La fonction des protéines chaperonnes dans l’assemblage des complexes protéiques impliqués dans les processus d’adhésion et de fusion des gamètes

Complexes multiprotéiques dans la capacitation des spermatozoïdes et l’interaction ZP

Au moment d’atteindre le site de fécondation, l’ampoule, les spermatozoïdes doivent franchir deux barrières avant de fusionner avec la membrane plasmique de l’ovocyte, ou oolemme. La première est une strate riche en acide hyaluronique de cellules cumulus qui entourent l’ovocyte et la seconde est la matrice extracellulaire de l’ovocyte lui-même, la ZP (Hartmann et al. 1972). Malgré le développement de sites de liaison à la ZP et à l’acide hyaluronique au cours de la spermatogenèse et l’acquisition d’un potentiel de liaison lorsque les spermatozoïdes transitent par l’épididyme, ces cellules ont besoin d’une période distincte de résidence dans l’appareil reproducteur féminin avant de pouvoir participer avec succès à de telles interactions (Austin 1951, Chang 1951). Les changements collectifs que les spermatozoïdes subissent dans cet environnement, appelés capacitation, permettent aux cellules de répondre aux signaux provenant du complexe cumulus-ovocyte et de compléter un processus d’exocytose acrosomique, les rendant compétents pour la fusion avec l’oolemme.

Le ZP est composé d’une suite de sulfoglycoprotéines, à savoir ZP1, ZP2 et ZP3, qui sont hautement conservées dans la plupart des espèces de mammifères (bien qu’un ligand supplémentaire, ZP4/B, ait été signalé dans les ovocytes humains et porcins) (Wassarman et al. 1999, Lefievre et al. 2002, Yonezawa et al. 2012). Il est généralement admis que ces ligands régissent la liaison des spermatozoïdes chez la plupart des espèces (voir également Reid et al. (2011)). Cependant, il est remarquable que différents modèles soient encore à l’étude concernant l’identité du récepteur primaire des spermatozoïdes dans la ZP et les mécanismes par lesquels les spermatozoïdes adhèrent à cette matrice (voir également Visconti & Florman (2010)). De même, les recherches sur l’identité du ou des récepteurs correspondants de la surface des spermatozoïdes qui reconnaissent le ou les ligands appropriés sur la ZP n’ont pas non plus apporté de réponses définitives. En effet, il existe une littérature croissante sur les knockouts murins de protéines réceptrices candidates prometteuses (y compris la β-1,4-galactosyltransférase (GALT1), l’arylsulfatase A (ARSA) et la molécule d’adhésion des spermatozoïdes 1 (SPAM1) ; pour une liste complète, voir Ikawa et al. (2010)) qui n’entraînent pas tous une infertilité complète (Hess et al. 1996, Asano et al. 1997, Baba et al. 2002). Au contraire, divers degrés de réduction de la capacité de liaison sont présentés, ce qui soulève la possibilité que ce processus englobe un certain degré de redondance fonctionnelle et qu’un certain nombre de protéines spermatiques agissent de concert pour médier l’adhésion des ZP. La coordination de l’activité de ces protéines pour assurer des interactions ZP productives est donc en train d’émerger comme un axe de recherche important.

Dans la plupart des mammifères euthériens, on pense que la capacitation des spermatozoïdes est initiée par l’activation d’une voie médiée par l’AMPc qui aboutit à la phosphorylation de la tyrosine de plusieurs protéines du sperme (Visconti et al. 1995a, 1995b, Leclerc et al. 1996). Les chaperons moléculaires figurent en bonne place parmi cette série de protéines, HSP90AA1, HSP90B1 et HSPD1 étant parmi les protéines qui présentent une phosphorylation de la tyrosine à la suite de la capacitation (Ecroyd et al. 2003, Asquith et al. 2004). Les modèles actuels suggèrent que la phosphorylation de ces chaperons pendant la capacitation déclenche leur rôle actif dans l’assemblage des protéines de reconnaissance ZP en complexes et/ou la translocation de ces complexes à la surface des spermatozoïdes en préparation de la fertilisation (Ecroyd et al. 2003, Asquith et al. 2004, Nixon et al. 2005, Gadella 2008). En plus de ce rôle indirect dans l’adhésion des gamètes, les chaperons de surface des spermatozoïdes ont également des fonctions présumées en tant que molécules d’adhésion qui médient la reconnaissance des sulfoglycolipides pendant la liaison des gamètes (Boulanger et al. 1995, Mamelak & Lingwood 2001).

