La maladie d’Albers-Schönberg (ostéopétrose autosomique dominante, type II) résulte de mutations dans le gène du canal chlorure ClCN7

Abstract

La maladie d’Albers-Schönberg, ou ostéopétrose autosomique dominante, type II (ADO II), est la forme la plus courante d’ostéopétrose, un groupe d’affections caractérisées par une masse squelettique accrue due à une résorption osseuse et cartilagineuse altérée. Après l’attribution du gène responsable de l’ADO II au chromosome 16p13.3, nous rapportons maintenant sept mutations différentes dans le gène codant pour le canal chlorure ClCN7 dans les 12 familles ADO II analysées. De plus, un patient atteint de la forme infantile autosomique récessive sévère de l’ostéopétrose (ARO) a été identifié comme étant homozygote pour une mutation ClCN7. D’après les corrélations génotype-phénotype, il semble que l’OAR II reflète un effet négatif dominant, alors que les mutations de perte de fonction dans ClCN7 ne provoquent pas d’anomalies chez les individus hétérozygotes. Comme certains patients atteints d’ORA présentent des mutations dans les deux copies du gène ClCN7, l’ADO II est allélique avec un sous-ensemble de cas d’ORA.

Reçu le 2 octobre 2001 ; révisé et accepté le 11 octobre 2001.

INTRODUCTION

En santé, le remodelage du tissu osseux résulte des processus équilibrés de formation et de résorption osseuse. Une résorption excessive provoque l’ostéoporose, qui est à l’origine de la plupart des fractures non traumatiques (1). À l’inverse, une résorption osseuse défectueuse provoque une ostéopétrose caractérisée par des os denses mais généralement fragiles. Au moins huit types d’ostéopétrose ont été décrits chez l’homme (2). La déficience de l’isoenzyme de l’anhydrase carbonique II provoque une ostéopétrose autosomique récessive (ARO) avec acidose tubulaire rénale et calcifications cérébrales (3 ; MIM 259730), tandis que la majorité des cas d’ARO maligne (4 ; MIM 259700) reflètent des mutations du gène TCIRG1 (5,6). Certains cas rares d’ostéopétrose, apparemment avec un mode d’héritage autosomique récessif, présentent un phénotype plus léger et sont donc appelés la forme « intermédiaire » (7,8 ; MIM 259710).

L’ostéopétrose autosomique dominante (ADO) est beaucoup plus fréquente que ses homologues récessifs (9). Cependant, en raison de son tableau clinique relativement bénin, de nombreux patients étant asymptomatiques et n’étant détectés que par un examen radiographique fortuit, la prévalence de l’OAD est sous-estimée. Parmi les familles atteintes d’OAD, deux sous-types sont généralement signalés, principalement sur la base des caractéristiques radiographiques (10,11). Le type I (ADOI) se caractérise par une ostéosclérose diffuse et généralisée, touchant surtout la voûte crânienne (11). Le type II (ADO II ; MIM 166600), la forme initialement décrite en 1904 par Albers-Schönberg (12), est la forme la plus courante avec une prévalence estimée à 5,5/100 000 (13). Les manifestations cliniques comprennent des fractures non traumatiques, notamment des os longs, des paralysies des nerfs crâniens, une arthrose de la hanche et une ostéomyélite mandibulaire (14). L’OAD II se manifeste radiographiquement par une ostéosclérose segmentaire, principalement au niveau des plateaux vertébraux (colonne vertébrale en  » jersey rugger « ), des ailes iliaques (signe  » os dans l’os « ) et de la base du crâne (9) (Fig. 1).

Récemment, une recherche à l’échelle du génome nous a conduits à attribuer un gène sous-jacent à l’OAD II au chromosome 16p13.3 (15). De façon intéressante, le gène codant pour le canal chlorure ClCN7 réside dans la région candidate de 8,4 cM (16). En fait, le canal chlorure est essentiel pour l’acidification de la lacune de résorption extracellulaire nécessaire à la dégradation du tissu osseux par les ostéoclastes (17), et il est muté chez un patient atteint d’ORA (17). Par conséquent, nous avons considéré ClCN7 comme un gène candidat à la fois positionnel et fonctionnel pour causer la maladie d’Albers-Schönberg.

