Positive functional synergy of structurally integrated artificial protein dimers assembled by Click chemistry

Click chemistry interface sites

Epäilimme, että assosiaatioyhteyksien kannalta yhteensopivat proteiinien pinta-alueet synnyttävät todennäköisemmin integroidun rakenteen muodostamalla yhteensopivia ei-kovalenttisia vuorovaikutuksia. Koska proteiinit ovat monomeerisiä, nämä vuorovaikutukset ovat parhaimmillaankin heikkoja ja ohimeneviä, joten ne eivät pysy, joten ajattelimme, että tarvitsimme molekyylisen ”pultin” osaksi rajapintakohtaa edistämään ja vakiinnuttamaan kaikki uudet vuorovaikutukset. Ensimmäinen vaihe on tunnistaa kohdeproteiineista alueet, joilla on luonnostaan potentiaalia vuorovaikutukseen. Mahdollisten dimeerikokoonpanojen luomiseen käytettiin ClusPro 2.040 -ohjelmaa (cluspro.org). Tuloksena saadut sfGFP-homodimeerimallit tarkennettiin, analysoitiin ja asetettiin paremmuusjärjestykseen RosettaDockin41,42 avulla (lisätaulukko 1). Korkeimmalle sijoittunut konfiguraatio on esitetty kuvassa 1b (joka on lähimpänä jäljempänä määritettyä rakennetta; ks. jäljempänä), ja neljä seuraavaa sijoittunutta konfiguraatiota on esitetty täydentävässä kuvassa 1. Vaikka yhden sfGFP:n ja toisen välillä havaittiin erilaisia orientaatioita, telakointi osoitti, että jäännökset 145-148, 202-207 ja 221-224 vaikuttavat rutiininomaisesti dimeerin rajapintaan. Kahden proteiinin yhdistämiseksi toisiinsa käytettiin geneettisesti koodattua bioorthgonaalista Click-kemiaa (kuva 1a). Etuina esimerkiksi disulfidisidoksiin verrattuna ovat pidemmät sivuketjut mahdollisten steeristen yhteentörmäysten voittamiseksi, parempi ristisidoksen stabiilisuus ja kyky tuottaa epäsymmetrisiä (eri monomeerien eri sidosjäännökset) ja heterodimeerejä suunnitellulla 1:1-tyypillä (ks. alla).

Dimeerimallien perusteella valittiin kolme jäännöstä korvattavaksi kahdella Click-yhteensopivalla ncAA:lla, SCO43 (jännitetty alkydi) ja azF (atsidi),44,45 (ks. kuva 1a). H148 ja Q204 valittiin niiden sijainnin perusteella oletetulla dimeerin rajapinnalla (kuva 1b ja täydentävä kuva 1). Molempien jäännösten tiedetään muuntuvan helposti pienimolekyylisillä syklooktyyniadduktioilla azF:n sisällyttämisen yhteydessä34,46 , ja ne sijaitsevat lähellä toiminnallista keskusta, sfGFP-kromoforia (CRO) (kuva 1b). Geeliliikkuvuussiirtymäanalyysi osoitti, että dimerisaatio onnistui (kuva 1c, d); tämä vahvistettiin massaspektrometrisellä analyysillä (lisäyskuva 2). Residenssin 132 ei ennustettu olevan dimerin rajapinnassa (kuva 1b ja lisäys 1), mutta sen tiedetään olevan yhteensopiva erilaisten jännitettyjen alkyniadduktien kanssa väriaineista46 hiilinanoputkiin35 ja yksisäikeiseen DNA:han36. Näin ollen se toimii hyvänä testinä kyvyllemme ennustaa proteiini-proteiini-rajapintoja ja Click-reaktioiden yhteensopivuutta. Huolimatta siitä, että jäännös 132 on pintapuolisesti alttiina, dimeerituotetta ei havaittu käyttämällä sfGFP132azF:ää SCO:ta sisältävän proteiinin kanssa (täydentävä kuva 3), mikä osoittaa pintarajapinnan yhteensopivuuden merkityksen ja in silico -analyysin hyödyllisyyden klikkauskemian yhteensopivien kohtien tunnistamisessa. Joko steeriset yhteentörmäykset ja/tai muilla alueilla pidempään jatkuvat proteiini-proteiini-vuorovaikutukset voivat estää kovalenttisen ristisilloittumisen jäännöksellä 132.

