The function of chaperone proteins in the assemblage of protein complexes involved in gamete adhesion and fusion processes

Multiproteiinikompleksit siittiöiden kapasitaatiossa ja ZP-vuorovaikutuksessa

Tullessaan hedelmöittymispaikalle, ampullaan, siittiöiden on läpäistävä kaksi estettä ennen kuin ne sulautuvat munasolun plasmamembraaniin eli oolemmaan. Ensimmäinen näistä esteistä on munasolua ympäröivä hyaluronihappopitoinen kumulussolujen kerros, ja toinen on itse munasolun solunulkoinen matriisi, ZP (Hartmann ym. 1972). Huolimatta siitä, että sekä ZP:n että hyaluronihapon sitoutumiskohtien kehittymisestä spermatogeneesin aikana ja sitoutumispotentiaalin hankkimisesta siemennesteen kulkiessa lisäkudoksen läpi, nämä solut tarvitsevat erillisen oleskeluajan naaraan sukuelimissä, ennen kuin ne pystyvät menestyksekkäästi osallistumaan tällaiseen vuorovaikutukseen (Austin 1951, Chang 1951). Kollektiiviset muutokset, joita siittiöissä tapahtuu tässä ympäristössä ja joita kutsutaan kapasitaatioksi, antavat soluille mahdollisuuden reagoida cumulus oocyte -kompleksista peräisin oleviin signaaleihin ja saattaa päätökseen akrosomaalisen eksosytoosin prosessin, joka tekee niistä kyvykkäitä fuusioitumaan oolemman kanssa.

ZP koostuu useista sulfoglykoproteiineista, nimittäin ZP1:stä, ZP2:sta ja ZP3:sta, jotka ovat hyvin konservoituneita useimmissa nisäkäslajeissa (vaikka ihmisen ja sian munasoluissa on raportoitu ylimääräinen ligandi, ZP4/B) (Wassarman ym. 1999, Lefievre ym. 2002, Yonezawa ym. 2012). Yleisesti katsotaan, että nämä ligandit hallitsevat siittiöiden sitoutumista useimmilla lajeilla (ks. myös Reid ym. (2011)). Huomionarvoista on kuitenkin se, että tällä hetkellä pohditaan edelleen erilaisia malleja, jotka koskevat ZP:ssä olevan ensisijaisen siittiöiden reseptorin identiteettiä ja mekanismeja, joiden avulla siittiöt kiinnittyvät tähän matriisiin (ks. myös Visconti & Florman (2010)). Vastaavasti tutkimukset, jotka koskevat sellaisten vastaavien siittiöiden pintareseptorien identiteettiä, jotka tunnistavat sopivan ligandin tai sopivat ligandit ZP:ssä, eivät myöskään ole antaneet lopullisia vastauksia. Itse asiassa on olemassa kasvava kirjallisuus lupaavien reseptoriproteiiniehdokkaiden (mukaan lukien β-1,4-galaktosyylitransferaasi (GALT1), aryylisulfaasi A (ARSA) ja siittiöiden adheesiomolekyyli 1 (SPAM1); täydellinen luettelo, ks. Ikawa ym. (2010)) hiirten knockout-menetelmistä, jotka kaikki eivät johda täydelliseen hedelmättömyyteen (Hess ym. 1996, Asano ym. 1997, Baba ym. 2002). Pikemminkin esiintyy eriasteisesti alentunutta sitoutumiskykyä, mikä nostaa esiin mahdollisuuden, että tähän prosessiin sisältyy jonkinasteista toiminnallista redundanssia ja että useat siittiöiden proteiinit toimivat yhdessä välittäessään ZP:n adheesiota. Näiden proteiinien toiminnan koordinointi tuottavan ZP-vuorovaikutuksen varmistamiseksi on näin ollen nousemassa tärkeäksi tutkimuskohteeksi.

Useimmilla nisäkkäillä siittiöiden kapasitaation uskotaan käynnistyvän cAMP-välitteisen reitin aktivoitumisella, joka huipentuu useiden siittiöproteiinien tyrosiinifosforylaatioon (Visconti ym. 1995a, 1995b, Leclerc ym. 1996). Molekulaariset chaperonit ovat näkyvästi mukana näissä proteiineissa, ja HSP90AA1, HSP90B1 ja HSPD1 ovat yksi niistä proteiineista, joiden on osoitettu osoittavan tyrosiinifosforylaatiota kapasitaation seurauksena (Ecroyd ym. 2003, Asquith ym. 2004). Nykyiset mallit viittaavat siihen, että näiden chaperonien fosforylaatio kapasitaation aikana käynnistää niiden aktiivisen roolin ZP-tunnistusproteiinien kokoamisessa komplekseiksi ja/tai näiden kompleksien translokaatiossa siittiöiden pinnalle valmisteltaessa hedelmöittymistä (Ecroyd ym. 2003, Asquith ym. 2004, Nixon ym. 2005, Gadella 2008). Tämän epäsuoran roolin lisäksi sukusolujen adheesiossa siittiöiden pinnan chaperoneilla on myös oletettuja tehtäviä adheesiomolekyyleinä, jotka välittävät sulfoglykolipidien tunnistamista sukusolujen sitoutumisen aikana (Boulanger ym. 1995, Mamelak & Lingwood 2001).

