Abstract
Xiao-Yao-San (XYS) keittäminen on perinteinen kiinalainen lääkekaava. Tämän tutkimuksen tarkoituksena oli tutkia XYS:n vaikutusta kognitiivisiin kykyihin ja sen taustalla olevaa mekanismia ovariektomioiduilla rotilla. Naaraspuolisille Sprague-Dawley-rotille poistettiin munasarjat ja niitä hoidettiin XYS:llä (3 g/kg tai 9 g/kg) nauttimalla sitä ruokatorjunnalla, jolloin 17-β-estradioli (E2, 2 μg/kg) annettiin ihonalaisena injektiona positiivisena lääkekontrollina ja 1 ml suolaliuosta (0,9-prosenttista suolaliuosta (0,9-prosenttista suolaliuosta) ruokatorjunnalla lumelääkekontrollina. 6 viikon hoidon jälkeen rotat tutkittiin Morrisin vesilabyrinttitestillä. Estradiolipitoisuus seerumista ja hippokampuksesta mitattiin ELISA:lla. Golgi-värjäys suoritettiin hermosolujen morfologian havainnoimiseksi hippokampuksessa. Hippokampussolujen apoptoosia havainnoitiin TUNEL-värjäyksellä. N-metyyli-D-aspartaattireseptorin (NMDAR) 2A ja 2B proteiinipitoisuus hippokampuksen CA1-alueella määritettiin Western blotilla ja immunohistokemiallisesti. Estrogeenireseptorin (ER) ja PI3K-signaloinnin ilmentyminen havaittiin Western blotilla. Verrattuna sham-ryhmään sekä oppiminen että muisti olivat heikentyneet ovariektomioiduilla rotilla. E2:lla tai suurella annoksella XYS:ää hoidetuilla rotilla oppiminen ja muisti olivat parempia kuin suolaliuoksella hoidetuilla rotilla. Korkea-annoksinen XYS vähensi merkittävästi pakenemisen latenssiaikaa spatiaalisessa hankintakokeessa; sillä välin ristiajat ja kesto koettimen kvadrantissa lisääntyivät spatiaalisessa koettimen kokeessa. Suuri annos XYS edisti E2-pitoisuuden de novo -synteesiä hippokampuksessa, mutta sillä ei ollut merkittävää vaikutusta seerumin E2-tasoon. Golgi-värjäys osoitti, että suuri annos XYS saattoi lisätä dendriittisten selkärankojen haarojen määrää ja tiheyttä hippokampuksen CA1-alueella. TUNEL-värjäys osoitti, että suuriannoksinen XYS lievitti ovariektomian aiheuttamaa neuronien apoptoosia. NMDAR2A:n ja NMDAR2B:n ilmentymistaso hippokampuksen CA1-alueella nousi XYS-hoidon vaikutuksesta. XYS:n suotuisa vaikutus johtui ERα-PI3K-signaloinnin aktivoinnista. Johtopäätöksenä voidaan todeta, että suuriannoksinen XYS-hoito voi parantaa ovariektomoitujen rottien kognitiivisia kykyjä suojaamalla hippokampuksen neuroneja ja palauttamalla hippokampuksen E2-tason.
1. Johdanto
Perimenopausaaliset naiset kärsivät usein ahdistuksesta ja masennuksesta, jotka liittyvät estrogeenitason vaihteluun . Ahdistuksen ja masennuksen lisäksi muistamattomuus on toinen yleinen vaiva perimenopausaalisilla naisilla. Seattlen Midlife Women’s Health Study -tutkimuksessa todettiin, että 60 % keski-ikäisistä naisista havaitsi muistin heikkenemistä . Study of Women’s Health Across the Nation (SWAN) -tutkimuksessa todettiin, että vaihdevuodet olivat riippuvainen riskitekijä keski-ikäisten naisten itse ilmoittamalle muistamattomuudelle . Koska aivot ovat tärkeä estrogeenin säätelyn kohde, on arveltu, että estrogeenin puute voi olla vastuussa kognitiivisesta heikkenemisestä. Havainnointitutkimusten tulokset vaikutuksesta kognitioon eivät kuitenkaan ole täysin johdonmukaisia . Lisäksi kognitiivista suorituskykyä parantavia tehokkaita hormonaalisia hoitotoimenpiteitä ei ole vielä vahvistettu . Myös muut tekijät, kuten koettu stressi, mieliala ja fyysinen terveys, voivat vaikuttaa muistioireisiin . Munasarjojen estrogeenituotanto vaikuttaa todennäköisemmin muistiin, jos se vähenee äkillisesti kuin luonnollisen siirtymän yhteydessä . Toisin kuin ihmisillä tehdyissä tutkimuksissa esiintyvä epäjohdonmukaisuus, munasarjojen poistetuilla eläimillä tehdyt havainnot tukevat estrogeenin puutteen yhteyttä kognitiivisiin muutoksiin ja hormonikorvaushoidon tehokkuuteen .