Positiivinen funktionaalinen kytkentä muodostettaessa sfGFP148x2-dimeeriä

H148 muodostaa H-sidoksen CRO:n kanssa (Kuva. 1b ja sillä on tärkeä rooli protonien sukkuloinnissa, joka säätelee perustilassa olevan neutraalin A-muodon (λmax ~ 400 nm, CRO A) ja anionisen B-muodon (λmax ~ 490 nm, CRO B)47 populaatiota. B-muoto on vallitseva sfGFP:ssä, mutta kun H148:n tilalle lisätään azF (sfGFP148azF), H-sidoksen poistaminen johtaa siihen, että A-tila on nyt vallitseva33,34 (kuva 2a ja taulukko 1). SCO:n sisällyttäminen jäännökseen 148 (sfGFP148SCO) saa aikaan samanlaisen vaikutuksen, jolloin CRO A vallitsee, mutta pienemmällä punasiirtymällä (λmax 492 nm) vähäisemmässä CRO B-muodossa (kuva 2a ja taulukko 1) (kuva 2a ja taulukko 1).

SfGFP148azF:n ja sfGFP148SCO:n dimerisaatio tuottaa kaksi merkittävää positiivista vaikutusta: (i) fluoresenssi kytkeytyy päälle ~490 nm:ssä CRO B -muodon edistämisen ansiosta; (ii) kirkkaus paranee huomattavasti lisääntyneen molaarisen absorbanssikertoimen ansiosta 490 nm:ssä (kuva 2a ja taulukko 1). Tärkein eksitaatiopiikki siirtyy punaiseksi dimerisaation yhteydessä (λmax 492 nm) verrattuna sfGFPWT:hen (λmax 485 nm) (lisätaulukko 3). Absorbanssisuhde 490:400 nm:ssä siirtyy kertaluokkaa monomeerien ~0,5:stä ~5:een dimeerissä, ja CRO B-muoto hallitsee dimeerin absorptiospektriä (kuva 2a) huolimatta siitä, että ilmeisesti ei ole lajia, joka voisi korvata H148-imidatsoliryhmän roolin. Aiemmat esimerkit sfGFP148azF:n muokkaamisesta pienten molekyylien addukteilla tai valo-aktivoinnilla johtavat parhaimmillaankin osittaiseen muuntumiseen CRO B -muodoksi33,34. Absorbanssin 10-kertainen muutos heijastuu fluoresenssiemissioon; 490 nm:ssä tapahtuva heräte johtaa ~20-kertaiseen suurempaan emissioon kuin kumpikin monomeeri (kuva 2a). Lisäksi dimeeri osoittaa tehostettua toimintaa jopa verrattuna alkuperäiseen superfolderiin sfGFPWT (kuva 2b ja taulukko 1). Molaarinen absorbanssi ja kirkkaus kasvoivat ~320 % sfGFP148x2:n osalta (~160 % CRO:ta kohti laskettuna) (Kuva 2b), mikä on korkeampi kuin pelkän additiivisen lisäyksen odotetaan aiheuttavan, jos monomeeriyksiköt toimivat toisistaan riippumattomasti.