Viime aikoina sinisen natiivin PAGE:n (BN-PAGE) tekniikkaa, joka on alun perin kehitetty elektroninkuljetusketjun multientsyymikompleksien analysoimiseksi (Schägger & von Jagow 1991, Schägger ym. 1994), on mukautettu hiirten ja ihmisten multimeeristen siittiöiden pintakompleksien arviointiin (Dun ym. 2011, Redgrove ym. 2011). Tämä tekniikka mahdollistaa sellaisten natiivien proteiinikompleksien elektroforeettisen resoluution, jotka säilyttävät biologisen aktiivisuutensa. Ihmisen ja hiiren siittiöissä BN-PAGE:n käyttö samanaikaisesti Far-Western blottingin kanssa kokonaisilla liuotetuilla zonaeilla on paljastanut useita primaarisia moniproteiinikomplekseja, joilla on affiniteetti homologiseen ZP:hen (Dun ym. 2011, Redgrove ym. 2011).

Yksi tällaiseksi kompleksiksi on raportoitu CCT/TRiC-kompleksin (CCT1-CCT8) proteiinikomponentit; CCT1-CCT8 on kaksoiskehärakenne, joka toimii molekulaarisena chaperonina, jolla on keskeinen rooli multiproteiinikompleksien muodostumisen säätelyssä (Feldman ym. 1999, Guenther ym. 2002). Yhteisimmunoprecipitaatio-, yhteislokalisaatio- ja läheisyysligaatiomäärityksillä saadut oletetut todisteet ovat osoittaneet ZP:tä sitovan proteiini 2:n (ZPBP2) yhdeksi CCT/TRiC-kompleksin vakuuttavimmista asiakasproteiineista kypsissä siemennesteissä (Dun ym. 2011, Redgrove ym. 2011). Alun perin ZP:n sekundaariseen sitoutumiseen osallistuneena, uudempi tutkimus on osoittanut, että uroshiiret, joilla ei ole ZPBP2:ta, ovat subfertiilejä ja niillä on vikoja ZP:n vuorovaikutuksessa ja tunkeutumisessa (Lin et al. 2007). Hiirillä on lisänäyttöä siitä, että tietyt CCT/TRiC-kompleksin alayksiköt translokoituvat siittiöiden pinnalle siittiöiden kapasitaation aikana (Dun ym. 2011).

Toinen merkittävä chaperonien luokka, joka on tunnistettu siittiöiden pinnalla ja joka on sekaantunut ZP-vuorovaikutusten säätelyyn, on HSP70-perhe (Naaby-Hansen ym. 2010). Kuten CCT/TRiC-kompleksilla, myös HSP70-perheen chaperoneilla on hyvin dokumentoituja rooleja sekä transmembraaniproteiinien kuljetuksen helpottamisessa että vakaiden proteiinikompleksien kokoamisessa (Mayer & Bukau 2005). Yksi HSP70-perheen jäsen, joka ilmentyy yksinomaan (hiiri) tai pääasiassa (ihminen) kiveksissä, näyttää olevan välttämätön miehen hedelmällisyyden kannalta. Tämän chaperonin, HSPA2:n, poikkeava ilmentyminen on itse asiassa korreloinut vakavan urospuolisen hedelmättömyyden fenotyyppiin ihmisillä, mikä vaikuttaa erityisesti siittiöiden kykyyn olla vuorovaikutuksessa homologisten munasolujen kanssa in vitro (Eddy 1999, Huszar ym. 2007). Sekä hiirillä että ihmisillä HSPA2:lla on perustavanlaatuinen rooli spermatogeneesissä, ja proteiinin kohdennettu poistaminen ensin mainituilla lajeilla johtaa tämän prosessin varhaiseen pysähtymiseen ja samanaikaiseen siittiöiden puuttumiseen (Eddy 1999). Ihmisillä HSPA2:n ilmentymistaso on korreloinut positiivisesti in vitro -hedelmöityksen onnistumisen kanssa (Huszar ym. 2000, 2006, Cayli ym. 2003), ja näin ollen sen avulla voidaan tiettävästi ennustaa miesten hedelmällisyystilanne suurella tarkkuudella (Ergur ym. 2002).