Fytoestrogeenien lisääminen on suosittu vaihtoehtoinen hoitomuoto vaihdevuosioireiden oireiden lievittämiseksi. Fytoestrogeenit, kuten flavonoidit, isoflavonit ja lignaanit, ovat rakenteeltaan samankaltaisia kuin steroidiset estrogeenit, ja niillä voi olla estrogeenin kaltainen rooli aktivoimalla estrogeenireseptoreita (ER). Meta-analyysi tuki soijaisoflavonilisäyksen tehokkuutta näkömuistin parantamisessa terveillä postmenopausaalisilla naisilla . SWAN Phytoestrogen Ancillary Study -tutkimus osoitti, että korkea isoflavonien tai ligniinin saanti voi parantaa prosessointinopeutta tai verbaalista muistia tietyssä vaihdevuosien vaiheessa, vaikka hyöty liittyi myös etniseen/rotuun . Fytoestrogeenien kognitiota parantava vaikutus on selvemmin osoitettu eläinkokeissa. Fenugreek-siemenistä saatu hydroalkoholiuute voisi lieventää ovariektomia- (OVX-) aiheuttamia hippokampuksen hermosolujen vaurioita ja parantaa oppimis- ja muistisuorituskykyä rotan mallissa .
Xiao-Yao-San (XYS), joka tarkoittaa kiinaksi onnellista ja huoletonta jauhetta, on perinteisen kiinalaisen lääketieteen (TCM) kaava, jota käytetään vaihdevuosien aiheuttaman ahdistuneisuuden ja masennuksen hoitoon. Kaava koostuu Bupleuri radixista (Chaihu), Angelicae radixista (Danggui), Paeoniae radix alba:sta (Baishao), Atractylodis rhizome macrocephalae:sta (Baizhu), Poria cocos:sta (Fuling), Zingiberis siccatum rhizoma:sta (Shengjiang), Menthae haplocalycis:sta (Bohe) ja Glycyrrhizae radix:sta (Gancao). Systemaattinen analyysi, johon sisältyi 26 satunnaistettua tutkimusta, osoitti, että XYS oli parempi kuin masennuslääkkeet, mikä ilmeni Hamiltonin masennusasteikon pistemääristä, ja että se saattoi tehostaa masennuslääkkeiden tehoa masennusasteikon itsearviointipisteiden parantamisessa. Perimenopausaaliset naiset, joilla on exophthalmia ja sydämentykytys, voisivat myös hyötyä XYS-hoidosta . Osa XYS:n terapeuttisista vaikutuksista vaihdevuosioireyhtymän lievittämisessä voi johtua fytoestrogeenien läsnäolosta. Useissa tutkimuksissa on raportoitu fytoestrogeenien esiintymisestä XYS:ssä. Ergosterolia esiintyy Poria cocosissa (Fuling) ja β-sitosterolia tiedetään esiintyvän Angelicae radixissa (Danggui). Miller-Marini et al. kehittivät estrogeenikimeerisen reseptorin/Gal4-vaste-elementin säätelemän/luciferaasi-reportteri-määrityksen fytoestrogeenien esiintymisen havaitsemiseksi monimutkaisissa TCM-valmisteissa. He analysoivat Bupleurum & Peony Formula -kaavaa, XYS:n muunnettua kaavaa, jossa on samat pääyrtit, ja havaitsivat mitattavissa olevan fytoestrogeenipitoisuuden .
Fytoestrogeenien esiintyminen XYS:ssä viittaa siihen, että XYS:llä on potentiaalia hoitaa estrogeenin puutteen aiheuttamaa kognitiivista heikkenemistä. Eläintutkimus osoitti, että XYS voisi lieventää kroonisen immobilisaatiostressin (CIS) aiheuttamaa oppimis- ja muistivajetta . Tällä hetkellä missään tutkimuksessa ei ole arvioitu XYS:n vaikutusta kognitiivisen heikentymisen parantamiseen perimenopausaalisilla naisilla. Siksi tässä tutkimuksessa tutkittiin XYS:n vaikutusta kognitiivisiin kykyihin ja sen taustalla olevaa mekanismia OVX-rotilla.
2. Materiaalit ja menetelmät
2.1. Tutkimusmenetelmät. Eläimet ja hoito
Tässä tutkimuksessa käytettiin yhteensä 60 naaraspuolista Sprague-Dawley-rottaa. Tutkimusprotokolla hyväksyttiin laitoksen koe-eläinten eettisessä komiteassa (hyväksyntänumero: ACU170802). Eläimillä oli vapaa pääsy veteen ja vakioruokavalioon valvotussa lämpötilassa ja kosteudessa. Rotat jaettiin satunnaisesti viiteen ryhmään (12 rottaa/ryhmä): näennäisryhmä, OVX + suolaliuos tai O-suolaliuosryhmä, OVX + 17-β-estradioli (E2) tai O-E2-ryhmä, OVX + XYS 9 g/kg tai O-XYS9-ryhmä ja OVX + XYS 3 g/kg tai O-XYS3-ryhmä. Rotille tehtiin OVX-operaatio anestesiassa, kuten edellä on kuvattu. Lyhyesti sanottuna tehtiin pituussuuntainen viilto kolmannekseen vartalosta ja 1-2 cm:n päähän selkärangan kummaltakin puolelta. Rasvakudos vedettiin varovasti ulos pinseteillä. Munasarja tunnistettiin, ja kohdun sarvet sidottiin. Munasarja poistettiin ja vatsan viilto ommeltiin. Sham-ryhmässä vatsa viillettiin ilman OVX:ää.
