Citrobacter freundii fitness pendant l’infection de la circulation sanguine

Collection d’isolats de Citrobacter BSI

Par rapport aux autres espèces Gram-négatives qui causent régulièrement des BSI, des informations limitées sont disponibles concernant la physiologie de C. freundii dans l’environnement de l’hôte. Dans le but de combler cette lacune, nous avons d’abord recueilli huit isolats appartenant au complexe C. freundii auprès de patients atteints de BSI au sein du système de santé de l’Université du Michigan. La phylogénie basée sur l’ARN ribosomal est capable de distinguer trois groupes d’espèces de Citrobacter, dont le groupe I comprend au moins huit espèces et inclut C. freundii23,24. Cependant, les approches d’identification basées sur la séquence de l’ARNr 16S et la spectrométrie de masse offrent une résolution phylogénétique limitée au sein de ce groupe d’espèces de Citrobacter. Par conséquent, les isolats utilisés dans cette étude ont été évalués plus en détail en utilisant une approche d’analyse de séquence multilocus. Parmi les huit isolats collectés, six se sont rapprochés des souches établies de C. freundii (Fig. 1) et présentaient une identité nucléotidique moyenne de >98% avec la souche type ATCC 8090, ce qui est supérieur au seuil de 95% généralement accepté pour les isolats de la même espèce. Parmi les deux isolats restants, UMH17 s’est regroupé le plus étroitement avec la souche type Citrobacter pasteurii CIP 55.13 et UMH18 avec les souches Citrobacter werkmanii.

Bactériémie de C. freundii

Avant d’étudier les exigences de fitness de Citrobacter pendant le BSI, un modèle murin de bactériémie a été développé sur la base de travaux antérieurs avec d’autres espèces entériques25. Parmi les isolats de Citrobacter BSI, les souches UMH14 et UMH15 ont été choisies comme candidates pour être utilisées dans cette étude. L’isolat UMH14 a présenté une colonisation dose-dépendante plus cohérente de la rate et du foie 24 heures après l’injection dans la veine de la queue (Fig. S1) et a été sélectionné pour une caractérisation plus approfondie. Il était également nécessaire de tester le modèle d’infection pour détecter les goulots d’étranglement potentiels de la colonisation avant d’évaluer la contribution des gènes individuels de C. freundii à la valeur adaptative en utilisant une large collection de mutants transposons. Un mutant spontané de UMH14 résistant à l’acide nalidixique (UMH14Nal) a été isolé et il a été déterminé qu’il présentait une aptitude in vitro équivalente pendant la co-culture avec la souche parente dans un milieu riche (Fig. S2). Pour déterminer si une population diverse de mutants pouvait être établie dans la circulation sanguine sans perte stochastique de clones individuels, les souches UMH14Nal et UMH14 ont été mélangées à différents ratios et inoculées à des souris. Après 24 heures, des ratios allant jusqu’à 1:10 000 (UMH14Nal:UMH14) ont été tolérés sans perte spontanée de la souche sous-représentée dans la rate (figure S2), ce qui indique qu’une seule souris pourrait accueillir au moins 10 000 mutants transposon uniques à une dose totale de 5 × 107 bactéries en utilisant ce modèle.