HSPA2:n karakterisointi omassa laboratoriossamme on paljastanut, että tätä chaperonia esiintyy ihmisen siittiöiden akrosomaalisessa domeenissa ja että se on osa ainakin viittä suuren molekyylimassan proteiinikompleksia (Redgrove ym. 2012), mukaan lukien osajoukko niistä, joilla on aiemmin osoitettu olevan ZP-affiniteetti (Redgrove ym. 2011). Näiden tietojen mukaisesti olemme varmistaneet todisteet siitä, että hallitsevin HSPA2-kompleksi sisältää kaksi muuta proteiinia, joiden molempien on aiemmin todettu osallistuvan siittiöiden ja zonan vuorovaikutukseen (Redgrove ym. 2012). Lisäksi olemme Huszarin ym. julkaisemien tulosten mukaisesti pystyneet osoittamaan, että HSPA2-tasot vähenevät merkittävästi miesten, joilla on eristettyjä vaurioita, siittiöissä ja niiden kyvyssä osallistua vuorovaikutukseen homologisten munasolujen ZP:n kanssa in vitro (Redgrove ym. 2012). Nykyisessä työssämme keskitytään siihen, johtuuko ZP:n adheesiovaje joko ZP:n sitoutumiskohtien poikkeavasta muodostumisesta spermiogeneesin varhaisvaiheissa (Huszar ym. 2000) vai voiko se olla seurausta HSPA2:n kyvyttömyydestä osallistua siemennesteen pinnan uudelleenmuotoilutapahtumiin kapasitaation aikana, kuten ZP-reseptoreiden kokoonpanon ja/tai esittelyn helpottamiseen siemennesteen pinnalla valmistautumisessa ZP:n vuorovaikutukseen.

Oman siittiöiden pintakompleksien kokoonpanoa koskevan työmme lisäksi Han ym. ovat itsenäisesti tunnistaneet vaihtoehtoisen chaperoneja sisältävän moniproteiinikompleksin hiiren siittiöiden pinnalla. Mielenkiintoista on, että kuten edellä on dokumentoitu, tämä kompleksi, joka koostuu HSPA5:stä, kalnexiinista, integraalikalvoproteiinista 2B ja ADAM7:stä, kootaan ilmeisesti kapasitaation aikana (Han ym. 2011). Vaikka tämän kompleksin toimintaa ei ole vielä täysin selvitetty, ADAM7:n ilmentyminen on yhdistetty muiden ADAM-proteiinien, ADAM2:n ja ADAM3:n, läsnäoloon (Kim ym. 2006), jotka ovat tärkeitä siittiöiden tarttumiselle ZP:hen (Muro & Okabe 2011). Lisäksi tiedetään, että HSPA5 on mukana edistämässä korkealaatuisten siittiöiden adheesiota munatorven epiteelisoluihin (OEC) naaraspuolisten sukuelinten istumakohdassa. Tämän säiliön muodostumisella uskotaan olevan eloonjäämistä edistäviä vaikutuksia, kun siittiöitä pidetään kapasitoitumattomassa, rauhallisessa tilassa valmisteltaessa munasolun vapautumista ampullaan (Topfer-Petersen ym. 2002). Mielenkiintoista on, että myös chaperonit HSPD1 ja HSPA5 on lokalisoitu naudan OEC:n pinnalle, ja ne on siten yhdistetty siittiöiden ja OEC:n väliseen sitoutumiseen (Boilard ym. 2004).

Yhteensopiva omien töidemme kanssa on myös kompleksi, jonka tunnistivat Han ym. osoitettiin sijaitsevan kalvon mikroalueissa tai lipidilautoissa, jotka ovat erikoistuneita kalvon alueita, jotka tarjoavat alustan moniproteiinikompleksien toiminnalliselle kokoamiselle ja esittämiselle (Stein ym. 2006, Nixon ym. 2009, Han ym. 2011). Chaperonikompleksien jakautuminen lauttaympäristöön on havaittu myös HSPA2:n osalta ihmisen siittiöissä (Nixon ym. 2011) ja CCT/TRiC-kompleksin komponenttien osalta hiiren siittiöissä (Dun ym. 2011). Näihin kalvodomeeneihin kuuluu myös useita muita oletettuja ZP-reseptoriproteiineja, kuten GALT1, ZP3R ja SPAM1, mikä vahvistaa niiden roolia siittiöiden pinnan uudelleenmuotoilussa ja ZP:n sitoutumisessa (kuva 1; Nixon ym. 2009, Asano ym. 2010). Mekanismi(t), jolla (joilla) tällaiset proteiinit rekrytoituvat lipidilauttoihin, on vielä selvittämättä; HSPA2:n on kuitenkin raportoitu sitoutuvan ATPaasidomeeninsä kautta 3′-sulfogalaktosyyliglyserolipidiin, joka on tärkein siittiöiden lipidilautoissa tunnistettu glykoproteiini (Mamelak & Lingwood 2001).