Hoito aloitettiin kaksi viikkoa OVX-operaation jälkeen ja se kesti kuusi viikkoa. XYS-hoitoryhmien rotat saivat XYS:ää nieltynä neulan kautta kerta-annoksena 9 g/kg tai 3 g/kg päivässä. Positiivisena lääkekontrollina käytettiin ihonalaista E2-injektiota (2 μg/kg). Plasebokontrollina käytettiin 1 ml suolaliuosta (0,9 %). XYS-keittoa käytettiin uutteena (1 g/ml, vastaa 1 g raakaa yrttiä/ml), jonka Nanjingin perinteisen kiinalaisen lääketieteen yliopiston sairaala toimitti. XYS:n keittokaava ilmoitettiin arvokkaasti. XYS:n annos, jota käytetään klinikalla perimenopausaalisille naisille, on 175 g raakoja yrttejä/60 kg, mikä vastaa 3,5 g/kg rotilla. Viitaten muihin rottamallia koskeviin kokeellisiin raportteihin asetimme pieneksi annokseksi 3 g/kg ja suureksi annokseksi 9 g/kg . E2-jauhe (kat. nro E2758, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) liuotettiin pieneen määrään etanolia, minkä jälkeen valmistettiin 20 μg/ml kantaliuos 0,9-prosenttisella suolaliuoksella.
2.2. Morrisin vesilabyrintti-testi
Rottien oppimis- ja muistitoimintaa arvioitiin Morrisin vesilabyrintti (MWM) -testillä . MWM-kokeen laite on pyöreä allas (halkaisija 200 cm), jossa on 38-40 cm korkeaa vettä. Veden lämpötila pidetään vakiona 20-22 °C:ssa. WMW-koe koostuu kolmesta osasta, nimittäin avaruudellisesta hankintakokeesta (kesto 5 päivää), avaruudellisesta koekokeesta ja näkyvän alustan kokeesta. Spatiaalisessa hankintakokeessa rotat asetettiin varovasti satunnaiseen vesisäiliön kvadranttiin siten, että alusta oli piilossa 1,5 cm koillisneljänneksessä veden alapuolella. Kukin rotta sai uida enintään 60 sekuntia löytääkseen alustan. Rotat, jotka eivät löytäneet alustaa 60 sekunnin kuluessa, ohjattiin sen luo, ja latenssi kirjattiin 60 sekunniksi. Pakenemislatenssi kirjattiin videoanalyysijärjestelmällä (ANY-maze Animal Behavior Analysis System, Stoelting Company, USA). Rotat koulutettiin 4 kertaa päivässä. Viiden päivän harjoittelun jälkeen rotat saivat avaruudellisen koekokeen, jossa alusta poistettiin koillisneljänneksestä. Rotat sijoitettiin samaan lähtöpaikkaan luoteiskvadranttiin. Rottien 120 sekunnin aikana alustaa etsivien rottien kulkureitit tallennettiin. Spatiaalisen muistin säilymisen arvioimiseksi laskettiin kesto ja ristiajat kohdekvadrantissa. Seuraavana päivänä spatiaalisen koekokeen jälkeen rotat saivat näkyvän alustan kokeen, joka oli samanlainen kuin piilotetun alustan harjoittelu, jossa alusta nostettiin 1,5 cm vedenpinnan yläpuolelle ja sijoitettiin lounaiseen kvadranttiin. Kukin rotta päästettiin vapaaksi 4 kertaa, ja joka kerta eri sisääntulopisteestä. Pakenemisviive, uintimatka ja uintinopeus kirjattiin.
2.3. Näytteenotto
MWM-kokeen päätyttyä rotat thorakotomoitiin ja intuboitiin nousevaan aorttaan vasemman kammion kautta nukutuksessa natriumpentobarbitaalilla (40 mg/kg vatsansisäisen injektion kautta). Runkoveri kerättiin seeruminerotusputken avulla E2:n havaitsemista varten. Hippokampit kuudesta rotasta erotettiin aivokuoresta ja ympäröivistä aivokudoksista, poistettiin nopeasti, pestiin kylmällä PBS:llä ja pakastettiin nestemäisessä typessä E2:n havaitsemista ja Western blot -menetelmää varten. Kolme sulattamatonta aivokudosta immobilisoitiin 4-prosenttiseen paraformaldehydiin 24 tunniksi ja käytettiin Golgin värjäykseen ja immunohistokemiaan. Kolme vasenta rottaa perfusoitiin transkardiaalisesti kylmällä suolaliuoksella, minkä jälkeen ne fiksoitiin 4 %:n paraformaldehydillä 1 h. Aivot poistettiin sitten, fiksoitiin 4 %:n paraformaldehydissä 24 h:n ajan ja upotettiin parafiiniin TUNEL-värjäystä varten.
