Dans cette étude, nous avons émis l’hypothèse que différentes méthodes d’isolement de l’ARN auront un impact sur les résultats lors de l’analyse de l’expression des gènes dans les tissus. Les méthodes d’extraction de l’ARN peuvent être largement caractérisées en extraction phénol:chloroforme suivie d’une précipitation à l’alcool (TRIzol), phénol:chloroforme suivie d’une extraction en phase solide (sur colonne ; miRVana et miRNeasy) et séparation en phase solide avec/sans résine d’affinité (Norgen total et Isolate II). Ces méthodologies ont été principalement développées pour l’extraction de longs ARNm et sont basées sur l’hypothèse que tous les ARN sont purifiés de manière égale. En outre, le choix d’une méthode d’extraction d’ARN particulière doit tenir compte d’un certain nombre de facteurs, tels que la qualité, la quantité, le prix et la facilité d’utilisation (temps d’extraction). Ici, nous présentons des données qui montrent que la méthode utilisée pour extraire l’ARN produira également des résultats variables par rapport aux différentes méthodes dans les applications en aval et constitue donc une autre considération importante.
Cette étude démontre que les méthodes d’isolement de l’ARN varient en termes de quantité et de qualité des échantillons d’ARN, et dans l’analyse de l’expression des miRNA et des gènes cibles. Nous avons choisi des organes qui peuvent être difficiles à isoler de l’ARN pour différentes raisons. Par exemple, on constate souvent que l’isolement de l’ARN du cerveau donne de faibles rendements en raison de sa forte teneur en lipides. Cela était particulièrement évident avec le kit Bioline Isolate II. Le protocole du fabricant suggère de purifier jusqu’à 5 μg d’ARN à partir de 10 mg de cerveau de rat/souris. Cependant, le manuel miRNeasy suggère que 5 à 20 μg d’ARN devraient être réalisables à partir du cerveau avec la même quantité de matériel d’entrée. Le dépannage sur le site Web du fabricant décrit qu’un problème avec les tissus riches en lipides est le colmatage de la colonne et suggère de diminuer la quantité d’échantillon ou d’augmenter le volume du tampon de lyse. Nos extractions ont été effectuées dans les limites suggérées par le protocole. Par la suite, ils suggèrent de réaliser une pré-extraction en utilisant le réactif TRIsure (l’équivalent de TRIzol chez Bioline) puis une séparation sur colonne avec le kit pour nettoyer la phase aqueuse. Cette méthode serait alors comparable aux méthodes d’extraction d’ARN miRVana et miRNeasy et pourrait donner de meilleurs rendements pour ce tissu. De plus, la qualité de l’ARN est corrélée aux réponses spécifiques des tissus au stress physiologique avant et après la mort des tissus. Les tissus tels que le poumon et le foie présentent généralement des RIN faibles et un petit pic 28S car ces tissus sont sujets à une dégradation plus rapide de l’ARN par des niveaux élevés de nucléases. Pour inactiver les nucléases, le tissu est rapidement congelé et la décongélation est empêchée jusqu’à ce que le matériel pesé soit ajouté au tampon d’extraction. Bien que la décongélation des tissus ait été empêchée, nous ne pouvons pas exclure que le temps écoulé entre l’euthanasie de l’animal et l’excision des organes et la congélation rapide soit un facteur contribuant aux faibles valeurs globales de RIN et à certains produits de dégradation observés pour tous les échantillons de poumon, quel que soit le kit d’isolement utilisé. Une méthode alternative pour inactiver les nucléases consiste à utiliser une solution stabilisatrice d’ARN telle que le RNAlater (ThermoFisher Scientific), qui permet de traiter ultérieurement les échantillons de tissus non congelés. Cette solution peut contribuer à garantir l’intégrité de l’ARN, mais elle n’est pas compatible avec toutes les procédures d’isolement de l’ARN et les utilisateurs doivent vérifier leur méthode spécifique avant de procéder aux extractions. L’ajout d’un pic après 60 s dans certains échantillons dans l’analyse du Bioanalyser suggère une contamination par l’ADNg. Un traitement supplémentaire à la DNase peut être effectué sur les colonnes avec certains kits, mais une étape d’élimination de l’ADNg est fortement recommandée pendant l’étape de transcription inverse. L’inclusion de cette étape dans nos