Échantillons FFPE – Préparation d’échantillons de tissus humains – Lab-Ally

Table des matières

Introduction |Acquisition de tissus |Traitement de tissus FFPE |Sectionnement | Références

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Introduction

De nombreux chercheurs actuels préfèrent utiliser des échantillons de tissus FFPE pour leurs analyses IHC, histologiques ou génomiques in situ. FFPE signifie « Formalin-Fixed Paraffin-Embedded » et décrit les deux caractéristiques principales de cette méthode de conservation des tissus. La formaline est une solution de formaldéhyde utilisée depuis la découverte, à la fin des années 1800, des effets conservateurs du formaldéhyde par le médecin allemand Ferdinand Blum (Fox, et al., 1985). La paraffine est infusée dans le tissu après la fixation au formaldéhyde, et le tissu est également entouré d’une enveloppe de paraffine pour aider à le soutenir et le protéger de l’oxydation. Les échantillons FFPE fixés et incorporés par des professionnels et les biomolécules qu’ils contiennent sont raisonnablement stables à température ambiante. D’un point de vue structurel, les tissus fixés et inclus sont résistants et peuvent être utilisés pour des études d’anatomie microscopique presque indéfiniment, mais au fil du temps, l’antigénicité de certaines protéines se dégrade, ce qui limite les études IHC à des échantillons datant de quelques décennies au maximum. L’ADN double brin est étonnamment stable dans les blocs FFPE, mais d’autres biomolécules moins stables, comme l’ARN, peuvent se dégrader en une décennie ou moins, surtout une fois que les sections ont été coupées.

Les archives qui accumulent un grand nombre d’échantillons FFPE sont une source de données particulièrement riche lorsque la comparaison de nombreux cas (c’est-à-dire des échantillons FFPE provenant de plusieurs donneurs) est souhaitable pour tirer des conclusions statistiquement robustes sur les caractéristiques d’indications particulières. Si les échantillons FFPE doivent être utilisés dans le cadre d’une recherche biomédicale à « enjeux élevés », il est alors important que chaque étape du processus de préparation soit réalisée par des professionnels entièrement formés et certifiés, de préférence dans un laboratoire certifié CLIA (c’est-à-dire inspecté par le gouvernement) ou accrédité CAP (College of American Pathologists).

Il convient de noter que le processus FFPE n’est pas universellement normalisé, et que les institutions à travers le monde peuvent utiliser des protocoles légèrement différents avec différentes solutions de formol ou adapter autrement le processus à leurs préférences et exigences. Ce qui suit est une vue d’ensemble du processus et des descriptions de ce que chaque étape implique, ainsi que certaines variations courantes.

Acquisition des tissus

Avant le traitement des tissus, il y a l’étape nécessaire de l’acquisition des tissus. Il s’agit en fait de l’élément le plus difficile à contrôler car il est intimement lié aux soins aux patients, à la conformité 41CFR46 et, aux États-Unis, à la surveillance du comité d’examen interne (IRB). Les spécificités de la procédure médicale et les conventions de soins standard sont importantes car elles peuvent affecter des variables telles que les intervalles de temps entre l’administration de l’anesthésie et la ligature des vaisseaux, le prélèvement du tissu et le temps écoulé avant la fixation, qui peuvent tous avoir un impact sur la qualité de l’échantillon. Par exemple, des changements dans l’ARN et les protéines sont susceptibles de se produire pendant l’intervalle de temps, appelé temps d’ischémie chaude, entre la ligature de l’approvisionnement en sang et le retrait du tissu (Dash, et al., 2002). Ce temps d’ischémie peut varier de quelques minutes à quelques heures selon l’organe, les procédures opérationnelles standard de l’établissement, le chirurgien et les autres personnels de santé impliqués, et l’approche chirurgicale. C’est pourquoi il a été recommandé d’enregistrer ce temps pour chaque spécimen et de le réduire au minimum (Hewitt, et al., 2008).

Traitement des tissus FFPE

Une fois l’échantillon de tissu acquis, un triage, une dissection ou une micro-dissection supplémentaires (collectivement appelés grossissement) peuvent être nécessaires pour isoler et préparer la portion spécifique de tissu qui passera par les étapes de traitement restantes. Aujourd’hui, le traitement des tissus est souvent entièrement automatisé jusqu’à l’étape finale, l’inclusion, qui peut être réalisée manuellement. Il existe de nombreux appareils de traitement des tissus, mais tous suivent la séquence des quatre premières étapes présentées ci-dessus. L’automatisation des différentes étapes permet d’éliminer les variations de la procédure comme source de variation des résultats expérimentaux entre différents échantillons FFPE.