Tutkiaksemme biorthogonaalisen linkin merkitystä konstruoimme klassisen disulfidipohjaisen linkin mutoimalla H148:n kysteiiniksi. SfGFPH148C-variantit dimeroituivat, mutta vain Cu2+:n läsnä ollessa (Täydentävä kuva 4). Spektriominaisuuksien perusteella dimeeri oli vähemmän fluoresoiva kuin sfGFP148x2 ja sfGFPWT (lisäyskuva 4). Monomeeri sfGFPH148C osoitti odotettua siirtymistä CRO B:stä CRO A:han. Vaikka sfGFPH148C:n dimerisaatiossa havaittiin siirtyminen CRO A:sta CRO B:hen, dimeerin CRO-molaarinen absorbanssi CRO:ta kohti oli alhaisempi kuin sfGFPWT:llä ja huomattavasti alhaisempi kuin sfGFP148x2:llä; merkittävää populaatiota A:n tilassa havaittiin edelleen. Dimeerisen sfGFPH148C:n fluoresenssiemissio 490 nm:ssä tapahtuvassa herätteessä oli noin puolet pienempi kuin sfGFPWT:n. Näin ollen biorthogonaalinen lähestymistapa tuotti paremmin toimivan dimeerisen lajin kuin klassinen disulfidisidosidos.

Molekulaarinen perusta sfGFP148x2:n toiminnalliselle kytkennälle

SfGFP148x2:n kiderakenne (ks. tilastotiedot lisätaulukosta 2) paljastaa, että monomeerit muodostavat laajan dimeerisen rajapinnan, jossa on pitkän kantaman vuorovaikutukset, jotka yhdistävät kaksi CRO-keskusta. sfGFP148x2:n monomeeriyksiköt järjestäytyvät kvasisymmetriseen head-to-tail-asetelmaan, joka on ~45°:n päässä toisistaan (kuva 3a). Antiparalleelinen vierekkäinen monomeerijärjestely on lähimpänä korkeimmalle sijoittuneen mallin järjestystä (täydentävä kuva 1 ja täydentävä taulukko 1). Uuden triatsoliristikytkennän elektronitiheys on selvästi määritelty (kuva 3b), ja se muodostaa pitkänomaisen anti-1,4-triatsolilinkin, joka on osittain hautautunut ja liittyy läheisesti molempiin monomeeriyksiköihin muodostaen siten kiinteän osan dimeerin rajapinnasta (kuva 3c). CRO:t ovat 15 Å:n etäisyydellä toisistaan osoittaen toisiaan kohti (kuva 3a).

Rajapinnalla on samanlaiset ominaisuudet kuin luonnollisilla dimeereillä48. Rajapintaan hautautunut pinta-ala on ~1300 Å2, ja siihen osallistuvat yleensä samat jäännökset kummastakin monomeeristä (Kuva 3c, d). H-sidoksilla on tärkeä rooli, sillä molemmista monomeereistä peräisin olevat jäännökset E142, N146, S147, N149 ja N170 osallistuvat kahdeksaan alayksiköiden väliseen H-sidokseen (kuva 3b). Rakenne osoittaa, että luonnollisia dimeerien rajapintoja voidaan jäljitellä ja vakauttaa käyttämällä Click-sidoksissa olevia monomeerejä, jotka alkuperäisen mallinnuksen mukaan olivat toteutettavissa, mutta jotka olivat todennäköisesti liian heikkoja tai ohimeneviä pysyäkseen ilman upotettua linkkiä. Saattaa siis olla, että lähestymistapaamme voitaisiin käyttää laajemmin ohimenevien heikkojen proteiini-proteiini-vuorovaikutusten vakauttamiseen, jolloin muodostuisi määriteltyjä rajapintoja.