Récemment, la technique de PAGE native bleue (BN-PAGE), qui a été initialement développée pour l’analyse des complexes multienzymes de la chaîne de transport d’électrons (Schägger & von Jagow 1991, Schägger et al. 1994), a été adaptée pour l’évaluation des complexes multimériques de surface des spermatozoïdes chez la souris et l’homme (Dun et al. 2011, Redgrove et al. 2011). Cette technique permet la résolution électrophorétique de complexes protéiques natifs qui conservent leur activité biologique. Dans les spermatozoïdes humains et de souris, l’utilisation de la BN-PAGE en parallèle avec le Far-West blotting avec des zonas entiers solubilisés a révélé plusieurs complexes multiprotéiques primaires qui possèdent une affinité pour les ZP homologues (Dun et al. 2011, Redgrove et al. 2011).

Un de ces complexes a été signalé comme comprenant les composants protéiques du complexe CCT/TRiC (CCT1-CCT8), une structure à double anneau qui fonctionne comme un chaperon moléculaire avec un rôle clé dans la régulation de la formation de complexes multiprotéiques (Feldman et al. 1999, Guenther et al. 2002). Des preuves putatives sous la forme de tests de co-immunoprécipitation, de co-localisation et de ligature de proximité ont identifié la protéine de liaison ZP 2 (ZPBP2) comme l’une des protéines clientes les plus convaincantes pour le complexe CCT/TRiC dans les spermatozoïdes matures (Dun et al. 2011, Redgrove et al. 2011). Impliquée à l’origine dans la liaison secondaire des ZP, une étude plus récente a montré que les souris mâles dépourvues de ZPBP2 sont infécondes et présentent des défauts d’interaction et de pénétration des ZP (Lin et al. 2007). Chez la souris, il existe des preuves supplémentaires que certaines sous-unités du complexe CCT/TRiC sont transloquées à la surface des spermatozoïdes pendant la capacitation des spermatozoïdes (Dun et al. 2011).

Une autre classe importante de chaperons qui a été identifiée à la surface des spermatozoïdes et impliquée dans la régulation des interactions ZP est la famille HSP70 (Naaby-Hansen et al. 2010). Comme pour le complexe CCT/TRiC, les chaperons de la famille HSP70 ont également des rôles bien documentés dans la facilitation à la fois du transport des protéines transmembranaires et de l’assemblage de complexes protéiques stables (Mayer & Bukau 2005). Un membre de la famille HSP70 qui présente une expression exclusive (souris) ou prédominante (homme) dans les testicules semble être essentiel à la fertilité masculine. En effet, l’expression aberrante de cette chaperonne, HSPA2, a été corrélée à un phénotype d’infertilité masculine sévère chez l’homme, affectant spécifiquement la capacité des spermatozoïdes à interagir avec les ovocytes homologues in vitro (Eddy 1999, Huszar et al. 2007). Chez la souris comme chez l’homme, HSPA2 joue un rôle fondamental dans la spermatogenèse, la délétion ciblée de la protéine chez la première espèce entraînant un arrêt précoce de ce processus et une absence concomitante de spermatozoïdes (Eddy 1999). Chez l’homme, les niveaux d’expression de HSPA2 ont été positivement corrélés avec le succès de la fécondation in vitro (Huszar et al. 2000, 2006, Cayli et al. 2003) et sont donc prétendument capables de prédire le statut de fertilité des hommes avec un haut degré de précision (Ergur et al. 2002).