2.4. E2:n osoittaminen
Verinäytteiden annettiin hyytyä huoneenlämmössä ja ne sentrifugoitiin 15 minuutin ajan 4 °C:ssa seerumin erottamiseksi. Hippokampuskudokset punnittiin, homogenisoitiin kylmässä suolaliuoksessa ja sentrifugoitiin 20 min ajan supernatantin keräämiseksi. E2-pitoisuus seerumissa ja hippokampuksen homogenaatin supernatantissa havaittiin ELISA-sarjalla (Shanghai Enzyme-linked Biotechnology Co. Ltd., Shanghai, Kiina).
2.5. Golgin värjäys
Hippokampus leikattiin pieniksi lohkoiksi ja käsiteltiin Golgin värjäystä varten kuvatulla tavalla . Lyhyesti sanottuna hippokampuslohkot upotettiin Golgi-värjäysliuokseen (Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd., Shanghai, Kiina) 14 päivän ajan, jonka aikana väriaineliuos vaihdettiin 2-3 päivän välein. Kudokset dehydratoitiin 30-prosenttisella sakkaroosilla ja leikattiin 100 μm:n leikkeellä. Leikkeet käsiteltiin etanolilla dehydratoimalla, kirkastettiin ksyleenillä ja kiinnitettiin gelatiinilla päällystetyille objektilasille. Golgin värjäys onnistui kaikissa näytteissä. Hippokampuksen neuronien morfologiaa tarkasteltiin valomikroskoopilla (Nikon, Tokio, Japani). Hippokampuksen CA1-alueen neuronit analysoitiin käyttämällä Image J -ohjelmiston Neuron J -pistoketta. Kullekin rotalle valittiin viisi leikkausta, ja dendriittiset selkärangat, joilla oli täydellinen morfologia, valittiin kustakin leikkauksesta . Dendriittisten selkärankojen tiheys ja haarautumispisteet mitattiin.
2.6. Immunohistokemia
N-metyyli-D-aspartaattireseptorin (NMDAR) alayksiköiden 2A ja 2B ilmentyminen hippokampuksessa määritettiin immunohistokemiallisesti standardimenettelyn mukaisesti . Ensisijaiset vasta-aineet olivat kani anti-NMDAR2A (1 : 200, Boster Biological Technology, Wuhan, Kiina) ja kani anti-NMDAR2B (1 : 400, Servicebio Technology Co., Ltd., Wuhan, Kiina). Toissijainen vasta-aine oli HRP-konjugoitu anti-kani IgG (Servicebio).
2.7. TUNEL-värjäys
Hippokampuksen morfologiset muutokset havaittiin TUNEL-värjäyksellä kaupallisella kitillä (Roche, Mannheim, Saksa) ohjeiden mukaisesti. Leikkeille tehtiin DAB-kolorimetrinen reaktio, jota seurasi hematoksyliinivärjäys. TUNEL-positiivisten apoptoottisten solujen tuma oli ruskea valomikroskoopilla. Kustakin rotasta valittiin viisi leikettä ja kustakin leikkeestä valittiin kolme ei-toistuvaa kenttää (400-kertainen suurennus). TUNEL-positiivisten solujen prosenttiosuus kaikista soluista laskettiin.
2.8. Western Blot
Hippokampuksen CA1-aivo-osa uutettiin nopeasti ja leikattiin pieniksi leikkauksiksi aivoatlaksen mukaisesti. Hippokampuskudoksia inkuboitiin yön yli RIPA-lyysipuskurissa (joka sisälsi 100 Mm PMSF:ää, ostettu Servicebiosta). Solujätteet poistettiin sentrifugoimalla 10 minuutin ajan proteiinia sisältävän supernatantin keräämiseksi. Proteiinipitoisuus määritettiin käyttämällä BCA-proteiinimäärityssarjaa (Pierce, Rockford, IL, USA). Proteiinilysaatit (30 μg/taso) erotettiin 10 % SDS-PAGE:lla ja elektroblotattiin PVDF-kalvolle. Sen jälkeen, kun kalvo oli estetty 5 % rasvattomalla maidolla, se koeponnisteltiin yön yli seuraavilla ensisijaisilla vasta-aineilla: kani anti-NMDAR2A (1 : 500, Millipore, Billerica, MA, USA), kani anti-NMDAR2B (1 : 2000, Millipore), kani anti-CYP19 (1 : 1000, Abcam, Cambridge, UK), kani anti-ERα (1 : 2000, Millipore), kanin anti-fosfo-ERα (Ser118, 1 : 2000, Millipore), kanin anti-fosfatidylinositoli-3-kinaasi (PI3K) 110β (1 : 1000, Millipore), kanin anti-Bax (1 : 1000, Abcam), kanin anti-Bcl-2 (1 : 1000, Abcam) ja kanin anti-GAPDH (1 : 1000, Bioworld Technology, Louis Park, MN, USA). GAPDH havaittiin sisäisenä kontrollina. Tämän jälkeen kalvo koeponnisteltiin sekundaarisella piparjuuriperoksidaasilla (HRP) konjugoidulla vuohen anti-kani IgG:llä (1 : 5000, Bioworld) 1,5 h. Kaistat visualisoitiin kemiluminesenssimenetelmällä. Proteiinikaistojen keskimääräinen optinen tiheys kvantifioitiin Image J -ohjelmistolla.
