shRNA – Sovellukset – Mikä on shRNA, miten se toimii ja sen sovellukset.

Mikä on shRNA ja miten sitä käytetään?

Lyhyet hiusneula-RNA-sekvenssit (shRNA) koodataan yleensä DNA-vektoriin, joka voidaan tuoda soluihin plasmiditransfektion tai virustransduktion avulla. shRNA-molekyylit voidaan jakaa kahteen pääryhmään rakenteensa perusteella: yksinkertaiseen kantasilmukkaan (stem-loop) perustuvaan ja mikroRNA:han mukautettuun (microRNA-adapted) shRNA:han. Yksinkertainen stem-loop shRNA transkriboituu usein RNA-polymeraasi III:n (Pol III) promoottorin ohjaamana . 50-70 nukleotidin transkripti muodostaa stem-loop-rakenteen, joka koostuu 19-29 bp:n kaksisäikeisen RNA:n alueesta (stem), jota yhdistää pääasiassa yksisäikeisen RNA:n alue (loop) ja dinukleotidinen 3′ overhang . Yksinkertainen stem-loop shRNA transkriboituu ytimessä ja siirtyy RNAi-reitille pre-mikro-RNA:n tavoin. Pidempi (> 250 nukleotidia) mikroRNA-sovitettu shRNA on rakenne, joka muistuttaa enemmän natiiveja pri-mikroRNA-molekyylejä, ja se koostuu shRNA:n runkorakenteesta, joka voi sisältää mikroRNA:n kaltaisia epäsuhtaisuuksia, joita silmukka yhdistää ja joita reunustavat 5′ ja 3′ endogeeniset mikroRNA-sekvenssit . MikroRNA-sovitettu shRNA, kuten yksinkertainen stem-loop-hiuslenkki, transkriboituu myös ytimessä, mutta sen ajatellaan pääsevän RNAi-reitille aikaisemmin samanlaisena kuin endogeeninen pri-mikroRNA.

shRNA-teknologiat ovat DNA-pohjaisia, mikä tarjoaa joustavuutta vektorin suunnittelussa. Useimmat vektoripohjaiset shRNA-järjestelmät sisältävät selektiivisen merkkiaineen, joka mahdollistaa sellaisten solujen poistamisen, joita ei ole onnistuneesti transfektoitu tai transduktoitu, ja sellaisten solujen ylläpitämisen, joilla on jatkuva geenin knockdown. ShRNA-ekspressiokasetit voidaan myös sisällyttää virusvektorijärjestelmiin, kuten retroviruksiin, adeno-assosioituneisiin viruksiin, adenoviruksiin ja lentiviruksiin, jotka mahdollistavat vakaan integroitumisen isännän genomiin ja ilmentymisen siitä. Nämä virusstrategiat mahdollistavat shRNA:n levittämisen solulinjoihin, jotka ovat vastustuskykyisiä transfektiolle. Fluoresoivia merkkiaineita (kuten vihreää tai punaista fluoresoivaa proteiinia) voidaan myös sisällyttää shRNA:ta ilmentävien solujen seurantaan. ShRNA:n suorituskykyyn vaikuttavat monet tekijät, kuten transduktion tai transfektion tehokkuus, shRNA:n ilmentymistä ohjaava promoottori ja epigeneettiset modifikaatiot (jotka voivat johtaa shRNA:n ilmentymisen vaimentumiseen). Lisäksi vaikutus, joka kullakin näistä tekijöistä on vektorin suorituskykyyn, voi vaihdella solulinjasta tai solutyypistä riippuen. SMARTchoice-promoottori- ja reportterivaihtoehdot auttavat tutkijoita valitsemaan optimaaliset promoottorit shRNA-ekspressiota ja geenin vaimentamista varten. Lopuksi, kun nämä shRNA-ekspressiokasetit yhdistetään indusoitaviin promoottoreihin, kuten SMARTvector Inducible Lentiviral shRNA tai TRIPZ-vektorijärjestelmä, tutkijat voivat suunnitella tutkimuksia geeniekspression ajalliseksi ja spatiaaliseksi muokkaamiseksi .