Fixation

La fixation est l’étape initiale du traitement des tissus FFPE. Les facteurs critiques à prendre en compte sont la solution à utiliser, la durée de la fixation, ainsi que l’épaisseur et les propriétés histologiques de l’échantillon de tissu à fixer.

– Solution

Le fixateur utilisé par la plupart des laboratoires est le formol à 10% tamponné neutre. Le formol est un liquide composé de 37 à 40 % de formaldéhyde et de 10 % de méthanol (en poids) dans l’eau ; ainsi, une solution de formol à 10 % contient environ 3,7 à 4 % de formaldéhyde et 1 % de méthanol (Hewitt, et al., 2008 ; Kiernan, 2000). En réalité, le formaldéhyde existe en solution principalement sous forme de monomères ou de petits polymères de méthylène glycol (méthanediol, formaldéhyde monohydraté) qui est formé par la réaction réversible du formaldéhyde avec l’eau. Les polymères de méthylène glycol de poids élevé sont appelés paraformaldéhyde et précipiteront hors de la solution, mais le méthanol ralentit ce processus de polymérisation, ce qui est la raison de son inclusion dans les solutions de formol. Le formaldéhyde dilué avec de l’eau (comme le formaldéhyde à 10 %) – et surtout s’il s’agit d’une solution tampon – contiendra principalement des monomères car le grand nombre de molécules d’eau décompose les polymères de méthylène glycol qui auraient normalement existé dans une solution à plus forte concentration de formaldéhyde (Kiernan, 2000). Des tampons, le composant restant du formol, sont également ajoutés car le formaldéhyde a tendance à s’oxyder en acide formique (Fox, et al., 1985). L’acide formique dans la fixation des tissus peut entraîner la précipitation de granules de pigment de formol (hématine acide) qui peuvent ressembler aux pigments produits par certains parasites (Pizzolato, 1976). Le tamponnage du formol empêche ce phénomène. Les agents tampons courants comprennent le carbonate de magnésium, le carbonate de calcium, le citrate, le Tris et les tampons de phosphate (Hewitt, et. al., 2008). Le formol commercial contient souvent des tampons de phosphate. « Tampon neutre », qui est typiquement la façon dont le formol est préparé, signifie simplement que le pH est maintenu à environ 7.

– Processus et mécanisme

En raison des faibles poids moléculaires du formaldéhyde et du méthylène glycol, le formol (principalement le méthylène glycol en solution) pénètre les tissus relativement rapidement, à une vitesse qui dépend du type de tissu mais avec une vitesse moyenne de 1mm/heure (Hewitt, et al., 2008). Les protocoles de fixation varient donc en fonction du type de tissu à fixer. Une fois à l’intérieur du tissu, la fraction de molécules de formaldéhyde présente en solution va commencer à se lier aux protéines, mais cela se produit à une vitesse beaucoup plus lente que la vitesse de diffusion. La réaction du formaldéhyde avec le tissu l’extrait de la solution et renvoie la réaction réversible formaldéhyde-méthylène glycol dans la direction du formaldéhyde, de sorte qu’une plus grande quantité de formaldéhyde est produite alors même qu’elle est consommée (Fox et al., 1985). Les chaînes latérales aminées de la lysine sont les plus réactives au formaldéhyde, mais d’autres sont quelque peu réactives au formaldéhyde, notamment l’arginine, l’asparagine, l’histidine, la glutamine, la sérine et la tyrosine (Howat et Wilson, 2014). Après la réaction, le groupe hydroxyméthyle résultant attaché au complexe peut ensuite réagir avec la même protéine ou d’autres protéines, formant ainsi des ponts méthylène stables (protéine-CH2-protéine) (Kiernan, 2000). C’est ce qui produit l’insolubilité et la rigidité des tissus qui ont été fixés au formol et donc conservés. Environ 24 à 48 heures sont nécessaires pour que cette réticulation se produise suffisamment dans l’ensemble du tissu (Thavarajah, et al., 2012), mais il a été recommandé de ne pas dépasser 36 heures pour ce processus, car la fixation pendant une période plus longue diminue la qualité des biomolécules dans les échantillons FFPE, notamment en raccourcissant la longueur des acides nucléiques qui peuvent être extraits (Hewitt, et al, 2008).