2.9. Tilastollinen analyysi
Kokeelliset tiedot analysoitiin GraphPad Prism 5 -ohjelmistolla (San Diego, CA, USA). Numeeriset tiedot ilmaistiin keskiarvona ± SD. Kahden ryhmän välistä eroa verrattiin t-testillä. Piilotetun alustan kokeen tulokset analysoitiin ryhmä × päivä toistettujen toimenpiteiden ANOVA:lla, jota seurasi Tukeyn post hoc. Muut moninkertaiset vertailut analysoitiin yksisuuntaisella ANOVA:lla, jota seurasi Tukeyn post hoc. arvo < 0,05 katsottiin tilastollisesti merkitseväksi.
3. Tulokset
3.1. Tulokset
3. Xiao-Yao-San decoction parantaa ovariektomoitujen rottien spatiaalista oppimis- ja muistikykyä
Oppimiskykyä arvioitiin ensin spatiaalisen hankintakokeen avulla. Toistettujen toimenpiteiden ANOVA osoitti, että sekä hoito että harjoituspäivät vaikuttivat pakenemisviiveeseen (kuva 1(a)). Pakenemislatenssi laski kaikissa ryhmissä koulutuspäivien lisääntyessä (), ja ero oli myös merkittävä latenssin laskusuuntauksessa kunkin ryhmän sisällä (). Käsittelyn ja koulutuspäivien välillä ei ollut yhteisvaikutusta (). Kahden ensimmäisen koulutuspäivän aikana ei havaittu merkittävää eroa kunkin ryhmän pakenemislatenssissa. Kolmannesta koulutuspäivästä alkaen pakenemislatenssi oli merkittävästi pidempi kuin näennäisryhmän; E2- ja suuriannoksisen XYS9-ryhmän pakenemislatenssi oli lyhyempi kuin suolaliuosryhmän, mutta ei eronnut näennäisryhmän latenssista. Viiden päivän harjoittelun jälkeen rotat arvioitiin koekokeella avaruudellisen muistin testaamiseksi. Kuten kuvassa 1(b) on esitetty, ristiajat, kestoaika ja kestoajan prosenttiosuus koettimen kvadrantissa vähenivät merkittävästi suolaliuosryhmässä. Muiden kvadranttien kestoajoissa ei havaittu eroa. Hoito XYS:llä tai E2:lla pystyi merkittävästi palauttamaan poikkiajat ja kestoajat koettimen kvadrantissa näennäisryhmän tasolle. Jotta voitaisiin sulkea pois ympäristötekijöiden ja koe-eläinten kognitiivisten ja aktiivisuustasojen vaikutukset spatiaaliseen oppimiseen ja muistiin, rotille tehtiin myös näkyvän alustan koe (kuva 1(c)). Ryhmien välillä ei ollut merkittävää eroa pakenemisen viiveessä, uintimatkassa ja uintinopeudessa. Kaiken kaikkiaan nämä tulokset viittaavat siihen, että alueellinen oppiminen ja muisti olivat heikentyneet OVX-rotilla, ja suuriannoksinen XYS-hoito voisi tehokkaasti parantaa heikentyneitä kognitiivisia toimintoja.
(a)
(b)
(c)
(a)
(b)
(c)
3.2. Xiao-Yao-San keittäminen lisää Hippokampuksen estrogeenipitoisuutta Ovariektomoituneilla rotilla
Seuraavaksi tutkimme XYS:n vaikutusta OVX-rottien estrogeenitasoon. Kuten kuvasta 2(a) näkyy, XYS-hoito ei parantanut OVX:n vuoksi alentunutta seerumin estradiolipitoisuutta; seerumin estradiolipitoisuuksissa ei kuitenkaan ollut merkittävää eroa sham- ja OVX-hoitoryhmien välillä. Huomattavaa on, että suuret XYS- ja E2-annokset lisäsivät hippokampuksen estradioolitasoa verrattuna suolaliuokseen (kuva 2(b)). O-XYS3-ryhmässä hippokampuksen estradioolitasot olivat edelleen alhaisemmat kuin shamiryhmässä. Hippokampuksen E2-pitoisuuden muutos ei ehkä selity gonadista peräisin olevan E2-pitoisuuden muutoksella vaan in situ -synteesin muutoksella. Siksi havaitsimme estrogeenisynteesin viimeisen entsyymin CYP19:n ilmentymisen hippokampuksessa. Tulokset osoittivat, että XYS- tai E2-hoito saattoi lisätä CYP19:n ilmentymistä suolaliuosryhmään verrattuna (), mutta vain suuren annoksen XYS:n ja suolaliuosryhmän välinen ero oli merkitsevä (). Hoito ei palauttanut CYP19-tasoa näennäisryhmän tasolle. Tulokset viittaavat siihen, että XYS edisti aromataasin ilmentymistä hippokampuksessa, mikä lisäsi E2:n de novo -synteesiä.