Pour identifier les gènes d’aptitude de Citrobacter dans le modèle de bactériémie, cinq pools de mutants d’insertion de transposons aléatoires représentant >44 000 sites d’insertion uniques ont été injectés à des souris et les bactéries colonisant la rate ont été récupérées après 24 heures (Fig. S3). L’abondance relative des mutants transposon individuels dans l’inoculum et les sorties spléniques, telle que déterminée par le séquençage à haut débit, a été utilisée pour identifier les gènes qui contribuent à la survie des bactéries dans le modèle. Un total de 177 gènes perturbés par le transposon ont conféré une perte significative de fitness et neuf gènes ont été associés à une augmentation du fitness bactérien lorsqu’ils ont muté (fold-change ≥2,0, Adj. P < 0,05) (Données S1). Une deuxième analyse avec cet ensemble de données a identifié 546 gènes essentiels putatifs codés par le chromosome pour lesquels le nombre de lectures dans la population d’entrée était significativement plus faible que prévu sur la base des sites TA disponibles et de la taille de la population de la bibliothèque (logFC <-5,17) (Données S2). En utilisant ce modèle d’infection opportuniste et systémique, il était prévu que la majorité des facteurs d’aptitude identifiés représenteraient des processus physiologiques fondamentaux plutôt que des facteurs de virulence prototypiques (par exemple, des toxines protéiques ou des adhésines). En effet, la catégorisation des 177 gènes associés à des défauts d’aptitude significatifs par groupes orthologues (COG) a reflété la prédominance des voies métaboliques et des fonctions de maintenance cellulaire requises pendant la bactériémie de C. freundii (Fig. 2). Environ la moitié des gènes d’aptitude identifiés correspondent globalement à cinq catégories COG englobant la production d’énergie, le métabolisme des acides aminés, la réplication et la réparation de l’ADN, la traduction et la biogenèse de la paroi cellulaire et de la membrane.

Validation des mutants de gènes d’aptitude individuels

La contribution des produits de gènes individuels à l’aptitude de C. freundii a été confirmée avec des mutations de délétion-insertion indépendantes construites dans des gènes UMH14 sélectionnés (tableau 1). Toutes les souches modifiées rapportées ici n’avaient pas de défauts de réplication grossiers comme déterminé par la croissance en milieu riche (Fig. S4). Pour chaque gène énuméré dans le tableau 1, l’aptitude a été mesurée en co-infectant les mutants individuels avec la souche parentale UMH14. Cinq des sept mutants initialement testés ont présenté un désavantage compétitif statistiquement significatif dans la rate ou le foie (Fig. 3A), confirmant ainsi les résultats du criblage de transposons. Le mutant znuB a été choisi comme témoin négatif pour la validation ici, car les résultats du criblage de transposons indiquaient qu’aucun défaut d’aptitude n’était associé à ce gène, malgré les preuves provenant d’autres espèces bactériennes démontrant la contribution du système de transport du zinc ZnuABC à l’infection murine26,27,28. En compétition avec UMH14, le mutant znuB n’a pas présenté de défaut d’aptitude significatif, conformément aux résultats attendus. Les gènes adjacents znuA (fold-change = 1,5, Adj. P = 0,527) et znuC (fold-change = 2,0, Adj. P = 0,035) de UMH14 n’ont pas non plus présenté de défaut de fitness ou un défaut minimal lorsqu’ils ont été mutés par insertion de transposon (Données S1).

La mutation du gène tatC, codant pour un composant du système de translocation de l’arginine jumelle, a entraîné la plus grande perte de fitness parmi tous les mutants testés (Fig. 3). Pour déterminer si la diminution de la valeur adaptative de ce mutant pouvait être restaurée par complémentation génétique, le plasmide pBBR1MCS-5 portant le cadre de lecture ouvert tatC a été introduit dans le mutant tatC et la valeur adaptative relative de la souche résultante a été testée. Le mutant tatC a initialement présenté un défaut d’aptitude de 67 fois dans la rate en compétition avec la souche de type sauvage (Fig. 3A), tandis que le mutant tatC complémenté a présenté un défaut d’aptitude de deux fois seulement dans les mêmes conditions (Fig. 3B). De même, le mutant tatC complémenté n’a pas été surclassé de façon significative dans le foie par rapport à UMH14. Le plasmide parent pBBR1MCS-5 est connu pour être maintenu de façon stable pendant l’infection en l’absence de sélection29 et la culture in vitro du mutant tatC de C. freundii hébergeant soit pBBR1MCS-5 soit le plasmide de complémentation tatC+ n’a démontré aucune perte appréciable de plasmide sur 24 heures en l’absence de sélection (Fig. S5). Ensemble, ces résultats établissent fermement la nécessité de la fonction TatC pendant la bactériémie de Citrobacter.