Videoanimaatio: RNA-interferenssi

Miten shRNA toimitetaan soluun?

DNA-pohjaisen shRNA:n toimittamiseen soluun on kaksi vaihtoehtoa. Plasmidien osalta voidaan käyttää tyypillisiä transfektiomenetelmiä, kuten lipiditransfektioreagenssien käyttöä tai elektroporaatiota. Lentiviraalipartikkelit ovat erinomainen valinta vaikeasti transfektoitaviin soluihin ja tilanteissa, joissa tarvitaan korkeaa tehokkuutta tai on toimitettava useita konstruktioita solua kohti. Useimmissa nykyaikaisissa vektoreissa on valikoivia merkkiaineita, jotka mahdollistavat niiden solujen valikoivan tappamisen viljelyssä, joita ei ole onnistuttu transfektoimaan tai transduktoimaan, jotta voidaan kehittää puhdas kulttuuri.

Mikä vaikuttaa shRNA:n toimintaan ja spesifisyyteen?

Optimaalinen geenin tyrmäys (knockdown) on edellytys onnistuneelle RNAi:lle shRNA-järjestelmiä käyttäen. ShRNA-sekvenssien järkevä suunnittelu on suurelta osin perustunut siRNA:n kanssa kehitettyihin algoritmeihin. Vaikka joitakin siRNA-suunnittelusääntöjä sovelletaan shRNA:han, tarkemmat shRNA-suunnittelualgoritmit todennäköisesti parantavat tulevaisuudessa shRNA:iden kohdegeenien vaimentamista . Toimivien shRNA-sekvenssien ennustamiseksi Dharmaconin SMARTvector™ shRNA-algoritmi valitsee kohdesekvenssit lukuisten kriteerien perusteella, mukaan lukien sijainnista riippuvaiset nukleotidipreferenssit, sekundaarirakenne ja termodynaamiset stabiilisuusprofiilit, jotka ovat ominaisia SMARTvector-mikroRNA-pohjaiselle telineelle. Lisäksi SMARTvector-algoritmi sisältää useita kriteerejä spesifisyyden lisäämiseksi.

Kuten siRNA:iden kohdalla, bioinformatiikan lähestymistapoja voidaan soveltaa kohdespesifisten shRNA:iden luomiseksi samalla kun minimoidaan potentiaaliset off-target-vaikutukset. Vaimennuksen välituotteiden korkeiden pitoisuuksien tiedetään edistävän off-target-tapahtumia, mutta välituotteiden tasoa on vaikea kontrolloida, kun shRNA:t eksogeenisesti ilmentyvät. Useissa julkaisuissa on dokumentoitu näyttöä siitä, että tietyissä olosuhteissa korkeat tasot yksinkertaisen stem-loop shRNA:n ilmentymistä voivat kyllästää endogeenisen RNAi-reitin ja johtaa tahattomiin fenotyyppeihin. Toisissa tutkimuksissa on esitetty, että mikroRNA:han mukautetun shRNA:n käyttö voi vähentää solutoksisuutta in vivo -RNAi-kokeissa, koska sekä Drosha-DGCR8 että Dicer käsittelevät näitä telineitä tehokkaammin .

shRNA-sovellukset

shRNA tarjoaa mahdollisuuden pitkäkestoiseen geenien vaimentamiseen. Viruspohjaisen shRNA:n transduktio mahdollistaa pääsyn sellaisiin soluihin, kuten primaari- ja hermosoluihin, joita on vaikea transfektoida perinteisillä kationisiin lipidiin perustuvilla strategioilla. Viruspohjaisia shRNA:ita on käytetty myös geenien toiminnan arviointiin koko genomin mittakaavassa käyttämällä vaimentavien konstruktioiden pooleja. Pool- tai array-seulontoja käytetään nykyään laajalti korkean läpimenon seulontojen suorittamiseen sellaisten geenien tunnistamiseksi, joita tarvitaan erilaisissa prosesseissa, kuten syöpäsolujen eloonjäämisessä ja lisääntymisessä, kasvainsuppressorireitin komponenteissa, nisäkkäiden vuorokausikellon modulaattoreissa, epiteelin ja mesenkyymin välisen siirtymän tukahduttajissa, HIV-1:n replikaation isännän välittäjäaineissa ja solujen migraation säätelijöissä. Yhdistetyn RNAi-seulonnan tehoa on laajennettu myös geenien toiminnan seulontaan eläinmalleissa in vivo -biologian tutkimiseksi .