(a)
(b)
(c)
(d)
. Yao-Sanin (XYS) vaikutus estradioli-synteesiin. Estradiolipitoisuus seerumissa (a) ja hippokampuksessa (b). (c-d) Sytokromi P450 aromataasin (CYP19) suhteellinen ilmentyminen hippokampuksessa. vs. sham; vs. sham; vs. O-saliini. Kunkin ryhmän tulokset edustavat 12 eläimen keskimääräisiä tietoja.
3.3. Xiao-Yao-San decoction vähentää hermosolujen vaurioita Ovariektomoitujen rottien hippokampuksessa
Hippokampuksen solumorfologialla, erityisesti CA1-alueella, on tärkeä rooli kognitiivisessa kyvyssä . Hippokampuksen solumorfologiaa analysoitiin Golgi-värjäyksellä, kuten kuvassa 3(a) on esitetty. Verrattuna sham-ryhmään suolaliuosryhmän neuronien määrä väheni merkittävästi, ja dendriittisten selkärankojen morfologia oli vaurioitunut. CA1-neuronien lisäanalyysi osoitti, että neuronien pistemäärä ja dendriittisten selkärangan tiheys vähenivät merkittävästi suolaliuosryhmässä (kuvat 3(b) ja 3(c)). Suuren annoksen XYS-hoito lisäsi neuronien lukumäärää hippokampuksessa ja nosti neuronien pistemäärää ja selkärangan tiheyttä CA1-alueella. E2-hoidolla oli sama terapeuttinen vaikutus kuin suurilla XYS-annoksilla. Pieni annos XYS ei kuitenkaan parantanut tehokkaasti hermosoluvaurioita hippokampuksen CA1-alueella. Johdonmukaisesti hippokampuksen (CA1, CA3, DG) neuronien apoptoosi väheni suurilla XYS- tai E2-annoksilla (kuva 4). Pieni annos XYS pystyi kuitenkin vähentämään vain CA3-neuronien apoptoosia, mutta sillä ei ollut vaikutusta CA1- ja DG-neuroneihin. Kaiken kaikkiaan suuriannoksinen XYS saattoi vähentää hermosoluvaurioita hippokampuksessa, erityisesti CA1-alueella.
(a)
(b)
(c)
(a)
(b)
(c)
(a)
(b)
(a)
(b)
(a)
(b)
Xiao-Yao-San keittäminen lisää NMDAR2A:n ja NMDAR2B:n hippokampuksen ilmentymistä ovariektomisoiduilla rotilla.
Synaptinen plastisuus on pitkäaikaisen oppimisen ja muistin neurobiologinen perusta, ja suorituskykyyn MWM-testissä vaikuttaa NMDAR:n toiminta . Siksi arvioimme edelleen NMDAR-alayksiköiden 2A ja 2B ilmentymistä hippokampuksen CA1:ssä. Western blot (kuvat 5(a) ja 5(b)) osoitti, että NMDAR2A:n ja NMDAR2B:n ilmentyminen väheni OVX-rotilla. Hoito XYS:llä tai E2:lla lisäsi merkittävästi näiden kahden proteiinin ilmentymistasoa samalle tasolle kuin sham-ryhmässä. Immunohistokemia (kuva 5(c)) osoitti myös, että positiivisesti värjättyjen solujen osuus kasvoi hoitoryhmissä. Suolaliuosryhmään verrattuna suuri annos XYS lisäsi merkittävästi sekä NMDAR2A:n että NDMAR2B:n ilmentymistä ( ja 0,013, vastaavasti), mutta pieni annos XYS pystyi lisäämään merkittävästi vain NMDAR2A:n ilmentymistä ().
(a)
(b)
(c)
(a)
(b)
(c)
3.4. Xiao-Yao-San keittäminen aktivoi PI3K-signalointireitin ERα:n kautta
E2:n tai fytoestrogeenien vaikutusta fysiologiaan välittää ER-signalointi. Tutkimukset ovat osoittaneet, että ekstrasellulaarisen signaalin säätelemän kinaasin (ERK), mitogeeni-aktivoidun proteiinikinaasin, aktivoituminen on välttämätöntä E2:n edullisille vaikutuksille muistiin . ERK1/2:n fosforylaatio on riippuvainen PI3K:n aktivoitumisesta . Siksi tutkimme XYS:n vaikutusta ER-PI3K-signalointiin. Kuten kuvasta 6 käy ilmi, suuri annos XYS ja E2 edistivät merkittävästi ERα:n, fosforyloituneen ERα:n (Ser118) ja PI3K p110β:n (katalyyttinen alayksikkö) ilmentymistä verrattuna suolaliuosryhmään. ERα-PI3K:n aktivointi vähensi edelleen proapoptoottisen tekijän Baxin ilmentymistä ja lisäsi antiapoptoottisen tekijän Bcl-2:n ilmentymistä. Pieni XYS-annos ei kuitenkaan vaikuttanut merkittävästi ERα-PI3K-signalointiin, mikä vastaa kuvien 3 ja 4 tuloksia.