Sen lisäksi, että lipidilauttojen oletettu rooli keskeisten chaperonikompleksien ja ZP-reseptoriproteiinien uudelleensijoittumisessa on vakuuttavia todisteita siitä, että monet oletetut ZP-reseptorit, kuten ARSA ja ZP3R, sekä useat molekulaariset chaperonit osoittavat kapasitaatiosta riippuvaa siirtymistä solunsisäisistä paikoista, kuten akrosomista, siittiöiden pinnalle valmistelemaan soluja ennen niiden vuorovaikutusta ZP:n kanssa (Nixon ym., ). 2009). On ehdotettu, että akrosomin ulomman kalvon ja siittiöiden plasmakalvon välinen intiimi kontakti välittyy komplementaaristen liukoisten liukoisten N-etyylimaleimidille herkkien kiinnittymisproteiinireseptoriproteiinien (SNARE-proteiinien) sitoutumisen kautta, mikä johtaa fuusiohuokosten muodostumiseen, jotka tarjoavat reitin entsyymien siirtymiselle siittiöiden pinnalle ennen akrosomin sisällön täydellistä häviämistä (Søgaard ym. 1994, Blas ym. 2005, Tsai ym. 2007). Tämän mallin tueksi Brahmarajun ym. tutkimus (2004) osoitti, että VAMP:n ja SNAP:n vasta-aineiden antaminen akrosomaaliseen vesikkeliin esti siittiöiden-ZP:n sitoutumisen hiirellä.

Tämä siittiöiden pinnan asteittainen pohjustaminen on herättänyt kysymyksiä akrosomaalisen eksosytoosin kaikki tai ei mitään -luonteesta. SNARE-kompleksien toiminnallinen kokoaminen näyttää kuitenkin myös tukevan pitkittyneitä siittiöiden kalvofuusiotapahtumia, jotka mahdollistavat akrosomaalisen sisällön täydellisen häviämisen (Tsai ym. 2010). Vaikka yleisesti katsotaan, että kontakti ZP:n kanssa käynnistää tämän akrosomaalisen eksosytoosin useimmilla nisäkäslajeilla, useat hiirellä tehdyt tutkimukset ovat osoittaneet, että siittiöt, jotka aloittavat akrosomaalisen eksosytoosin ennen kontaktia ZP:n kanssa, pystyvät silti hedelmöittämään munasolun (Nakanishi ym. 1999, Jin ym. 2011). Tämä ilmiö saattaa päteä myös marsun (Huang ym. 1981) ja hamsterin siittiöihin (Yanagimachi & Phillips 1984). Tällaiset havainnot viittaavat cumulus oophoruksen tärkeään rooliin akrosomireaktion käynnistymisessä ja herättävät huolta siitä, pystyvätkö cumulus oophoruksesta poistetuilla munasolun zona-rakenteilla tehdyt in vitro -tutkimukset raportoimaan tarkasti akrosomireaktion ja itse asiassa ZP-vuorovaikutuksen todellisesta luonteesta.

Tällaisista kiistoista huolimatta chaperonin kaltaisia molekyylejä on myös yhdistetty akrosomaaliseen eksosytoosiin niiden kyvyllä edistää glutamiinia sisältävien SNAREjen (Q-SNAREt) ja arginiinia sisältävien SNAREjen (T-SNAREt) kasaantumista tiiviiksi ternäärikomplekseiksi (Tomes ym. 2002, Sørensen 2005). Mielenkiintoista on, että sioilla tehdyt tyylikkäät tutkimukset ovat osoittaneet, että kapasitaatio indusoi siittiöiden plasmakalvon vakaan telakoitumisen ulompaan akrosomaaliseen kalvoon hedelmöittymisen valmistelemiseksi (Tsai ym. 2010). Tsai et al. (2012) tekemät uudemmat tutkimukset ovat myös antaneet todisteita unilamellulaaristen sekoitettujen vesikkelien läsnäolosta, jotka muiden tärkeiden toimintojen ohella mahdollistavat sekundaaristen ZP:tä sitovien proteiinien rekrytoinnin siittiöiden pinnalle ja joilla on uusi trimeerinen SNARE-kompleksi, joka koostuu syntaksiini 3:sta, SNAP23:sta, VAMP2:sta ja ylimääräisestä proteiinista, kompleksin 2:sta. Tällaisten kompleksien muodostumisesta vapautuva energia käytetään puolestaan membraanifuusion käynnistämiseen vetämällä yhteen siittiöiden plasmakalvo ja sisäinen akrosomaalinen kalvo (Tomes ym. 2002). Tämän prosessin loppuun saattaminen on kriittisen tärkeää sellaisten siittiöiden domeenien altistumisen kannalta, jotka osallistuvat hedelmöittymisen myöhempiin tapahtumiin: oolemman sitoutumiseen ja fuusioon.