RESULTATS

Analyse de mutation des familles ADO II

Parce que la séquence génomique incluant le gène ClCN7 est disponible dans les bases de données de séquences (GenBank accession nos AL031600 et AL031705), l’analyse de mutation des exons et des limites intron-exon est possible en utilisant l’ADN génomique. Cet effort a permis de découvrir sept mutations distinctes dans ClCN7 (Fig. 2) dans 12 familles ADO II non apparentées (Tableau 1). Cinq mutations sont faux-sens, une entraîne la suppression d’un acide aminé et une autre supprime deux nucléotides, ce qui provoque un décalage de cadre affectant l’extrémité C-terminale de la protéine. Aucune de ces mutations n’a été trouvée dans les 100 chromosomes de contrôle.

Quatre mutations sont des mutations redondantes. La mutation 2423delAG a été identifiée dans une famille française et dans une famille américaine. La mutation G215R est apparue dans une famille française, une famille danoise et une famille américaine. La mutation P249L a été trouvée dans une famille française et dans une famille allemande. Enfin, la mutation R767W a été identifiée dans une famille française et une famille américaine (tableau 1). Les différentes origines géographiques des familles étudiées, ainsi que l’analyse des marqueurs microsatellites flanquant le gène ClCN7 (données non présentées), indiquent qu’il s’agit de mutations indépendantes, c’est-à-dire non héritées d’un ancêtre commun.

Analyse de mutation d’un patient ARO

L’analyse de liaison avec les marqueurs du chromosome 16p13.3 a clairement montré une homozygotie pour tous les marqueurs chez un patient ARO né de parents sains consanguins (données non présentées). Par conséquent, une analyse de la mutation de ClCN7 a été effectuée et a mis en évidence une mutation faux-sens homozygote en position 766 (L766P) (Fig. 2). Les deux parents sont hétérozygotes pour cette mutation.

Position et conservation des acides aminés mutés

La topologie transmembranaire proposée pour les canaux chlorures ClC suggère 10-12 domaines transmembranaires (18). Les cinq acides aminés impliqués dans les mutations missens de l’ADO II, ainsi que la mutation impliquée chez le patient ARO, sont tous hautement conservés parmi les différents membres de la famille de gènes des canaux chlorure ClC (Fig. 3). Les mutations G215R et P249L sont des mutations récurrentes trouvées chez les patients de trois et deux familles non apparentées, respectivement (Tableau 1). G215 est un résidu hautement conservé situé entre D2 et D3 (Fig. 4), une région connue pour influencer les propriétés du pore des canaux (19), tandis que P249 participe à un élément structurel hautement conservé formant une partie substantielle du pore du canal ClC (20). R286 est situé dans l’espace extracellulaire, juste à l’extérieur du domaine transmembranaire D5. Cet acide aminé est conservé parmi les différentes protéines ClC, à l’exception de ClC1 et ClC2 qui ont une séquence divergente dans cette région de la protéine. Les deux mutations ADO II restantes et la mutation ARO se situent dans la partie cytosolique, C-terminale de la protéine impliquant des acides aminés voisins. G765, L766 et R767 sont situés dans le segment D13, qui coïncide avec le deuxième domaine CBS (cystathionine-β-synthase) décrit dans la protéine CLCN7 (21). Les trois mutations se localisent dans le brin β2 du domaine CBS dans lequel des mutations ont été rapportées pour causer des maladies humaines (22). La fonction précise de ce domaine n’est pas encore claire, mais un rôle dans le tri des protéines a été suggéré (21).

Enfin, les deux petites délétions impliquent des acides aminés de la partie C-terminale intracellulaire de ClCN7. L’acide aminé L688, délété chez un patient, est situé entre les deux domaines CBS, tandis que la délétion de deux nucléotides à partir de la position nucléotidique 2423 aboutit, dans deux familles non apparentées, à une protéine qui ne diffère de la ClCN7 de type sauvage que par les 10 derniers acides aminés.