Mikä shRNA-työkalu sopii tarpeisiisi?

shRNA-valintaopas

Tarjoamme valikoiman shRNA-reagensseja ja -kirjastoja. Tämä nopea valintaopas auttaa määrittämään parhaan vaihtoehdon juuri sinun tarpeisiisi.

Tuotteet

shRNA – tuotteet

• Lentiviraalivektoripohjaiset reagenssit RNA-interferenssiä varten.

SMARTvector Lentiviraalinen shRNA

• Tehdä älykkäitä, tietoon perustuvia valintoja, jotta geenien hiljentäminen onnistuu kiinnostavissa soluissa.

SMARTvector Inducible shRNA

• Kehittynein ja joustavin saatavilla oleva yhden vektorin indusoituva shRNA tiukasti kontrolloituun geenien vaimentamiseen.

Pooled Lentiviral Screening Libraries

• Laadukkaiden poolien optimoitu rakentaminen, täydelliset analyysityökalut ja validoidut protokollat ovat olennaisen tärkeitä onnistuneen lopputuloksen kannalta, kun seulotaan poolattujen lentiviruskirjastojen avulla.

Luokitellut resurssit

shRNA – Resurssit

• Tuoteoppaat, usein kysytyt kysymykset ja paljon muuta.

SMARTvector Lentiviral shRNA – Tekninen huomautus

• Tekninen huomautus, jossa kuvataan SMARTchoice shRNA:n kokeellista työnkulkua suspensiosoluissa.

SMARTvector Lentiviral shRNA – Technical Manual

• Alusta on innovatiivinen järjestelmä, joka soveltuu erinomaisesti RNAi-välitteisiin tutkimuksiin.

GIPZ Lentiviral shRNA – Technical Manual

• Kokeiluprotokollat geenien knockdowniin GIPZ lentiviral shRNA:n avulla.

