Kemialliset aineet ja reagenssit
GT ostettiin Taichungin, Taiwanin markkinoilta. IS (puhtaus 97 %) saatiin Alfa Aesarilta (Lancaster, Yhdistynyt kuningaskunta). 6,7-dimetoksikumariini (6,7-DMC, puhtaus 98 %) toimitti Aldrich Chemical Co. (Milwaukee, WI, Yhdysvallat). EC (puhtaus 90 %), ECG (puhtaus 98 %), EGCG (puhtaus 95 %), muurahaishappo, probenesidi, fosforihappo (jäähappo, 85 %) ja metyyliparabeeni ostettiin Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO, Yhdysvallat). EGC (puhtaus 92,7 %) saatiin ChromaDex, Inc. (Irvine, CA, U.S.A.) ja etyyliasetaatti olivat LC-laatua ja ne hankittiin ECHO Chemical Co. (Miaoli Hsien, Taiwan). Asetonitriili oli LC/MS-laatua ja se hankittiin Millinckrodt Baker, Inc. (Phillipsburg, NJ, Yhdysvallat). Naudan sikiöseerumi saatiin Biological Industries Inc. (Kibbutz, Beit Haemek, Israel). Penisilliini-streptomysiini-glutamiini, Dulbecco’s Modified Eagle Medium, trypsiini/EDTA, Hank’s Balanced Salt Solution ja 4-(2-hydroksietyyli)-1-piperatsiinietaanisulfonihappo ostettiin Invitrogenilta (Carlsbad, CA, Yhdysvallat). Dulbecco’s Modified Eagle Medium F12 saatiin Thermo Fisher Scientific Inc:ltä (Waltham, MA, Yhdysvallat). 6-karboksifluoresceiini ostettiin AAT Bioquest Inc:ltä. (Sunnyvale, CA, Yhdysvallat) ja 5-karboksifluoresceiini Acros Organicsilta (Geel, Belgia). Kaikissa valmisteissa käytettiin Milli-Q plus -vettä (Millipore, Bedford, MA, U.S.A.).
GT-infuusion valmistus ja karakterisointi
Infuusio valmistettiin hauduttamalla joko 2 tai 4 g GT:tä 50 ml:ssa kuumaa deionisoitua vettä (98-100 °C) 30 minuutin ajan. Infuusio suodatettiin sideharsolla kuumana, jotta saatiin 40 ja 80 mg/ml:n pitoisuudet, jotka annettiin tuoreena rotille mahalaukun kautta.
GT-infuusion karakterisointia varten GT-infuusion suodattamisen jälkeen 0,2 μm:n RC15-suodattimella (Sartorious, Göttingen, Saksa) 100 μl suodosta sekoitettiin 900 μl:aan metanolia ja sentrifugoitiin sakan poistamiseksi. Asianmukaisesti laimennettu infuusio (50 μL) yhdistettiin 50 μL:aan 6,7-DMC-liuosta (2,0 μg/ml metanolissa) sisäisenä standardina ja 5 μL:aan tehtiin LC-MS/MS-analyysi. HPLC-järjestelmään kuului Accela 1250 -pumppu ja automaattinen näytteenotin (Thermo Fisher Scientific Inc. U.S.A.). Kromatografinen erottelu tehtiin käyttämällä Phenomenex® C18 -analyysikolonnia (150 mm × 1,0 mm, 5 μm), jossa oli esisuodatin. Liikkuva faasi koostui asetonitriilistä, joka sisälsi 0,01 % muurahaishappoa (A), ja vedestä, joka sisälsi 0,01 % muurahaishappoa (B), ja se ohjelmoitiin gradienttina seuraavasti: A/B: 2/98 (0-2 min), 15/85 (4 min), 40/60 (6 min), 90/10 (8-10 min) ja 2/98 (12 min). Virtausnopeus oli 0,2 ml/min. Kolonnin ulostulovirta havaittiin H-ESI (lämmitetty sähkösuihku-ionisaatio) -II-koettimella Quantum Access MAX kolmivaiheisella kvadrupoli (TSQ) -massaspektrometrillä (Thermo Fisher Scientific Inc. U.S.A.). Typpiä käytettiin vaippakaasuna 35 mielivaltaista yksikköä ja apukaasuna 10 mielivaltaista yksikköä. Törmäysenergiaksi asetettiin -19/18 V, ruiskutusjännitteeksi -3000/3000 V, kapillaarilämpötilaksi 350 °C, höyrystimen lämpötilaksi 350 °C ja putkilinssioffsetiksi -80/88 V. Valittujen reaktioiden seuranta-analyysissä (SRM) käytettiin seuraavia massasiirtymiä: EC (289/245), EGC (305/125), ECG (441/289), EGCG (457/169) ja 6,7-DMC (207/151). ESI-MS-spektrit kirjattiin negatiivisessa ionimoodissa EC:n, EGC:n, ECG:n ja EGCG:n osalta ja positiivisessa ionimoodissa 6,7-DMC:n osalta.