La caractérisation de HSPA2 dans notre propre laboratoire a révélé que ce chaperon est présent dans le domaine acrosomal des spermatozoïdes humains et qu’il est un composant d’au moins cinq complexes protéiques de masse moléculaire élevée (Redgrove et al. 2012), y compris un sous-ensemble de ceux qui ont montré précédemment qu’ils possédaient une affinité ZP (Redgrove et al. 2011). Conformément à ces données, nous avons obtenu la preuve que le plus dominant des complexes HSPA2 contient deux protéines supplémentaires, qui ont toutes deux été précédemment impliquées dans les interactions sperme-zona (Redgrove et al. 2012). En outre, en accord avec les résultats publiés par Huszar et al. nous avons pu démontrer une réduction significative des niveaux de HSPA2 dans les spermatozoïdes des hommes présentant des lésions isolées dans leur capacité à s’engager dans des interactions avec les ZP des ovocytes homologues in vitro (Redgrove et al. 2012). Nos travaux actuels se concentrent sur la question de savoir si le déficit d’adhésion aux ZP résulte soit d’une formation aberrante des sites de liaison des ZP dans les premiers stades de la spermiogenèse (Huszar et al. 2000), soit peut être le résultat de l’incapacité de HSPA2 à participer aux événements de remodelage de la surface des spermatozoïdes pendant la capacitation, tels que la facilitation de l’assemblage et/ou de la présentation des récepteurs ZP sur la surface des spermatozoïdes en préparation de l’interaction avec les ZP.

En plus de nos propres travaux sur l’assemblage des complexes de surface des spermatozoïdes, Han et al. ont indépendamment identifié un complexe multiprotéique alternatif chargé de chaperons à la surface des spermatozoïdes de souris. De manière intéressante, comme documenté ci-dessus, ce complexe, comprenant HSPA5, calnexin, protéine de membrane intégrale 2B, et ADAM7, est apparemment assemblé pendant la capacitation (Han et al. 2011). Bien que la fonction de ce complexe n’ait pas encore été entièrement élucidée, l’expression d’ADAM7 a été liée à la présence d’autres protéines ADAM, ADAM2 et ADAM3 (Kim et al. 2006), qui sont importantes pour l’adhésion des spermatozoïdes à la ZP (Muro & Okabe 2011). En outre, il est connu que HSPA5 est impliqué dans la promotion de l’adhésion des spermatozoïdes de haute qualité aux cellules épithéliales de l’oviducte (OEC) dans l’isthme de l’appareil reproducteur féminin. On pense que la formation de ce réservoir a des effets pro-survivants en termes de maintien des spermatozoïdes dans un état non captif et quiescent en préparation de la libération de l’ovocyte dans l’ampoule (Topfer-Petersen et al. 2002). De manière intéressante, les chaperons HSPD1 et HSPA5 ont également été localisés à la surface des OEC bovines et ont donc été impliqués dans la liaison sperme-OEC (Boilard et al. 2004).

En accord avec nos propres travaux, le complexe identifié par Han et al. a été montré pour résider dans des microdomaines membranaires ou des radeaux lipidiques, des régions spécialisées de la membrane qui fournissent une plate-forme pour l’assemblage fonctionnel et la présentation de complexes multiprotéiques (Stein et al. 2006, Nixon et al. 2009, Han et al. 2011). Le cloisonnement des complexes chaperons dans l’environnement des radeaux a également été observé pour HSPA2 dans les spermatozoïdes humains (Nixon et al. 2011) et pour les composants du complexe CCT/TRiC dans les spermatozoïdes de souris (Dun et al. 2011). Ces domaines membranaires comprennent également un certain nombre d’autres protéines réceptrices putatives de ZP, notamment GALT1, ZP3R et SPAM1, ce qui renforce leur rôle dans le remodelage de la surface des spermatozoïdes et dans la fixation des ZP (Fig. 1 ; Nixon et al. 2009, Asano et al. 2010). Le ou les mécanismes par lesquels ces protéines sont recrutées dans les radeaux lipidiques ne sont pas encore résolus ; cependant, il a été rapporté que HSPA2 se lie via son domaine ATPase au 3′sulfogalactosylglycérolipide, la principale glycoprotéine identifiée au sein des radeaux lipidiques des spermatozoïdes (Mamelak & Lingwood 2001).

