taïwan, R.O.C.
Établissement du modèle de CRF et administration de la perfusion de GT
La CRF a été induite via l’administration orale d’adénine en suivant des études précédentes, mais avec quelques modifications19,23,35,36. Brièvement, de l’adénine en suspension dans de la méthylcellulose 400 à 0,5 % (15 mg/mL) a été administrée par voie orale à 28 rats par gavage gastrique deux fois par jour pour sept doses consécutives (15 mg/rat) pendant toute la période expérimentale. Le quatrième jour, les taux sériques d’IS ont été déterminés. Après confirmation de l’atténuation de la fonction rénale par une élévation significative des taux sériques d’IS, les rats CRF ont été répartis en trois groupes (8-10 rats dans chaque groupe) avec des taux d’IS comparables. Le premier groupe a reçu 400 mg/5 mL/kg de GT en perfusion deux fois par jour pendant sept doses consécutives ; le deuxième groupe a reçu 200 mg/5 mL/kg de GT deux fois par jour pendant sept doses consécutives ; et le troisième groupe a reçu 5 mL/kg d’eau en parallèle comme contrôle. Le 8ème jour, les rats ont reçu la 7ème dose de GT à 9h00 du matin après un jeûne nocturne et les échantillons de sang ont été prélevés à 0, 15, 30, 60, 120, 180 et 360 min après l’administration. Les heures prévues pour la collecte du sang et l’administration de l’adénine et du GT sont résumées dans la figure 3. À chaque heure de prélèvement, 0,5 ml de sang a été prélevé sous anesthésie à l’isoflurane. Les échantillons de sang ont été recueillis dans des microtubes et centrifugés à 10 000 g pendant 15 min pour obtenir du sérum, qui a été conservé à -20 °C avant analyse.
Détermination des concentrations d’IS et de PCS dans le sérum
Pour la détermination des concentrations d’IS et de PCS dans le sérum, 50 μL d’échantillon de sérum ont été mélangés par vortex avec 200 μL de méthanol contenant respectivement 10 μg/mL de 6,7-DMC ou 100 μg/mL de méthylparaben comme standards internes, et centrifugés pour éliminer le précipité, puis une aliquote de 20 μL a été soumise à une analyse HPLC.
Pour les préparations de calibrateurs, 50 μL de sérum ont été dopés avec une série de concentrations d’IS et de PCS pour permettre des gammes de concentration de 0,4-25,0 μg/mL (1,8-117,3 μM) et 0,3-20,0 μg/mL (1,7-106,3 μM), respectivement. La procédure ultérieure a suivi celle décrite ci-dessus pour les échantillons de sérum. Les courbes d’étalonnage ont été tracées par régression linéaire des rapports des surfaces des pics (IS ou PCS par rapport à l’étalon interne) en fonction des concentrations connues d’IS et de PCS, respectivement.
L’appareil HPLC comprenait une pompe (LC-10AT, Shimadzu, Kyoto, Japon), un détecteur de fluorescence (RF-20A, Shimadzu, Kyoto, Japon) et un injecteur automatique (SIL-10AF, Shimadzu, Kyoto, Japon). La colonne Apollo C18 (5 μm, 4,6 mm × 250 mm, Alltech, Deerfield, IL, USA) était équipée d’une colonne de garde (4,6 × 50 mm, 5 μm) (GL Science Inc., Tokyo, Japon). La phase mobile était composée d’acétonitrile (A)-0,1 % d’acide phosphorique (B) et programmée en gradient comme suit : A/B : 15/85 (0-7 min), 30/70 (9-22 min) et 15/85 (24-35 min) pour IS et 16/84 (0-10 min), 30/70 (13-22 min) et 16/84 (24-36 min) pour PCS. Les réglages du détecteur étaient Ex 280 nm/Em 375 nm pour IS et Ex 214 nm/Em 306 nm pour PCS. Les débits étaient de 1,0 mL/min.
Effet du GT sur le Cr et l’azote uréique sanguin chez les rats CRF
Dans une autre expérience, le même protocole animal mentionné ci-dessus a été employé et les concentrations de Cr et d’azote uréique sanguin ont été déterminées avant le traitement à l’adénine (jour 0), avant l’administration du GT (jour 4) et après la 7e dose de GT (jour 8). Après confirmation de l’atténuation de la fonction rénale par une élévation significative de la Cr et de l’AUS au jour 4, les rats CRF ont été divisés en deux groupes (7 rats par groupe) avec des niveaux de Cr comparables. Le premier groupe a reçu 400 mg/5 mL/kg de GT deux fois par jour pendant sept doses consécutives ; le second groupe a reçu 5 mL/kg d’eau en parallèle comme contrôle. Le jour 8, les rats ont reçu la 7ème dose de GT et d’eau après un jeûne nocturne et les échantillons de sang ont été prélevés 30 minutes plus tard. Le Cr a été déterminé par une méthode cinétique au picrate alcalin dans un système de chimie ADVIA 2400 (Siemens Health Care Diagnostics, Inc. Tarrytown, NY, U.S.A.). L’azote uréique sanguin a été dosé par la réaction enzymatique couplée uréase/glutamate déshydrogénase en utilisant le même analyseur.