DISCUSSION

Les ostéopétropes chez les mammifères comprennent un groupe hétérogène de conditions incluant au moins huit entités cliniques différentes chez l’homme (2) et environ neuf mutants animaux spontanés (23). En outre, les modèles de souris knockout pour plusieurs gènes provoquent des phénotypes ostéopétrotiques, illustrant la diversité des facteurs impliqués dans la différenciation et l’activation des ostéoclastes (23).

Récemment, l’hétérogénéité des ostéopétropes humains a été soulignée par une hétérogénéité génétique même au sein du sous-type ADO II (24,25). Cette révélation était basée sur une étude de liaison impliquant une famille étendue danoise, qui a assigné le gène ADO II au chromosome 1p21 (26). Cependant, cette assignation n’a pas été confirmée par des études portant sur d’autres familles de l’OAD II. En fait, dans notre récente étude de liaison, incluant six familles d’OAD II, nous avons localisé le gène responsable de la maladie sur le chromosome 16p13.3 et trouvé dans la même famille danoise une co-ségrégation entre l’OAD II et un haplotype du chromosome 16p13.3 (15). Par conséquent, nous avons supposé que la preuve de liaison au chromosome 1p21 dans cette famille reflétait une co-ségrégation fortuite. Dans la présente étude, nous avons confirmé cette hypothèse en identifiant une mutation causant la maladie (G215R) dans le gène ClCN7 dans cette famille danoise. Ceci, et le fait que des mutations dans ce gène ont été trouvées dans les 12 familles ADO II analysées, suggère que l’ADO II est génétiquement homogène.

Nos résultats illustrent également que l’ADO II est allélique avec un sous-ensemble de patients atteints de la forme infantile, autosomique récessive, sévère de l’ostéopétrose. Auparavant, un patient ARO a été décrit comme un hétérozygote composé pour une mutation non sens (Q555X) et une mutation faux sens (R762Q) dans le gène ClCN7 (17). Nous trouvons maintenant une mutation homozygote (L766P) chez un autre patient ARO.

La figure 5 illustre notre corrélation entre les différents génotypes et phénotypes. Comme le démontre le phénotype de la souris knockout ClC-7, la perte complète de la fonction du canal chlorure ClC-7 entraîne une ostéopétrose sévère telle qu’observée chez les patients ARO. Comme les mutations de ClCN7 n’ont été caractérisées que chez deux patients atteints d’OAR à ce jour, il est impossible de savoir si les différences phénotypiques reflètent la nature de leurs mutations. Certains cas rares d’ostéopétrose présentent une forme « intermédiaire ». Dans ces cas, un mode d’hérédité autosomique récessif est proposé mais le phénotype est plus léger que dans l’ORA (7,8). Peut-être que ces cas sont dus à des combinaisons de deux mutations dans ClCN7 qui ne réduisent chacune que légèrement la capacité de conductance du Cl-.

Les mutations ADO II rapportées ici sont principalement des mutations faux-sens impliquant des acides aminés conservés (figures 3 et 4). Les deux mutations restantes sont de petites délétions qui préservent également l’anatomie principale du canal de chlorure, et résultent donc très probablement en des effets comparables aux mutations faux-sens. Comme les canaux de chlorure semblent être organisés en multimères, probablement en dimères (27), ces mutations altèrent probablement leur fonction en raison d’effets négatifs dominants. Avec de tels effets, la plupart des canaux chlorure ne fonctionneront pas, expliquant les anomalies phénotypiques.

En général, les parents des patients ARO sont phénotypiquement normaux. Nous supposons que cela reflète le fait que l’haploinsuffisance pour ce gène ne provoque très probablement pas de complications cliniques ou de résultats radiographiques. Alternativement, dans certains cas, cela peut être dû à la pénétrance réduite de l’OAD II. Les parents du patient ARO présenté dans cette étude ne présentent pas de symptômes cliniques de l’ADO II, mais une étude radiographique n’était pas disponible.