(a)
(b)
(c)
(d)
(e)
(f)
(a)
(b)
(c)
(d)
(e)
(f)
4. Keskustelu
XYS:ää on pitkään käytetty perimenopausaalisen ahdistuksen ja masennuksen hoitoon. Tutkimuksessamme tutkittiin XYS:n uutta sovellusta OVX:n aiheuttaman kognitiivisen heikkenemisen hoidossa. Tulokset osoittivat, että XYS paransi tehokkaasti avaruudellista oppimista ja avaruudellista muistia OVX-rotilla. Mahdollinen mekanismi on, että XYS edistää estrogeenin de novo -synteesiä hippokampuksessa, jolloin ERα-PI3K-signalointireitti aktivoituu ja hippokampuksen neuronien apoptoosi estyy.
XYS:n taustalla olevaa mekanismia masennuksen hoidossa on tutkittu laajasti. XYS:llä on masennuslääkkeellinen rooli säätelemällä kattavaa verkostoa, johon kuuluu välittäjäaineita, neurotrofiineja, hypotalamus-aivolisäke-lisämunuais-akselia, aminohappoja ja lipidejä . Jotkut näistä tutkimuksista ovat osoittaneet, että XYS voi vaikuttaa stressiin liittyviin aivomuutoksiin. In vitro -määritykset osoittivat, että XYS:ää sisältävä seerumi pystyi kumoamaan oksidatiivisen stressin aiheuttaman muutoksen mitokondrioiden kalvopotentiaalissa, vapaan kalsiumin pitoisuudessa ja neuronien apoptoosinopeudessa . Tutkimuksemme osoitti, että XYS vaimensi myös hermosolujen apoptoosia OVX-rottien hippokampuksen alueella. XYS:n antiapoptoottiset vaikutukset viittaavat siihen, että sillä oli potentiaalia vaikuttaa useisiin aivojen neuronien apoptoosiin liittyviin patologisiin prosesseihin.
Tutkimuksemme tulokset osoittivat, että XYS saattoi palauttaa estrogeenitason OVX-rottien hippokampuksessa. Hippokampus on olennainen muistin muodostumiselle ja siinä on runsaasti ER:iä, ja estrogeeni helpottaa korkeampaa kognitiivista ja synaptista terveyttä näiden ER:ien kautta . Useat kliiniset tutkimukset osoittivat hormonikorvaushoidon tehokkuuden estrogeenin menetykseen liittyviin kognitiivisiin oireisiin naisilla . XYS voisi lisätä estradiolipitoisuutta hippokampuksessa, minkä pitäisi olla ratkaiseva perusta sen tehokkuudelle OVX-rottien kognitiivisten kykyjen parantamisessa. XYS ei kuitenkaan nostanut seerumin estradiolipitoisuutta. Tämä voi johtua siitä, että estradiolia voidaan syntetisoida de novo hippokampuksessa, kun taas seerumin estradioli on peräisin sukurauhasista . Tuloksemme osoittivat, että XYS lisäsi CYP19:n ilmentymistä hippokampuksessa, mikä viittaa siihen, että lisääntynyt E2 aivoissa oli todennäköisesti peräisin hippokampuksesta . Tutkimuksemme tulokset osoittivat, että XYS sääteli NMDAR2A:n ja NMDAR2B:n ilmentymistä OVX-rottien hippokampuksessa. Tämä havainto oli yhdenmukainen aiempien tutkimusten kanssa. Estrogeenin havaittiin lisäävän sekä dendriittisten selkärankojen tiheyttä että synapsien määrää hippokampuksessa moduloimalla NMDAR-toimintoja OVX-rotilla . Estrogeeni voisi myös palauttaa hippokampuksen neuronien morfologian ikääntyneillä rotilla palauttamalla NMDAR2B-tason nuorella tasolla CA1-alueella; lisäksi estrogeeni voi vaikuttaa NMDAR2A: n ja NMDAR2B: n liikkuvuuteen synapsin yli . NMDAR:n aktivoituminen puolestaan voisi edistää hippokampuksen E2:n synteesiä indusoimalla Ca2+ -tuloa .
NMDAR:ien lisäksi XYS voi säädellä muiden kognitioon liittyvien tekijöiden ilmentymistä aivoissa. Postsynaptisen tiheysproteiini 95:n (PSD-95), synaptofysiinin ja aivoista peräisin olevan neurotrofisen tekijän (BDNF) häviäminen hippokampuksessa on suoraan korreloitu oppimisen ja muistin puutteiden kanssa . XYS:n vaikutus CIS-rotilla on liittynyt PSD-95:n ja synaptofysiinin ilmentymisen edistämiseen hippokampuksessa . XYS:n on myös osoitettu sääntelevän BDNF:ää CIS-rottien otsalohkossa, hippokampuksen CA1-alueella ja amygdalassa . XYS: n CIS-hoitoprosessin aikana c-Jun N-terminaalisen kinaasin (JNK) signalointireitti estettiin hippokampuksessa .