Conservation des gènes de fitness parmi les isolats de Citrobacter

Au cours de cette étude, la séquence complète du génome de chaque isolat de Citrobacter a été déterminée et le protéome prédit de chaque souche a été comparé à UMH14 comme référence. Sur les 4 666 produits génétiques prédits codés sur le chromosome UMH14, 3 742 sont conservés à ≥95% d’identité entre tous les isolats de C. freundii dans cette étude (Fig. 4A). Le nombre de protéines conservées (identité ≥95%) entre toutes les souches diminue à 2,545 lorsque les protéomes prédits de UMH17 et UMH18 ont été inclus, ce qui est cohérent avec le placement de ces isolats en dehors de la branche C. freundii par l’analyse de séquence multilocus (Fig. 1). La conservation des facteurs d’aptitude de UMH14 était également élevée, avec 145 des 177 protéines prédites conservées à ≥95% d’identité d’acides aminés parmi les huit souches de bactériémie (Fig. 4B), y compris les sept facteurs d’aptitude initiaux qui ont été sélectionnés pour la validation (Tableau 1 et Fig. 3). En retirant UMH17 et UMH18 de la considération, le nombre de facteurs d’aptitude conservés est passé à 162 (92%). Ces résultats suggèrent une stratégie de survie de Citrobacter pendant la bactériémie qui dépend largement de protéines conservées au sein de l’espèce. Il est intéressant de noter que peu de facteurs d’aptitude étaient complètement uniques (<30% d’identité) à UMH14 dans ce sous-ensemble de souches. Un exemple notable est un opéron putatif à trois gènes (CUC46_23440-CUC46_23450) avec des défauts de fitness observés allant de 6 à 14 fois. Les trois cadres de lecture ouverts codent tous des protéines hypothétiques et parmi celles-ci, seule CUC46_23450 est prédite pour coder un domaine conservé avec une fonction assignée (cd01713, phosphoadénosine phosphosulfate réductase).

Pistes de recombinaison et de réparation de l’ADN

L’un des objectifs de cette étude était d’identifier les voies biologiques conservées qui impliquaient plusieurs facteurs d’aptitude à la bactériémie. Les complexes enzymatiques RecBCD et RuvABC qui sont impliqués dans la recombinaison et la réparation de l’ADN représentent un tel exemple. L’enzyme RecBCD est active sur les extrémités de l’ADN duplex et est nécessaire pour les processus de recombinaison homologue et de réparation recombinatoire de l’ADN. En relation avec ces fonctions, l’enzyme RuvABC facilite la migration et la résolution des branches de la jonction de Holliday30,31. L’insertion d’un transposon dans recB, recC ou recD a entraîné une réduction de 6 à 8 fois de la valeur adaptative et, de la même façon, la perturbation de ruvA et ruvC par insertion de transposon a entraîné une perte de valeur adaptative de >30 fois (Données S1). Il est important de noter que le défaut de fitness de ruvA a été confirmé par une infection compétitive contre la souche de type sauvage en utilisant un mutant construit indépendamment (Fig. 3A). Parmi les deux complexes multiprotéiques, seul RuvB n’a pas été identifié comme un facteur de fitness significatif dans notre ensemble de données. Les deux complexes protéiques sont connus pour participer à la résolution des fourches de réplication de l’ADN bloquées ou effondrées qui se produisent au cours de la synthèse chromosomique normale30, mais il est important de noter que le mutant ruvA s’est développé de manière similaire à la souche de type sauvage au cours de la réplication rapide en milieu riche (Fig. S4). Il est tentant de spéculer que les dommages à l’ADN bactérien survenant dans l’environnement de l’hôte, potentiellement par la production d’espèces réactives de l’oxygène médiée par les cellules immunitaires, peuvent également contribuer à la nécessité de ces complexes.