La nature allélique de l’ADO II et de l’ARO est soutenue dans un rapport d’une famille étendue ségrégeant l’ADO II dans laquelle un individu a manifesté l’ARO (28). Peut-être que dans cette famille, un gène ClCN7 muté avec un effet négatif dominant provoque l’OAD II qui coïncide ensuite avec une mutation de novo, ou une mutation héritée du second parent provoquant l’OAR. L’explication proposée pour les formes dominantes et récessives d’ostéopétrose associées aux mutations de ClCN7 est parallèle aux mutations du gène ClC-1 qui provoquent la myotonie. Les mutations entraînant la perte de ClC-1 provoquent la forme autosomique récessive (type Becker) (29) tandis que les mutations faux-sens se manifestent par la forme autosomique dominante moins sévère (type Thomsen) (30).

En conclusion, nous montrons que la plupart, sinon la totalité, des cas d’OAD II sont causés par des mutations du gène ClCN7. D’après la nature des mutations ClCN7, le phénotype ADO II résulte probablement d’un effet négatif dominant. Nos résultats soutiennent l’hypothèse selon laquelle les canaux chlorure agissent généralement en tant qu’homomultimères. En outre, notre étude illustre la nature allélique de l’ADO II et d’un sous-ensemble de cas d’ARO.

MATERIALES ET METHODES

Familles et patients

Les familles A-F ont été décrites précédemment car elles ont été utilisées pour localiser le gène de la maladie d’Albers-Schönberg sur le chromosome 16p13.3 (15). Les échantillons G-L sont issus de personnes atteintes provenant de familles ayant des antécédents de maladie d’Albers-Schönberg et plusieurs ont également été décrits (31-33) (tableau 1).

La famille M vit aux États-Unis mais est d’ascendance chinoise. La proposita est l’enfant d’un couple en bonne santé et est née après une gestation à terme. Les parents sont des cousins au second degré. L’ARO a été diagnostiquée à l’âge de 3 mois lorsqu’elle s’est présentée au centre médical de l’hôpital de New York dans le Queens avec une paralysie de Bell. L’examen radiographique du squelette a révélé une ostéopétrose sévère et plusieurs fractures obliques non déplacées. Elle présentait une anémie, une réticulocytose, une hépatosplénomégalie et une légère atrophie du nerf optique. L’enfant a subi une greffe de moelle allogène dépareillée mais est décédée à l’âge de 18 mois d’une septicémie et d’une insuffisance respiratoire.

Analyse de mutation

L’ADN a été isolé du sang par des procédures standard. Les amorces introns (tableau 2), amplifiant tous les exons codants et les limites intron-exon de ClCN7, ont été conçues à partir de séquences génomiques (GenBank accession nos AL031600 et AL031705). Les 25 exons ont été amplifiés à partir d’ADN génomique Taq-polymerase ou avec le système d’amplificateur PCR (Gibco BRL), avec une concentration d’amplificateur de 1×. Pour toutes les amplifications, 30 cycles ont été effectués à une température spécifiée dans le tableau 2.

Les produits PCR ont été purifiés avec le système de purification Concert Rapid PCR (Life Technologies) et directement séquencés avec les amorces utilisées pour l’amplification, en utilisant la chimie de terminaison Big-Dye (Perkin-Elmer) sur un séquenceur automatique ABI 3100. L’amplification de l’exon 9 a produit un fragment de longueur variable car cet exon suit une répétition en tandem d’une séquence de 50 pb dont le nombre de copies est variable. Dans notre ensemble d’échantillons, le nombre de copies variait entre quatre et sept répétitions. Cette répétition interfère également dans certains échantillons avec le séquençage de cet exon dans le sens direct.

Tous les exons dans lesquels des mutations putatives ont été détectées, ont été séquencés dans 100 chromosomes de contrôle sans trouver les mutations.

ACKNOWLEDGEMENTS

Nous remercions les patients et les familles ainsi que les cliniciens qui ont fourni du matériel. Cette recherche a été soutenue par une subvention (G.0404.00) du ‘Fonds voor Wetenschappelijk onderzoek’ (FWO) à W.V.H. Cette recherche a également été soutenue par des subventions de la ‘Société Française de Rhumatologie’ (SFR), du ‘Fonds d’Etude et de Recherche du Corps Médical des Hôpitaux de Paris’ (FERCMHP) et de l’Hôpital Shriners pour Enfants (no. 8540).