Vaikka emme ole erityisesti tutkineet, mikä komponentti on XYS: n tärkein aktiivinen oppimiseen ja muistiin, tuloksemme viittaavat siihen, että XYS: n fytoestrogeenien pääasiallinen lähde XYS: ssä on ehdokkaana jatkotutkimuksen arvoinen. Masennuslääkkeiden tutkimus voi myös antaa meille joitakin vihjeitä. Jiali Liu et al. havaitsivat, että Bupleuri radix (Chaihu) on pääasiallinen masennuslääke XYS-reseptissä petrolieetterifraktion seerumin farmakokemiallisen analyysin perusteella . In vitro -tutkimus osoitti, että Bupleuri radix -uute edisti neuroblastoomasolujen lisääntymistä aktivoimalla PI3K/AKt-reittiä . PI3K:n aktivoituminen havaittiin myös tutkimuksessamme. .
Nykyaikaiset kliiniset raportit osoittavat, että XYS:llä on merkittävä masennuslääkkeellinen terapeuttinen vaikutus, mutta XYS:n myrkyllisyydestä ja sivuvaikutuksista ei ole olemassa selkeää toksikologista tutkimusta yksityiskohtaisesti. Yleisesti ottaen XYS:ää voidaan pitää reseptilääkkeenä, jolla ei ole liikaa sivuvaikutuksia. XYS:ssä on useita muunneltuja reseptejä, joiden perusainekset ovat samat kuin XYS:ssä. Tuoreessa meta-analyysissä arvioitiin modifioidun XYS:n tehoa ja turvallisuutta perimenopausaalisen oireyhtymän hoidossa. Yhteenlasketut tulokset viittaavat siihen, että muunnettu XYS saattaa olla tehokkaampi ja turvallisempi perimenopausaalisen oireyhtymän hoidossa verrattuna hormonikorvaushoitoon . Mukana olleiden tutkimusten heikon metodologian vuoksi XYS:n teho ja turvallisuus on kuitenkin vahvistettava tarkemmilla tutkimuksilla. Xiaoxia Gaon tutkimusryhmä raportoi 1H-ydinmagneettiresonanssimenetelmää (NMR) käyttäen, että lipofiilisiä komponentteja sisältävä petrolieetterifraktio oli tehokkain masennuksen hoidossa . He raportoivat myös, että Bupleuri Radix, pääasiallinen masennuslääkkeen komponentti, saattoi aiheuttaa enemmän myrkyllisiä vaikutuksia terveiden rottien maksaan tai munuaisiin kuin rotilla, joilla oli krooninen ennalta arvaamaton lievä stressi. Toksiset vaikutukset liittyivät lisääntyneeseen sappihappopitoisuuteen, lysiinin hajoamisen helpottumiseen ja sfingolipidien, glyserofosfolipidien ja rasvahappojen metabolisiin häiriöihin . Tämä tulos vahvistettiin hiljattain tehdyssä metabolomitutkimuksessa masennuspotilailla. XYS:llä oli masennuslääkkeellinen rooli säätelemällä leusiinin, valiinin ja isoleusiinin synteesiä sekä binaarihapon, rasvahapon, argiinin ja proliinin metaboliaa . Nämä tutkimukset viittaavat siihen, että potilaan tilaa on seurattava tarkasti ja lääkeannosta on säädettävä ajoissa toksisten sivuvaikutusten ehkäisemiseksi.
5. Johtopäätökset
Tässä tutkimuksessa osoitimme, että suuriannoksisella XYS-hoidolla oli samanlainen teho kuin E2:lla OVX-rottien kognitiivisten kykyjen parantamisessa. Terapeuttinen vaikutus välittyi hippokampuksen neuronien suojaamisesta ja hippokampuksen E2-tason palauttamisesta. ERα-PI3K-signalointireitti oli mukana prosessissa. Tutkimuksemme viittaa siihen, että XYS voisi olla vaihtoehto perimenopausaalisen kognitiivisen heikkenemisen hoidossa. Tällä hetkellä XYS:ää käytetään pääasiassa kliinisen ahdistuksen ja masennuksen hoidossa. Tarvitaan lisää kliinisiä tietoja sen vaikutuksen todentamiseksi kognitiivisten toimintojen parantamiseen.
Tietojen saatavuus
Tämän tutkimuksen tulosten tukena käytetyt tiedot ovat pyynnöstä saatavissa vastaavilta kirjoittajilta.
Interintäristiriidat
Tekijät ilmoittavat, että heillä ei ole eturistiriitoja missään muodossa.
Tekijöiden panos
Lina Liu ja Fei Ge osallistuivat tasapuolisesti tähän tutkimukseen.
Kiitokset
Tämän tutkimuksen tukena on ollut Kiinan kansallinen luonnontieteellinen tutkimussäätiö (apurahat nro. 81603578, 81503536, 81673795 ja 81903974); Jiangsun maakunnan luonnontieteellinen säätiö (apuraha nro BK20181235); Jiangsun maakunnan perinteisen kiinalaisen lääketieteen toimisto (apuraha nro YB2017066); Nanjingin tieteen ja teknologian kehittämissuunnitelmaprojekti (apuraha nro. 201715072); Jiangsun maakunnan kiinalaisen lääketieteen sairaalan hanke (apuraha nro Y2018CX09); ja Jiangsun korkeakoulujen ensisijaisen akateemisen ohjelman kehittämisen rahoittama hanke.