eläimet
Sprague-Dawley-rotat (270-360 g) ostettiin kansallisesta koe-eläinkeskuksesta (Taipei, Taiwan), ja ne pidettiin ilmastoidussa ympäristössä, jossa oli 12 tunnin valo/pimeä jakso. Ruokaa ja vettä hankittiin ad libitum 12 tuntia ennen kokeita. Rotat jaettiin kahteen ryhmään. Ensimmäisessä kokeessa käytettiin 28 rottaa määrittämään GT:n vaikutus CRF-rottien seerumin IS- ja PCS-pitoisuuksiin; toisessa kokeessa käytettiin 14 rottaa arvioimaan GT:n vaikutusta CRF-rottien munuaistoimintaan. Kaikki eläinkokeet suoritettiin tiukasti Kiinan eläintieteellisen yhdistyksen (Chinese Society of Animal Science, Taiwan, R.O.C.) julkaiseman ”The Guidebook for the Care and Use of Laboratory Animals (2002)” suositusten mukaisesti. China Medical University, Taiwan, R.O.C., Insititutional Animal Care and Use Committee of China Medical University, Taiwan, R.O.C., oli tarkastanut ja hyväksynyt koeprotokollan 08/01/2014 (lupanumero: 103-126-N).
CRF-mallin luominen ja GT-infuusion antaminen
CRF:n indusoitiin adeniinin oraalisella annostelulla aiempien tutkimusten mukaisesti, mutta tietyin modifikaatioin19,23,35,36. Lyhyesti sanottuna 0,5-prosenttiseen metyyliselluloosaan 400 (15 mg / ml) suspendoitua adeniinia annettiin suun kautta 28 rotalle mahalaukun kautta kahdesti päivässä seitsemän peräkkäistä annosta (15 mg / rotta) koko koejakson ajan. Päivänä 4 määritettiin seerumin IS-pitoisuudet. Kun vahvistettiin munuaistoiminnan heikentyminen seerumin IS-pitoisuuksien merkittävän kohoamisen myötä, CRF-rotat jaettiin kolmeen ryhmään (8-10 rottaa kussakin ryhmässä), joiden IS-pitoisuudet olivat vertailukelpoisia. Ensimmäinen ryhmä sai 400 mg/5 ml/kg GT-infuusiota kahdesti päivässä seitsemän peräkkäisen annoksen ajan; toinen ryhmä sai 200 mg/5 ml/kg GT-infuusiota kahdesti päivässä seitsemän peräkkäisen annoksen ajan; ja kolmas ryhmä sai rinnakkain 5 ml/kg vettä kontrollina. Päivänä 8 rotille annettiin seitsemäs GT-annos klo 9.00 yön yli kestäneen paaston jälkeen, ja verinäytteet otettiin 0, 15, 30, 60, 120, 180 ja 360 minuutin kuluttua annostelusta. Verenkeräyksen ja adeniinin ja GT:n annostelun suunnitellut ajankohdat on esitetty yhteenvetona kuvassa 3. Jokaisena näytteenottoajankohtana otettiin 0,5 ml verta isofluraanianestesiassa. Verinäytteet kerättiin mikroputkiin ja sentrifugoitiin 10 000 g:ssa 15 minuutin ajan seerumin saamiseksi, joka säilytettiin -20 °C:ssa ennen analysointia.
Seerumin IS- ja PCS-pitoisuuksien määrittäminen
Seerumin IS- ja PCS-pitoisuuksien määrittämiseksi 50 μl seeruminäytettä vorteksoitiin 200 μl:lla metanolia, joka sisälsi sisäisinä standardeina 10 μg/mL 6,7-DMC:tä tai 100 μg/mL metyyliparabeenia, ja sentrifugoitiin saostuman poistamiseksi, minkä jälkeen 20 μl:n alikvootti analysoitiin HPLC-analyysillä.
Kalibraattorivalmisteita varten 50 μl seerumia piikitettiin IS- ja PCS-pitoisuussarjoilla, jotta saatiin pitoisuusalueet 0,4-25,0 μg/ml (1,8-117,3 μM) ja 0,3-20,0 μg/ml (1,7-106,3 μM). Jälkimmäinen menettely noudatti edellä seeruminäytteille kuvattua menettelyä. Kalibrointikäyrät piirrettiin lineaarisella regressiolla piikin pinta-alan suhteista (IS tai PCS:n ja sisäisen standardin välillä) IS:n ja PCS:n tunnettuja pitoisuuksia vastaan.