méthodes peut expliquer pourquoi il n’y a pas eu d’interférence lors de l’analyse de l’expression de l’ARNm des échantillons pulmonaires de Norgen, mais elle a eu un impact sur l’analyse de l’expression de l’ARNm car le protocole de dosage de l’ARNm Taqman ne comprend pas l’élimination de l’ADNg. En outre, la pureté des échantillons d’ARN est un facteur critique car même si les échantillons avec un RIN > 7 devraient fonctionner correctement dans la plupart des applications en aval, ceux qui impliquent des réactions enzymatiques comme la qPCR peuvent être inhibés par des nucléases, des ions métalliques ou des contaminants organiques. En général, les échantillons d’ARN de Bioline Isolate II présentaient des rapports 260/230 plus faibles et les contaminants pourraient contribuer à ses mauvaises performances. Enfin, des différences ont été observées dans l’enrichissement des miRNA dans la préparation d’ARN total. Comme les miARN représentent une petite fraction du répertoire global d’ARN, il peut être difficile de déterminer leur contribution à partir de l’analyse d’intégrité. Le test Qubit microRNA offre une détection hautement sélective de faibles quantités de petits ARN, même en présence de contaminants courants. Des pourcentages élevés de miRNA ont été couramment détectés avec les méthodes d’extraction miRVana et Norgen, cependant, étant donné l’analyse d’intégrité des préparations d’ARN total Norgen, il est possible que l’enrichissement en miRNA soit surestimé car des fragments d’ARN plus petits sont détectés suite à la dégradation ou à l’oxydation d’ARN plus grands (ARNm, ARNr ou ARNt) ou, dans le cas des échantillons pulmonaires, une contamination par l’ADN perturbant les résultats du Qubit. Par conséquent, la quantité, la qualité et la pureté des échantillons d’ARN sont des facteurs très importants pour choisir une méthode d’extraction d’ARN particulière et des recherches supplémentaires pour savoir comment optimiser ces méthodes pour votre tissu d’intérêt peuvent aider à les améliorer.
Le profilage des miARN peut donner un aperçu en tant que biomarqueurs pour des applications de diagnostic ou de pronostic. Par exemple, des panels de miRNA peuvent être utilisés pour classer différents phénotypes de cancer, prédire la récidive ou la réponse aux thérapies . Cependant, pour la découverte et l’application clinique de biomarqueurs à base de miARN, il est nécessaire d’optimiser et de normaliser les pratiques d’extraction de l’ARN afin d’éviter des résultats contradictoires. Par exemple, une méta-analyse de 63 études publiées par Zhou et al. (2014) a trouvé des résultats incohérents et même contrastés lors de l’évaluation de la valeur pronostique de l’oncomiR, miR-21 . Les auteurs attribuent l’hétérogénéité aux différences dans la source des échantillons, les méthodes de détection et les méthodes de normalisation, mais n’ont pas fait allusion aux méthodes d’extraction de l’ARN, dont nous montrons qu’elles contribuent également.
Les fonctions biologiques et les cibles de très peu de miRNA ont été validées expérimentalement, mais cela est essentiel pour réaliser le potentiel de la thérapie basée sur les miRNA. De plus, la découverte des fonctions biologiques spécifiques aux tissus aidera à identifier leur action thérapeutique et les effets hors-cible potentiels dans les tissus normaux. La validation des interactions entre les miARN et les ARNm est principalement réalisée dans des essais de culture cellulaire, qui impliquent une manipulation artificielle des miARN endogènes. Cependant, les niveaux atteints par la manipulation de la culture cellulaire (par exemple, la transfection de mimiques) ne sont généralement pas aux niveaux physiologiques observés in vivo ; il est donc important de récapituler les résultats dans des modèles animaux appropriés. Actuellement, aucun rapport n’a directement comparé la détection des miRNA et des gènes cibles à partir d’échantillons d’ARN total utilisant différentes méthodes d’extraction. Nous montrons que les méthodes d’extraction de l’ARN diffèrent dans leur efficacité à isoler à la fois les ARN courts et longs et, par conséquent, une réflexion approfondie doit être menée pour choisir une méthode appropriée si vous souhaitez détecter les deux à partir du même échantillon.