– Limites

Le principal avantage de l’utilisation du formaldéhyde – en particulier sous forme de formol tamponné neutre à 10% – est qu’il préserve un large éventail de tissus et de composants. Cependant, il a des limites. Par exemple, une combinaison de formaldéhyde et de glutaraldéhyde (C5H8O2), ou une solution de glutaraldéhyde seule, est généralement utilisée pour la microscopie électronique (Kiernan, 2000) car ces solutions préservent mieux les structures tissulaires à cette fin. Notez que les tissus préparés avec une solution de glutaraldéhyde ou de glutaraldéhyde-aldéhyde ne seront pas considérés comme des échantillons FFPE. Un autre défi est l’extraction des molécules d’ADN et d’ARN des tissus FFPE car le formol a tendance à modifier les acides nucléiques – jusqu’à introduire des mutations artificielles dans l’ADN – et à les fragmenter en petits fragments (Srinivasan, Sedmak et Jewell, 2002). Pourtant, il est possible d’extraire des fragments d’ADN et d’ARN des tissus FFPE qui conviennent à l’analyse, comme le décrit un protocole rédigé par Tang, et al. (2009), un facteur clé de la récupération des acides nucléiques étant une digestion protéasique appropriée. Des kits commerciaux pour l’extraction d’acides nucléiques à partir d’échantillons FFPE sont également disponibles.

– Epaisseur de l’échantillon

Un autre point majeur à considérer concernant la fixation au formol est l’épaisseur de l’échantillon de tissu. Bien que le formol pénètre relativement rapidement dans le tissu, comme mentionné ci-dessus, l’épaisseur du tissu affectera la qualité de l’échantillon fixé. Il faudra plus de temps au formol pour atteindre le centre des échantillons de tissus plus épais. Alors que le formol se diffuse progressivement dans les parties les plus internes de l’échantillon, les régions extérieures auront déjà commencé le processus de fixation, de sorte que les biomolécules qui s’y trouvent sont plus susceptibles de se dégrader au cours du temps prolongé nécessaire à la fixation totale. De plus, si des limites de temps sont respectées (telles qu’un maximum de 36 heures comme mentionné ci-dessus), il est possible que l’échantillon de tissu ne soit pas suffisamment fixé (préservé) dans son intégralité. C’est pourquoi il est préférable de disséquer les tissus à fixer dont la largeur dépasse plusieurs millimètres, voire un ou deux centimètres, en segments plus fins pour une fixation optimale (Hewitt, et al., 2008). Les institutions peuvent avoir des protocoles différents pour la durée et le volume de fixateur requis pour les échantillons de tissus de différentes largeurs, mais en général, le rapport entre le volume de fixateur et le volume de tissu devrait être de 10:1 (Klatt, 2016).

Déshydratation

La deuxième étape du traitement des spécimens FFPE est la déshydratation. La paraffine n’étant pas miscible à l’eau, toute l’eau de la solution de formol doit être éliminée du tissu avant que la paraffine puisse s’y infiltrer. Une série de solutions d’alcool (souvent de l’éthanol), commençant fréquemment par de l’alcool à 70 % et progressant vers de l’alcool à 100 %, sera utilisée pour éliminer essentiellement toute l’eau du tissu. Pour une déshydratation optimale, il est nécessaire d’utiliser des solutions fraîches ou de remplacer fréquemment les solutions utilisées, car l’alcool se dilue de plus en plus à l’usage. Il est également impératif que cette étape soit réalisée entièrement (en réservant suffisamment de temps pour cette étape) car une déshydratation insuffisante peut entraîner une dégradation des tissus (Klatt, 2016 ; Hewitt, et al., 2008).

Clearing

Puisque la paraffine n’est en fait pas non plus miscible aux alcools, l’étape suivante consiste à éliminer l’alcool avec une substance miscible à la paraffine. Cette étape est connue sous le nom de défrichage, et le xylène est l’agent de défrichage le plus souvent utilisé (Klatt, 2016 ; Hewitt, et al., 2008).

Infiltration de paraffine

Après une fixation, une déshydratation et un défrichage adéquats, le tissu peut enfin subir une infiltration (ou imprégnation) de paraffine. Cette étape n’est pas non plus standardisée, et les institutions du monde entier peuvent utiliser différentes paraffines et des mélanges de cires de composition variée. Les paraffines ont des points de fusion et des textures différents qui ont un impact sur le bloc de tissu final et ses caractéristiques. Aux États-Unis comme en Europe occidentale, les paraffines synthétiques à faible point de fusion (55°C-63°C) sont normalement utilisées pour obtenir les meilleurs résultats. Du latex, du sulfoxyde de diméthyle et des  » plastifiants  » exclusifs peuvent être inclus dans la formulation afin de modifier la texture et la malléabilité de l’échantillon de tissu final (Hewitt, et al., 2008).