Ligne cellulaire et conditions de culture
La construction des lignées cellulaires transfectées de manière stable utilisées pour les études de transport, cellules d’ovaire de hamster chinois (CHO) exprimant hOAT1 (CHO-hOAT1), cellules de rein embryonnaire humain 293 (HEK) exprimant hOAT3 (HEK-hOAT3) et leurs lignées cellulaires témoins transfectées par vecteur vide correspondantes, a été décrite précédemment40,41. Les cellules CHO ont été maintenues à 37 °C avec 5% de CO2 dans un milieu DMEM F-12 (Thermo Fisher Scientific Inc., USA) contenant 10% de sérum, 1% de pénicilline/streptomycine et 1 mg/mL de G418. Les cellules HEK ont été maintenues à 37 °C avec 5 % de CO2 dans un milieu DMEM high glucose (Thermo Fisher Scientific Inc, USA) contenant 10% de sérum, 1% de pénicilline/streptomycine et 50 μg/mL d’hygromycine B. Les cellules ont été cultivées dans des plats recouverts de Poly-D-Lysine.
Préparation et caractérisation des métabolites sériques du GT (GTM)
Afin de mimer les molécules interagissant avec les OATs in vivo, des GTM ont été préparés à partir de rats et caractérisés. En bref, une perfusion de GT (800 mg/10 mL/kg) a été administrée par voie orale à des rats à jeun pendant la nuit. Le sang a été collecté 15 minutes après l’administration de la perfusion de GT. Après coagulation, le sérum a été collecté et mélangé au vortex avec du méthanol à trois reprises. Après centrifugation à 10 000 g pendant 15 minutes, le surnageant a été concentré dans un évaporateur rotatif sous vide jusqu’à siccité. Un volume approprié d’eau a été ajouté au résidu, donnant une solution avec une concentration de sérum 10 fois supérieure, qui a été divisée en aliquotes et stockée à -80 °C pour une utilisation ultérieure.
Une portion de GTM a été caractérisée en suivant une méthode précédente avec quelques modifications16,46. Brièvement, 100 μL d’échantillon de sérum ont été mélangés avec 50 μL de sulfatase (contenant 1000 unités/mL de sulfatase et 39 861 unités/mL de ß-glucuronidase), 50 μL d’acide ascorbique (200 mg/mL) et incubés à 37 °C pendant 45 min en condition anaérobie. Après hydrolyse, le sérum a été ajouté à 50 μL de HCl 0,1 N, puis partitionné avec 250 μL d’acétate d’éthyle (contenant 100 ng/mL de 6,7-DMC comme standard interne). La couche d’acétate d’éthyle a été évaporée sous N2 jusqu’à siccité et reconstituée avec un volume approprié de phase mobile avant l’analyse LC-MS/MS. La phase mobile était constituée d’acétonitrile (A) – eau contenant 0,1% d’acide formique (B) et programmée en gradient comme suit : A/B : 2/98 (0-2 min), 15/85 (4 min), 40/60 (6 min), 90/10 (8-10 min) et 2/98 (12 min). Le débit était de 0,2 mL/min.
Effets du GTM sur le transport d’absorption médié par hOAT1 et hOAT3
Des cellules CHO-hOAT1 et HEK-hOAT3 (1 × 105 cellules/puits) ont été cultivées dans une plaque à 96 puits. La 6-carboxyfluorescéine (6-CF) et la 5-carboxyfluorescéine (5-CF) ont été utilisées comme sondes pour évaluer l’effet du GTM sur l’activité de hOAT1 et hOAT3, respectivement47,48. En outre, le probénécide (80 μM) a été utilisé comme contrôle positif pour l’inhibition de hOAT1 et hOAT349. Après 24 h ou 48 h d’incubation de CHO-hOAT1 ou HEK-hOAT3, le milieu a été retiré et lavé trois fois avec du tampon PBS. Avant l’expérience de transport, les cellules CHO-hOAT1 et HEK-hOAT3 ont été pré-incubées avec les agents testés (GTM et probénécide) à 37 °C. Après 30 min d’incubation, le 6-CF ou le 5-CF a été ajouté et incubé pendant 5 min et 10 min supplémentaires, respectivement. Les plaques ont été immédiatement placées sur un bain de glace et les surnageants ont été retirés et les cellules ont été lavées trois fois avec du PBS glacé. Par la suite, 100 μL de Triton X-100 à 0,1% ont été ajoutés pour lyser les cellules et la fluorescence a été mesurée avec une excitation à 485 nm et une émission à 528 nm. Pour quantifier la teneur en protéines dans chaque puits, 10 μL de lysat cellulaire ont été ajoutés à 200 μL de réactif de dosage des protéines dilué (Bio-Rad, Hercules, CA, États-Unis) et la densité optique a été mesurée à 570 nm. L’accumulation intracellulaire relative de 6-CF ou de 5-CF a été calculée en comparant avec celle des témoins après correction des protéines.
Analyse des données
Le pic de concentration sérique (Cmax) a été obtenu à partir de l’observation expérimentale. L’aire sous la courbe de concentration sérique – temps (AUC0-t) a été calculée en utilisant la règle trapézoïdale jusqu’au dernier point. Les différences d’IS et de PCS entre les trois groupes ont été analysées à l’aide d’une ANOVA à sens unique, tandis que la différence de Cr et de BUN entre deux groupes a été analysée à l’aide d’un test t de Student non apparié, en prenant p < 0,05 comme niveau significatif. Le test t de Student non apparié a également été utilisé pour l’analyse des essais in vitro.