Le système de translocation twin-arginine

Le système de translocation twin-arginine fonctionne dans les espèces bactériennes Gram-négatives pour sécréter des protéines repliées à travers la membrane cytoplasmique. Le rôle de TatC dans ce système multiprotéique conservé est dans la reconnaissance des séquences de signal de sécrétion pour les protéines qui sont exportées par cette voie. Ayant établi l’impact significatif du gène tatC sur la capacité d’adaptation in vivo de C. freundii (Fig. 3), on a pensé que les protéines sécrétées par le système Tat pourraient également être nécessaires à la capacité d’adaptation dans le modèle murin. Pour identifier les protéines putatives sécrétées par le système Tat, la séquence N-terminale de chacun des 177 facteurs de fitness a été analysée à l’aide du logiciel de prédiction TatP 1.032. Deux gènes, CUC46_16565 et CUC46_16060, ont été identifiés comme codant pour des peptides signaux dépendants de Tat contenant des motifs à deux arginines. Le produit CUC46_16565 partage 94% d’identité d’acides aminés avec la protéine SufI d’E. coli, y compris une conservation de 100% du motif twin-arginine et de la portion hydrophobe du peptide signal33. Le gène sufI de C. freundii a été muté et l’aptitude a été évaluée en compétition avec la souche parentale UMH14 pour déterminer si une partie du défaut d’aptitude associé à la perte de TatC pouvait être attribuée à la perturbation de la fonction de SufI (Fig. 5A). En effet, la souche mutante sufI a été surpassée de 7 fois dans la rate et de 17 fois dans le foie par rapport à la souche de type sauvage. Cependant, étant donné que le coût de la mutation tatC varie de 67 à 112 fois en compétition avec les bactéries de type sauvage (fig. 5A), la souche mutante sufI a été dépassée de 7 fois dans la rate et de 17 fois dans le foie par rapport à la souche sauvage. 3), le coût d’adaptation comparativement faible de la mutation sufI implique que d’autres substrats dépendants de Tat peuvent également contribuer à l’adaptation. Les tentatives d’établir une sécrétion de SufI dépendante de Tat chez C. freundii ont échoué en raison de problèmes apparents de toxicité associés à l’expression d’une construction de SufI étiquetée épitiope FLAG C-terminal, en particulier dans la souche mutante tatC (données non présentées). Cependant, SufI a été utilisé comme une protéine modèle sécrétée par Tat dans de nombreuses études caractérisant le système Tat de E. coli.

Le deuxième facteur potentiel de fitness sécrété par Tat qui a été identifié, codé par CUC496_16060, est une proline aminopeptidase prédite (PRK10879) appartenant à la superfamille PepP. Une souche mutante dépourvue du gène pepP a été dépassée d’environ 3 fois dans la rate et d’environ 2 fois dans le foie, mais le désavantage observé en termes de fitness par rapport au type sauvage n’était pas statistiquement significatif (Fig. 5A). Néanmoins, la localisation subcellulaire de PepP a été déterminée en utilisant un dérivé épitope FLAG C-terminal porté par un plasmide multicopie (PepPFLAG). Des niveaux étonnamment bas de PepPFLAG ont été détectés dans le mutant tatC par rapport à UMH14 ; cependant, la protéine de fusion PepPFLAG a été trouvée principalement dans la fraction cytoplasmique des deux souches testées (Fig. S6) et aucune preuve de la localisation subcellulaire de la protéine PepP dépendante de Tat n’a été obtenue. Avec les résultats de l’infection de compétition du mutant sufI, ces données soutiennent davantage la notion que des facteurs de fitness supplémentaires dépendants de Tat sont présents chez C. freundii ou que la perte cumulative de la translocation des protéines via le système Tat l’emporte sur la perte de fonction pour un substrat unique.