Les recherches antérieures ont généralement supposé que tous les types d’ARN sont purifiés de la même manière. Cependant, plusieurs rapports ont émergé indiquant des différences d’efficacité d’extraction en fonction de la méthode utilisée pour l’isolement de l’ARN. Kim et al. (2011) ont rétracté leur article dans Molecular Cell, car ils ont découvert que leurs conclusions sur les différences d’expression des miARN à partir de cellules cultivées à différentes confluences (haute densité contre basse densité) et lorsqu’elles étaient détachées de la boîte de culture (adhérentes contre en suspension) étaient en fait expliquées par les différences d’efficacité d’extraction de l’ARN en utilisant la méthode TRIzol. Ils ont découvert que les miARN à faible teneur en GC et à structure secondaire stable étaient perdus pendant l’extraction, plutôt que d’être dégradés dans les cellules comme ils l’avaient initialement publié. Les résultats antérieurs d’El-Khoury et al. (2016) ont révélé des différences dans la récupération des miARN à partir des cellules, du plasma et des exosomes dérivés de l’urine/du plasma en comparant les kits d’extraction TRIzol LS, miRNeasy sérum/plasma et miRCURY biofluid . Les auteurs ont constaté que le kit miRCURY isolait un ARN très pur mais récupérait mal les miRNA, TRIzol produisait un ARN de faible pureté qui avait un impact sur l’efficacité de la PCR, tandis que miRNeasy produisait un ARN de mauvaise qualité mais était le plus performant pour la détection des miRNA. De même, McAlexander et al. (2013) ont trouvé des différences dans l’extraction des miRNA du plasma et du liquide céphalo-rachidien. Ils ont comparé les extractions de miRVana, du kit miRCURY Cell and Plant et du TRIzol LS avec et sans glycogène comme support. miRVana était similaire avec ou sans glycogène, tandis que miRCURY sans glycogène avait une récupération de miRNA légèrement inférieure à miRVana. Cependant, le glycogène a grandement amélioré la récupération du miRNA avec le kit miRCURY mais a exacerbé le faible rendement et la variabilité avec l’extraction TRIzol. Ils ont ensuite comparé le kit miRCURY Cell and Plant à miRCURY Biofluids et aux méthodes d’extraction de sérum/plasma miRNeasy avec du glycogène comme support et ont trouvé que miRCURY Biofluids avait l’abondance relative la plus élevée de miRNA exogène dopé et ont conclu que c’était la méthode supérieure pour leur application particulière. Collectivement, ces études soulignent les différences dans la récupération de l’ARN en utilisant différentes méthodes d’extraction et suggèrent la nécessité d’optimiser pour votre cellule, tissu, et/ou fluide d’intérêt.
Il y a plusieurs étapes au cours du flux de travail qui peuvent introduire une variation expérimentale. En commençant par la méthode de fixation ou de congélation du tissu, le stockage du matériel, la méthode d’extraction de l’ARN, la méthode utilisée pour la transcription inverse et l’amplification qPCR ou d’autres plateformes en aval. Dans cette étude, nous avons tenté de contrôler certaines de ces variables en congelant rapidement les tissus, en les stockant à – 80 °C, en empêchant la décongélation avant l’extraction et en utilisant les pratiques les plus recommandées pour l’analyse de l’expression des miRNA. Par exemple, l’utilisation d’amorces RT spécifiques à la séquence par opposition à une amorce RT universelle s’est avérée supérieure pour l’amplification de produits spécifiques. La qPCR est considérée comme l’étalon-or pour l’analyse de l’expression des miRNA et des cibles en raison de sa sensibilité et de sa spécificité par rapport aux plateformes de profilage globales. Il est important de noter que la qualité des résultats obtenus est plus importante que le simple nombre de miRNA profilés par les grandes plateformes basées sur le séquençage. En outre, bien que nous n’ayons pas comparé l’effet de l’enrichissement en miRNA de nos échantillons d’ARN, des rapports antérieurs l’ont déconseillé, en particulier pour les plateformes de profilage global de miRNA. Par exemple, Redshaw et al. (2013) ont constaté que la procédure d’enrichissement de l’ARN court entraîne une diminution significative des niveaux relatifs de miRNA lorsqu’on compare l’ARN total et le matériel enrichi. Plus précisément, la procédure d’enrichissement réduit le nombre de copies de miRNA jusqu’à 25 % de celui présent dans les échantillons pré-enrichis et cette perte varie pour différentes séquences de miRNA. Par conséquent, les données sur les miARN provenant de préparations d’ARN totaux et courts peuvent ne pas être directement comparables. En outre, il a été suggéré que l’ARN plus grand peut agir comme un transporteur pour les petits ARN. Il reste à déterminer si des méthodes enrichies en miRNA pour toutes les entreprises permettraient une meilleure récupération des tissus. Bien que Bioline suggère un kit séparé pour l’isolement des miRNA, nous avons utilisé le kit d’ARN total Isolate II pour comparer directement avec les autres méthodes d’extraction car le kit spécifique aux miRNA ne permet pas d’isoler à la fois les ARN courts et longs à partir de la même élution. Les espèces de miRNA sont plutôt enrichies et isolées en premier, puis les ARN longs peuvent être extraits ensuite, ce qui donne deux fractions séparées. Bien que l’Isolate II ne soit pas optimisé pour isoler les petits ARN comme les kits miRVana ou miRNeasy, il n’était pas non plus supérieur pour l’expression du gène cible. Compte tenu de l’écart important entre certains kits, les chercheurs devraient opter pour une méthode d’extraction plus robuste.