1. Bartel, D.P. (2004) MicroRNAs: genomics, biogenesis, mechanism, and function. Cell 116(2):281-297.
2. Kim, V.N. (2005) MikroRNA:n biogeneesi: koordinoitu leikkaus ja kuutiointi. Nature Reviews, Molecular Cell Biology 6(5):376-385.
3. Brummelkamp, T.R. ym. (2002) Järjestelmä lyhyiden häiritsevien RNA:iden vakaaseen ilmentämiseen nisäkässoluissa. Science 296(5567):550-553.
4. Paddison, P.J. et al. (2002) Geeniekspression vakaa tukahduttaminen RNAi:llä nisäkässoluissa. PNAS 99(3):1443-1448.
5. Paul, C.P. et al. (2002) Pienen häiritsevän RNA:n tehokas ilmentyminen ihmisen soluissa. Nature Biotechnology 20(5):505-508.
6. Silva, J.M. ym. (2005) Toisen sukupolven shRNA-kirjastot, jotka kattavat hiiren ja ihmisen genomin. Nature Genetics 37(11):1281-1288.
7. Hong, S. ym. (2007) Eri promoottorien toiminnallinen analyysi lentivirusvektoreissa hiiren alkion kantasolujen in vitro -erilaistumisen eri vaiheissa. Molecular Therapy 15(9):1630-1639.
8. Liu, Z. et al. (1997) A systematic comparison of relative promoter/enhancer activities in mammalian cell lines. Analytical Biochem. 246(1):150-152.
9. Ramezani, A. et al. (2000) Lentivirusvektorit tehostettuun geeniekspressioon ihmisen hematopoieettisissa soluissa. Molecular Therapy 2(5):458-469.
10. Ying, M. ym. (2011) Kruppelin kaltaisen perheen transkriptiotekijä 9, erilaistumiseen liittyvä transkriptiotekijä, tukahduttaa Notch2-signalointia ja estää glioblastoomaa käynnistäviä kantasoluja. Stem Cells 29(1):20-31.
11. Peng, J. et al. (2009) Jarid2/Jumonji koordinoi PRC2:n entsymaattisen aktiivisuuden ja kohdegeenien miehityksen kontrollia pluripotentissa soluissa. Cell 139(7):1290-1302.
12. Du, W. et al. (2010) Sytoplasminen FANCA-FANCC-kompleksi vuorovaikuttaa ja stabiloi sytoplasmassa dislokalisoitunutta leukemian nukleofosmiiniproteiinia (NPMc). Journal of Biological Chemistry 285(48):37436-37444.
13. Fellmann, C. et al. (2011) Optimoitujen RNAi-triggereiden funktionaalinen tunnistaminen käyttäen massiivisesti rinnakkaista sensorimääritystä. Molecular Cell 41(6):733-746.
14. Grimm, D. et al. (2006) Fataliteetti hiirillä johtuen solujen mikroRNA/lyhyt hiusneula-RNA-reittien ylikylläisyydestä. Nature 441:537-541.
15. McBride, J.L. ym. (2008) Keinotekoiset miRNA:t lieventävät shRNA-välitteistä toksisuutta aivoissa: vaikutukset RNAi:n terapeuttiseen kehittämiseen. PNAS 105(15):5868-5873.
16. Siolas, D. et al. (2005) Synteettiset shRNA:t voimakkaina RNAi-triggereinä. Nature Biotechnology 23(2):227-231.
17. Gregory, R.I. ym. (2005) Ihmisen RISC kytkee mikroRNA:n biogeneesin ja transkription jälkeisen geenien vaimentamisen. Cell 123(4):631-640.
18. Luo, B. et al. (2008) Highly parallel identification of essential genes in cancer cells. PNAS 105(51):20380-20385.
19. Silva, J.M. et al. (2008) Profiling essential genes in human mammary cells by multiplex RNAi screening. Science 319(5863): 617-620.
20. Schlabach, M.R. et al. (2008) Cancer proliferation gene discovery through functional genomics. Science 319(5863):620-624.
21. Mullenders, J. ym. (2009) Candidate biomarkers of response to an experimental cancer drug identified through a large-scale RNA interference genetic screen. Clinical Cancer Research 15(18):5811-5819.
22. Maier, B. et al. (2009) A large-scale functional RNAi screen reveals a role for CK2 in the mammalian circadian clock. Genes and Development 23:708-718.
23. Gumireddy, K. et al. (2009) KLF17 on rintasyövän epiteeli-mesenkymaalisen siirtymän ja metastaasin negatiivinen säätelijä. Nature Cell Biology 11(11):1297-1304.
24. Rato, S. et al. (2010) Novel HIV-1 knockdown targets identified by an enriched kinases/phosphatases shRNA library using a long-term iterative screen in Jurkat T-cells. PLoS One 5(2):e9276.
25. Yeung, M.L. ym. (2009) Genominlaajuinen lyhyen hiusneulan RNA:n seulonta jurkat T-soluissa ihmisen proteiineille, jotka edistävät HIV-1:n tuottavaa replikaatiota. Journal of Biological Chemistry 284(29):19463-19473.
26. Smolen, G.A. et al. (2010) A genome-wide RNAi screen identifies multiple RSK-dependent regulators of cell migration. Genes and Development 24(23):2654- 2665.
27. Zender, L. ym. (2008) An oncogenomics-based in vivo RNAi screen identifies tumor suppressors in liver cancer. Cell 135(5):852-864.
28. Montgomery, R.L. ym. (2011) MiR-208a:n terapeuttinen esto parantaa sydämen toimintaa ja selviytymistä sydämen vajaatoiminnan aikana. Circulation 124(14):1537-1547.