L’un des phénotypes dominants associés aux mutants tat de perte de fonction à travers les espèces est une déficience de la motilité34,35,36,37. C. freundii est une bactérie flagellée capable de se déplacer en nageant dans une matrice molle de gélose. Le mutant tatC de C. freundii a présenté une réduction d’environ 2 fois de la motilité de nage par rapport à la souche de type sauvage et la motilité de nage a été entièrement restaurée par complémentation génétique en trans (Fig. 5B,C). Ces résultats démontrent clairement un défaut de motilité en l’absence de la fonction TatC ; cependant, puisque la natation de faible niveau a encore été observée chez le mutant tatC, une certaine fonction flagellaire est probablement conservée. À l’exception de fliQ, le manque général de gènes de fitness associés aux flagelles identifiés pendant la bactériémie suggère que l’importance de tatC pour le fitness de C. freundii peut être largement indépendante du dysfonctionnement des flagelles observé dans cette souche.

Voies de fitness métaboliques

Comme indiqué précédemment, une partie assez importante des gènes de fitness identifiés de Citrobacter ont été prédits pour fonctionner dans les voies métaboliques (Fig. 2). Trois gènes différents représentant des composants du métabolisme central du carbone (pfkA), du métabolisme du fructose et du mannose (mtlD) et de la biosynthèse des acides aminés (cysE) ont été choisis pour une étude plus approfondie. La biosynthèse de la cystéine bactérienne se fait à partir de la L-sérine par l’intermédiaire de la O-acétyl-L-sérine (OAS). Cette première étape de la voie modèle d’E. coli est catalysée par l’enzyme O-acétyltransférase CysE et la perte de cysE entraîne une auxotrophie de la cystéine38,39. De même, un mutant cysE de C. freundii est incapable de se répliquer dans un milieu défini dépourvu de cystéine (Fig. 6A), mais il peut atteindre des densités proches de celles du type sauvage lorsque le milieu est supplémenté en OAS (Fig. 6B) ou en cystéine (Fig. 6C). La complémentation génétique de la mutation cysE a entraîné une restauration partielle de la croissance en l’absence de cystéine. Il est intéressant de noter que l’absence totale de croissance des bactéries mutantes cysE en l’absence d’OAS ou de cystéine in vitro contraste avec le défaut partiel d’aptitude observé pendant l’infection (Fig. 3A). Cela suggère que Citrobacter peut être capable d’obtenir ces métabolites à partir de l’environnement de la circulation sanguine, mais qu’il y a toujours un coût de fitness associé à la perturbation de la voie de biosynthèse.

Dans le cadre de notre enquête sur le métabolisme de Citrobacter associé à l’hôte, la capacité de cette bactérie à utiliser différentes sources de carbone a été étudiée. L’enzyme phosphofructokinase PfkA d’autres espèces entériques a été largement caractérisée et représente la première étape engagée de la glycolyse, catalysant la phosphorylation du fructose-6-phosphate en fructose-1,6-bisphosphate. Pour UMH14, la mutation de pfkA a éliminé la capacité de cette souche à se répliquer sur le glucose comme seule source de carbone (Fig. 6D), ce qui a pu être partiellement restauré en fournissant pfkA sur un plasmide multicopie. Cette perte totale de l’utilisation du glucose in vitro a été corrélée à une diminution de deux fois la capacité d’adaptation pendant la bactériémie (Fig. 3A). Comme le glucose est une source de carbone abondante dans le sérum des mammifères40, ces résultats sont cohérents avec un rôle pour l’utilisation du glucose par Citrobacter pendant l’infection, mais suggèrent également que le répertoire métabolique de Citrobacter peut faciliter l’utilisation de sources alternatives de carbone et d’énergie.

