Comment fonctionne la chromatographie par échange d’ions ?

La chromatographie par échange d’ions (IEX) est une technique couramment utilisée pour la purification des biomolécules. Elle implique la séparation des molécules sur la base de leur charge.

Cette technique exploite l’interaction entre les molécules chargées dans un échantillon et les fractions de charge opposée dans la phase stationnaire de la matrice chromatographique. Ce type de séparation est difficile à réaliser avec d’autres techniques car la charge est facilement manipulée par le pH du tampon utilisé.

Deux types de séparation par échange d’ions sont possibles – l’échange de cations et l’échange d’anions. Dans l’échange d’anions, la phase stationnaire est chargée positivement tandis que dans l’échange de cations, elle est chargée négativement.

Principe de la chromatographie par échange d’ions

La chromatographie par échange d’ions est utilisée dans la séparation des biomolécules chargées. L’échantillon brut contenant des molécules chargées est utilisé comme phase liquide. Lorsqu’il traverse la colonne chromatographique, les molécules se lient à des sites de charge opposée dans la phase stationnaire.

Les molécules séparées sur la base de leur charge sont éluées en utilisant une solution de force ionique variable. En faisant passer une telle solution à travers la colonne, une séparation hautement sélective des molécules en fonction de leurs différentes charges a lieu.

La technique

Les étapes clés de la procédure de chromatographie par échange d’ions sont énumérées ci-dessous :

• Un échantillon de protéines impur est chargé dans la colonne de chromatographie par échange d’ions à un pH particulier.
• Les protéines chargées se lieront aux groupes fonctionnels de charge opposée dans la résine
• Un gradient de sel est utilisé pour éluer les protéines séparées. A de faibles concentrations en sel, les protéines ayant peu de groupes chargés sont éluées et à des concentrations en sel plus élevées, les protéines ayant plusieurs groupes chargés sont éluées.
• Les protéines indésirables et les impuretés sont éliminées par lavage de la colonne.

Un gradient de pH peut également être appliqué pour éluer les protéines individuelles sur la base de leur point isoélectrique (pI) c’est-à-dire le point auquel les acides aminés d’une protéine portent une charge neutre et donc ne migrent pas dans un champ électrique. Les acides aminés étant des composés ioniques zwitter, ils contiennent des groupes ayant des charges positives et négatives. En fonction du pH de l’environnement, les protéines portent une charge positive, négative ou nulle. À leur point isoélectrique, elles n’interagissent pas avec les fragments chargés de la résine de la colonne et sont donc éluées. Un gradient de pH décroissant peut être utilisé pour éluer les protéines à l’aide d’une résine échangeuse d’anions et un gradient de pH croissant peut être utilisé pour éluer les protéines des résines échangeuses de cations. En effet, en augmentant le pH de la phase mobile, la protéine devient moins protonée (moins chargée positivement) et ne peut donc pas former d’interaction ionique avec la résine chargée négativement, ce qui permet l’élution. Inversement, la diminution du pH de la phase mobile fait que la molécule devient plus protonée (moins chargée négativement_, permettant son élution.

Sélection des résines en chromatographie par échange d’ions

Les résines échangeuses d’ions ont des groupes fonctionnels chargés positivement ou négativement liés de manière covalente à une matrice solide. Les matrices sont généralement constituées de cellulose, de polystyrène, d’agarose et de polyacrylamide. Certains des facteurs qui influencent le choix de la résine sont l’échangeur d’anions ou de cations, le débit, l’échangeur d’ions faible ou fort, la taille des particules de la résine et la capacité de liaison. La stabilité de la protéine d’intérêt dicte la sélection d’un échangeur d’anions ou de cations – l’un ou l’autre échangeur peut être utilisé si la stabilité n’est pas préoccupante.

Les applications de la chromatographie par échange d’ions

L’échange d’ions est la méthode chromatographique la plus largement utilisée pour la séparation et la purification de biomolécules chargées telles que les polypeptides, les protéines, les polynucléotides et les acides nucléiques. Sa large applicabilité, sa grande capacité et sa simplicité, ainsi que sa haute résolution sont les principales raisons de son succès en tant que méthode de séparation. La chromatographie d’échange d’ions est largement utilisée dans plusieurs applications industrielles dont certaines sont les suivantes :

• Séparation et purification des composants sanguins tels que l’albumine,les facteurs de croissance recombinants et les enzymes.
• Biotechnologie – Applications analytiques telles que le contrôle de la qualité et la surveillance des processus
• Recherche alimentaire et clinique – pour étudier les variétés de blé et la corrélation de la protéinurie avec différentes maladies rénales.
• Fermentation – Les résines échangeuses de cations sont utilisées pour surveiller le processus de fermentation pendant la production de ß-galactosidase.

Lecture complémentaire

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• Vue d’ensemble de la chromatographie
• Applications de la chromatographie gazeuse-spectrométrie de masse (CG-SM)
• Chromatographie liquide haute performance (CLHP)
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Citations

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