Les nations d’autres parties du monde incorporeront souvent de la cire d’abeille dans leurs formulations afin d’améliorer la malléabilité et de diminuer la température de fusion des paraffines de faible qualité utilisées. Cependant, la cire d’abeille contient des contaminants tels que le pollen, ce qui diminue la qualité de l’échantillon final. Les températures de fusion plus élevées sont à éviter car elles entraînent ultérieurement une diminution et une insuffisance de la déparaffinisation du spécimen de tissu ainsi qu’une diminution de la quantité d’acides nucléiques récupérés du tissu (Hewitt, et al., 2008).

Enrobage en paraffine

La dernière étape du traitement des échantillons FFPE est l’enrobage en paraffine. L’échantillon de tissu infiltré de paraffine est entouré d’une couche de paraffine. Il faut veiller à orienter correctement le bloc de tissu dans le moule (« cassette ») car cela a un impact sur le plan de coupe lorsque des sections fines sont tranchées du bloc avec un microtome (Klatt, 2016). Une fois que l’enveloppe de paraffine s’est solidifiée, le bloc FFPE est prêt à être stocké et restera bien conservé pendant des années, voire jusqu’à des décennies (Hewitt, et al., 2008).

Sectionnement

Une fois que le tissu est enrobé, il est prêt à être sectionné au microtome. Comme le tissu n’est pas toujours complètement plat contre l’avant de la paraffine, l’histotechnologiste doit généralement  » faire face  » au bloc. Le bloc de tissu est placé dans le porte-bloc du microtome et, tout en réglant l’angle du porte-bloc de manière à gaspiller le moins de tissu possible, l’histotechnologiste tourne le volant, déplaçant le bloc de haut en bas contre une lame tranchante. Le bloc est coupé jusqu’à ce qu’une section complète et représentative du tissu se trouve à l’avant du bloc. Une fois que le tissu est à l’avant, le bloc est placé sur de la glace pour refroidir, ce qui facilitera la coupe de sections fines ; une paraffine trop chaude créera un tissu comprimé avec des sections plissées. Lorsque le bloc est refroidi, il est replacé dans le porte-bloc. Le technicien tourne à nouveau le volant, cette fois à un rythme lent et régulier, pour créer des sections fines consécutives qui se collent les unes aux autres, formant un « ruban ». » Le ruban est placé sur un bain d’eau chaude (la température est maintenue juste en dessous du point de fusion de la paraffine) pour lisser les plis qui se sont formés. Le technicien place ensuite une lame de microscope dans le bain-marie et  » ramasse  » la ou les sections choisies afin qu’elles adhèrent à la lame.

L’épaisseur la plus courante pour les sections de tissus se situe entre 3 et 5 micromètres (ou microns, pour faire court), ce qui correspond à l’épaisseur d’une seule cellule. Les lames avec des sections de 3-5 microns sont normalement utilisées pour la coloration, qu’il s’agisse de la coloration standard Hematoxylin &Eosin (H&E), d’une coloration spéciale ou d’une coloration immunohistochimique (IHC). Les chercheurs demandent souvent des « boucles » au lieu de sections fines sur des lames. Les boucles sont des sections plus épaisses (10 microns ou plus) qui sont placées dans des tubes Eppendorf et sont généralement utilisées lorsque l’ARN ou l’ADN doit être extrait des échantillons FFPE. Les sections épaisses peuvent également être placées sur des lames au lieu de tubes, ce qui est optimal lorsque seule une partie du tissu est utilisée pour l’extraction. Dans ce cas, le tissu est gratté sur la lame et placé dans un tube. Les échantillons FFPE qui ont été sectionnés sont structurellement stables, et s’ils sont traités et stockés correctement, ils peuvent être utilisés pour l’analyse microscopique pendant un certain temps après que la section a eu lieu, mais si des extractions chimiques doivent être effectuées, alors généralement les sections doivent être utilisées dès que possible après la coupe pour empêcher la dégradation oxydative et biologique des molécules cibles exposées.

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1. Fox, C. H., Johnson, F. B., Whiting, J., & Roller, P. P. (1985). Fixation du formaldéhyde. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry, 33(8), 845-853.
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