Une deuxième activité enzymatique impliquant le fructose-6-phosphate a également été étudiée pour les contributions à la bactériémie de Citrobacter. La protéine mannitol-1-phosphate-5-déshydrogénase, MtlD, facilite la conversion bidirectionnelle du mannitol-1-phosphate et du fructose-6-phosphate en utilisant NAD+ ou NADH comme cofacteur41,42. De multiples espèces bactériennes entériques peuvent utiliser le mannitol, un alcool de sucre, comme seule source de carbone après son transport par un système de phosphotransférase dépendant de l’hexitol phosphoenolpyruvate, ce qui entraîne l’accumulation intracellulaire de mannitol-1-phosphate43,44. Un destin possible du mannitol-1-phosphate est l’oxydation dépendante de MtlD en fructose-6-phosphate et l’acheminement ultérieur vers la voie glycolytique. Le mutant mtlD de C. freundii a présenté une diminution de cinq fois sa capacité d’adaptation dans le foie murin (Fig. 3A) et cette observation a donné lieu à des expériences visant à déterminer si C. freundii était capable de réaliser ce type de métabolisme in vitro. Les souches UMH14 et dérivées mtlD ont été cultivées dans un milieu défini contenant du mannitol et les courbes de croissance qui en résultent démontrent que les bactéries de type sauvage et le mutant complémenté ont pu proliférer dans ces conditions alors que la souche mtlD n’a pas pu le faire (Fig. 6E). Comme prévu, le mutant mtlD a pu se répliquer à des niveaux proches de ceux du type sauvage lorsqu’il a reçu du glucose comme source de carbone dans des conditions aérobies (Fig. 6F). Ensemble, ces résultats établissent à la fois la capacité de C. freundii à utiliser le mannitol comme seule source de carbone et l’exigence de mtlD dans ce processus.

Stratégies de fitness partagées entre les pathogènes dans l’environnement de la circulation sanguine

Nous avons précédemment évalué les exigences de fitness d’un autre pathogène opportuniste, S. marcescens, en utilisant un modèle murin similaire de bactériémie. Les résultats de l’étude de S. marcescens comprenaient l’identification de 212 gènes de fitness en utilisant des techniques similaires à celles du présent travail45. Afin de déterminer si ces espèces partagent des voies communes pour l’adaptation pendant la BSI, les protéomes prédits des deux espèces ont d’abord été comparés. Les protéines ont été considérées comme homologues entre C. freundii et S. marcescens si elles partageaient ≥70% d’identité d’acides aminés sur ≥50% de la séquence. Au total, 42 protéines homologues ont été identifiées comme des facteurs de fitness significatifs dans les deux organismes (Tableau S1) avec un certain nombre de fonctions diverses sont représentées dans cette liste de facteurs de fitness partagés. Notamment, la protéine RuvA, dont la perte a entraîné une diminution de >10 fois de la valeur adaptative de C. freundii par infection compétitive (Fig. 3A), a été identifiée avec RuvC comme facteurs d’adaptation chez S. marcescens. Ces résultats confirment l’hypothèse selon laquelle la résolution des complexes de la jonction de Holliday, potentiellement pendant la réparation recombinatoire des lésions de l’ADN, est importante pour la capacité d’adaptation in vivo de ces organismes. L’enzyme phosphofructokinase PfkA a également été identifiée comme un facteur de fitness chez les deux espèces. Comme on l’a observé chez Citrobacter, la pfkA de S. marcescens est nécessaire pour l’utilisation du glucose comme seule source de carbone, et elle est également nécessaire pour une réplication bactérienne optimale dans du sérum humain inactivé par la chaleur45. Dans les deux organismes, la pfkA a contribué à la capacité d’adaptation dans la rate, telle qu’évaluée par le criblage de transposons, bien qu’il soit intéressant de noter que le mutant pfkA de S. marcescens a également présenté une capacité d’adaptation réduite d’environ 9 fois dans le rein par infection compétitive avec la souche de type sauvage. Au cours de ces travaux, il a été observé que la souche de type sauvage C. freundii UMH14 présentait une colonisation relativement faible du rein dans le modèle BSI, mais il a été démontré que le gène pfkA de Proteus mirabilis contribue à la capacité d’adaptation dans le rein après une infection des voies urinaires46. Ces résultats démontrent qu’il est possible d’identifier des stratégies d’adaptation conservées entre organismes dans un environnement spécifique. D’autres travaux seront nécessaires pour déterminer si les produits de ces gènes sont également requis dans d’autres organismes responsables de BSI et si ces voies de fitness conservées peuvent être exploitées.