HPLC-laitteistoon kuului pumppu (LC-10AT, Shimadzu, Kioto, Japani), fluoresenssidetektori (RF-20A, Shimadzu, Kioto, Japani) ja automaattinen injektori (SIL-10AF, Shimadzu, Kioto, Japani). Apollo C18 (5 μm, 4,6 mm × 250 mm, Alltech, Deerfield, IL, USA) -kolonni oli varustettu suojakolonnilla (4,6 × 50 mm, 5 μm) (GL Science Inc., Tokio, Japani). Liikkuva faasi koostui asetonitriilistä (A)-0,1 % fosforihaposta (B) ja ohjelmoitiin gradienttina seuraavasti: A/B: 15/85 (0-7 min), 30/70 (9-22 min) ja 15/85 (24-35 min) IS:lle ja 16/84 (0-10 min), 30/70 (13-22 min) ja 16/84 (24-36 min) PCS:lle. Detektorin asetukset olivat Ex 280 nm/Em 375 nm IS:lle ja Ex 214 nm/Em 306 nm PCS:lle. Virtausnopeudet olivat 1,0 ml/min.
GT:n vaikutus CRF-rottien Cr- ja BUN-pitoisuuksiin
Toisessa kokeessa käytettiin samaa edellä mainittua eläinprotokollaa, ja Cr- ja BUN-pitoisuudet määritettiin ennen adeniinihoitoa (0. päivä), ennen GT:n annostelua (4. päivä) ja GT:n seitsemännen annoksen jälkeen (8. päivä). Kun munuaistoiminnan heikkeneminen varmistui Cr:n ja BUN:n merkittävänä kohoamisena päivänä 4, CRF-rotat jaettiin kahteen ryhmään (7 rottaa per ryhmä), joiden Cr-pitoisuudet olivat vertailukelpoisia. Ensimmäinen ryhmä sai 400 mg/5 ml/kg GT:tä kahdesti päivässä seitsemän peräkkäisen annoksen ajan; toinen ryhmä sai samanaikaisesti 5 ml/kg vettä kontrollina. Päivänä 8 rotille annettiin seitsemäs annos GT:tä ja vettä yön yli kestäneen paaston jälkeen, ja verinäytteet otettiin 30 minuuttia myöhemmin. Cr määritettiin kineettisellä alkalipikraattimenetelmällä ADVIA 2400 Chemistry System -järjestelmässä (Siemens Health Care Diagnostics, Inc. Tarrytown, NY, U.S.A.). BUN määritettiin ureaasi/glutamaattidehydrogenaasi-kytkentäentsyymireaktiolla käyttäen samaa analysaattoria.
Solulinja ja viljelyolosuhteet
Kuljetustutkimuksissa käytettyjen stabiilisti transfektoitujen solulinjojen, kiinalaisen hamsterin munasarjasolujen (CHO), jotka ilmentävät hOAT1:tä (CHO-hOAT1), ihmisen alkiomunuaisen 293-solujen (HEK), jotka ilmentävät hOAT3:aa (HEK-hOAT3), ja vastaavien tyhjällä vektorilla transfektoitujen kontrollisolulinjojen rakentaminen kuvattiin aiemmin40,41. CHO-soluja pidettiin 37 °C:ssa ja 5 % CO2:ssa DMEM F-12 -mediassa (Thermo Fisher Scientific Inc., Yhdysvallat), joka sisälsi 10 % seerumia, 1 % penisilliiniä/streptomysiiniä ja 1 mg/ml G418:a. HEK-soluja pidettiin 37 °C:ssa ja 5 % CO2:ssa DMEM high glucose -mediassa (Thermo Fisher Scientific Inc., USA), joka sisälsi 10 % seerumia, 1 % penisilliiniä/streptomysiiniä ja 50 μg/ml hygromysiini B:tä. Soluja kasvatettiin Poly-D-Lysiinillä päällystetyissä maljoissa.
GT:n seerumin metaboliittien (GTM)
OAT:ien kanssa vuorovaikutuksessa olevia molekyylejä in vivo jäljittelevien molekyylien simuloimiseksi GTM:iä valmistettiin rotista ja karakterisoitiin. Lyhyesti sanottuna GT-infuusio (800 mg/10 ml/kg) annettiin suun kautta rotille, jotka olivat paastona yön yli. Veri kerättiin 15 minuutin kuluttua GT-infuusion annostelusta. Hyytymisen jälkeen seerumi kerättiin ja vorteksoitiin 3-kertaisella metanolilla. Sentrifugoinnin jälkeen 10 000 g:ssa 15 minuutin ajan supernatantti konsentroitiin pyörivässä haihduttimessa tyhjiössä kuivaksi. Jäämään lisättiin sopiva määrä vettä, jolloin saatiin liuos, jonka seerumikonsentraatio oli 10-kertainen; liuos jaettiin alikvootteihin ja varastoitiin -80 °C:ssa myöhempää käyttöä varten.