En plus du rôle putatif des radeaux lipidiques dans le repositionnement des complexes chaperons clés et des protéines réceptrices ZP, il existe également des preuves convaincantes que de nombreux récepteurs ZP putatifs, tels que ARSA et ZP3R, ainsi que plusieurs chaperons moléculaires se déplacent, en fonction de la capacitation, de sites intracellulaires tels que l’acrosome vers la surface des spermatozoïdes afin de préparer les cellules avant leurs interactions avec le ZP (Nixon et al. 2009). Il a été proposé que le contact intime entre la membrane acrosomique externe et la membrane plasmique du sperme soit médié par la liaison de protéines SNARE (soluble N-ethylmaleimide-sensitive factor attachment protein receptor) complémentaires, conduisant à la formation de pores de fusion qui fournissent une voie pour la migration des enzymes vers la surface du sperme avant la perte complète du contenu acrosomique (Søgaard et al. 1994, Blas et al. 2005, Tsai et al. 2007). À l’appui de ce modèle, une étude de Brahmaraju et al. (2004) a démontré que l’administration d’anticorps contre VAMP et SNAP dans la vésicule acrosomique inhibait la liaison sperme-ZP chez la souris.

Cette amorce progressive de la surface du sperme a soulevé des questions concernant la nature tout ou rien de l’exocytose acrosomique. Néanmoins, l’assemblage fonctionnel des complexes SNARE semble également sous-tendre les événements de fusion prolongée de la membrane du sperme qui permettent une perte complète du contenu acrosomal (Tsai et al. 2010). Bien qu’il soit largement admis que le contact avec la ZP initie cette exocytose acrosomique chez la plupart des espèces de mammifères, un certain nombre d’études réalisées chez la souris ont démontré que les spermatozoïdes qui commencent l’exocytose acrosomique avant le contact avec la ZP sont encore capables de féconder l’ovocyte (Nakanishi et al. 1999, Jin et al. 2011). Ce phénomène peut également être vrai pour les spermatozoïdes de cobaye (Huang et al. 1981) et de hamster (Yanagimachi & Phillips 1984). De tels résultats suggèrent un rôle important de l’oophorus cumulus dans l’initiation de la réaction acrosomique et soulèvent des inquiétudes quant à la capacité des études in vitro réalisées avec des structures de zona ovocytaire dénudées par le cumulus à rendre compte avec précision de la véritable nature de la réaction acrosomique et même de l’interaction ZP.

Malgré cette controverse, des molécules de type chaperon ont également été impliquées dans l’exocytose acrosomique en vertu de leur capacité à favoriser l’assemblage de SNARE contenant de la glutamine (Q-SNARE) et de SNARE contenant de l’arginine (T-SNARE) en complexes ternaires serrés (Tomes et al. 2002, Sørensen 2005). Il est intéressant de noter que des études élégantes menées chez le porc ont démontré que la capacitation induit un amarrage stable de la membrane plasmique des spermatozoïdes avec la membrane acrosomique externe en vue de la fécondation (Tsai et al. 2010). Des études plus récentes menées par Tsai et al. (2012) ont également fourni des preuves de la présence de vésicules mixtes unilamellaires qui, entre autres fonctions importantes, permettent le recrutement de protéines secondaires de liaison ZP à la surface des spermatozoïdes et possèdent un nouveau complexe SNARE trimérique composé de syntaxine 3, SNAP23, VAMP2 et d’une protéine supplémentaire, la complexine 2. L’énergie libérée par la formation de ces complexes est à son tour utilisée pour initier la fusion membranaire en rapprochant la membrane plasmique et la membrane acrosomique interne du spermatozoïde (Tomes et al. 2002). L’achèvement de ce processus est critique pour l’exposition des domaines du spermatozoïde qui participent aux événements en aval de la fécondation : la liaison et la fusion de l’oolemme.