GTM:n osa karakterisoitiin aikaisemman menetelmän mukaisesti muutamin muutoksin16,46. Lyhyesti sanottuna 100 μl seeruminäytettä sekoitettiin 50 μl:aan sulfataasia (joka sisälsi 1000 yksikköä/ml sulfataasia ja 39 861 yksikköä/ml ß-glukuronidaasia), 50 μl:aan askorbiinihappoa (200 mg/ml) ja inkuboitiin 37 °C:ssa 45 minuuttia anaerobisissa olosuhteissa. Hydrolyysin jälkeen seerumi lisättiin 50 μl:aan 0,1 N HCl:ää ja jaettiin sitten 250 μl:lla etyyliasetaattia (joka sisälsi 100 ng/ml 6,7-DMC:tä sisäisenä standardina). Etyyliasetaattikerros haihdutettiin N2:ssa kuivaksi ja palautettiin sopivalla määrällä liikkuvaa faasia ennen LC-MS/MS-analyysiä. Liikkuva faasi koostui asetonitriilistä (A) – vedestä, joka sisälsi 0,1 % muurahaishappoa (B), ja se ohjelmoitiin gradienttina seuraavasti: A/B: 2/98 (0-2 min), 15/85 (4 min), 40/60 (6 min), 90/10 (8-10 min) ja 2/98 (12 min). Virtausnopeus oli 0,2 ml/min.
GTM:n vaikutus hOAT1:n ja hOAT3:n välittämään ottokuljetukseen
CHO-hOAT1- ja HEK-hOAT3-soluja (1 × 105 solua/kuoppa) kasvatettiin 96-kuoppalevyssä. 6-karboksifluoresceiinia (6-CF) ja 5-karboksifluoresceiinia (5-CF) käytettiin koettimina arvioitaessa GTM:n vaikutusta hOAT1:n ja hOAT3:n aktiivisuuteen47,48. Lisäksi probenesidiä (80 μM) käytettiin positiivisena kontrollina hOAT1:n ja hOAT349 estämiseksi. CHO-hOAT1:n tai HEK-hOAT3:n 24 tunnin tai 48 tunnin inkubaation jälkeen väliaine poistettiin ja pestiin kolme kertaa PBS-puskurilla. Ennen kuljetuskokeita CHO-hOAT1- ja HEK-hOAT3-soluja esi-inkuboitiin 37 °C:ssa testiaineiden (GTM ja probenesidi) kanssa. 30 minuutin inkuboinnin jälkeen lisättiin 6-CF tai 5-CF ja inkuboitiin vielä 5 min ja 10 min. Levyt asetettiin välittömästi jäähauteeseen, supernatantit poistettiin ja solut pestiin kolme kertaa jääkylmällä PBS:llä. Tämän jälkeen lisättiin 100 μl 0,1-prosenttista Triton X-100:a solujen liuottamiseksi ja fluoresenssi mitattiin herätteellä 485 nm:ssä ja emissiolla 528 nm:ssä. Proteiinipitoisuuden kvantifioimiseksi kussakin kuopassa 10 μl solulysaattia lisättiin 200 μl:aan laimennettua proteiinimääritysreagenssia (Bio-Rad, Hercules, CA, U.S.A.) ja optinen tiheys mitattiin 570 nm:ssä. 6-CF:n tai 5-CF:n suhteellinen solunsisäinen kertyminen laskettiin vertaamalla sitä kontrolleihin proteiinikorjauksen jälkeen.
Tietojen analysointi
Seerumin huippupitoisuus (Cmax) saatiin kokeellisesta havainnosta. Seerumin pitoisuus – aikakäyrän alapuolinen pinta-ala (AUC0-t) laskettiin käyttämällä trapetsisääntöä viimeiseen pisteeseen. IS:n ja PCS:n erot kolmen ryhmän välillä analysoitiin yksisuuntaisella ANOVA:lla, kun taas Cr:n ja BUN:n ero kahden ryhmän välillä analysoitiin parittomalla Studentin t-testillä käyttäen p < 0,05 merkitsevänä tasona. Parittelematonta Studentin t-testiä käytettiin myös in vitro -määritysten analysointiin.