Dimerisaatio indusoi sarjan konformaatiomuutoksia muodostaen pitkän kantaman vuorovaikutusverkoston, joka on taustalla mekanismissa, jonka avulla sfGFP kytkeytyy PÄÄLLE ja kirkkautta lisätään. sfGFP148azF-rakenne (PDB 5BT0)34 osoittaa, että 148azF on samankaltaisessa asemassa kuin H148 sfGFPWT:ssä, mutta se ei voi olla pois kriittisestä H-sidoksesta CRO:n fenoli-OH-ryhmään, joka edistää CRO:n B-tilan muodostumista. Dimerisaation yhteydessä 148azF:n modifiointi muodostamalla triatsolilinkki 148SCO:n kanssa samankaltaisessa monomeerissä johtaa sekä sen selkärangan että sivuketjujen aseman muuttumiseen, mikä aiheuttaa reiän, jonka vesimolekyyli voi nyt miehittää dimeerissä (W1azF kuvassa 4a). Vesi voi muodostaa H-sidoksen CROazF:n ja 148azF:n selkärangan karbonyylin kanssa (kuva 4). Vastaava vesi on sfGFP148SCO-monomeeriyksikössä (W1SCO), joka muodostaa samanlaisia vuorovaikutuksia. Näillä rakenteellisilla vesimolekyyleillä on mahdollisuus korvata H148:n poiston yhteydessä menetetty H-sidosvuorovaikutus, jolloin dimeeri aktivoituu edistämällä CRO B:n muodostumista perustilassa. Vesimolekyylit ovat myös hautautuneet dimerin rajapintaan, joten dynaaminen vaihto irtoliuottimen kanssa vähenee huomattavasti. Lisäksi kaksi CRO:ta ovat nyt yhteydessä toisiinsa laajalla, pääasiassa vesiverkostolla, joka ulottuu dimerin rajapinnan yli (kuva 4b, c). Tunnelin koostumuksen analyysi paljasti, että kolme vesimolekyyliä kummassakin yksikössä (W1azF/SCO, W2azF/SCO ja W3azF/SCO) ovat symmetrisiä; W4 yhdessä F145SCO:n selkärangan kanssa muodostavat sillan dimeerin rajapinnan yli, joka yhdistää kaksi vesiverkostoa toisiinsa. Näin dimeroituminen synnyttää laajennetun, monomeerien välisen vesirikkaan H-sidosverkoston, mikä edistää siirtymistä A-tilasta CRO:sta B-muotoon.

SfGFP148x2:n yksimolekyylinen fluoresenssianalyysi

Totaalista sisäistä heijastusta hyödyntävällä fluoresenssi- eli TIRF-mikroskopialla (Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy = TIRF-mikroskopia) selvitettiin sfGFFP148x2:n dimereiden fluorisoivaa käyttäytymistä yksimolekyylitasolla. Yksittäisten sfGFP148x2-dimeerien fluoresenssin intensiteetin aikakäyrä osoitti erilaisia intensiteettitiloja, joissa vallitsi ~80-100 lukeman fluoresenssi, joka oli pitkäikäisempää kuin korkeampien intensiteettitilojen alaryhmä, jolle oli ominaista lyhytaikaiset harhautukset intensiteettien vaihteluväliin ~100 ja 300 lukeman välillä (kuva 2c). Fluoresenssijäljet osoittavat myös pitkää valonkestävyyttä ja pitkää valohäviöaikaa (kuva 2c ja täydentävä kuva 5). Sen sijaan sfGFPWT:n valohäviäminen on nopeampaa, ja fluoresenssijäljet osoittavat yhden intensiteettitilan, jossa päällä olevat tilat kestävät yleensä lyhyempiä aikoja (täydentävä kuva 6). Lisäksi monomeerisen sfGFPWT:n havaittiin joskus olevan aluksi pimeässä, ei-fluoresoivassa tilassa ennen fluoresenssin alkamista ja sitä seuraavaa valohaihtumista (täydentävä kuva 6). Keskimääräisen yhtäjaksoisen fluoresenssin ”päälläoloajan” uuttaminen ennen valohäviämistä ja ohimenevien ei-fluoresoivien tilojen (vilkkuminen) käyttöä osoittaa, että sfGFP148x2:llä on pidempi yhtäjaksoinen fluoresenssijakso (keskimäärin 0,9 s) verrattuna sfGFPWT:hen (0,65 s). Kun otetaan huomioon mitattujen yksittäisten molekyylien fluoresenssin intensiteetin samankaltaisuus, pidemmät ON-ajat ja fotobleaching-elinaika todennäköisesti vaikuttavat sfGFP148x2:n vakaan tilan ensemble-mittauksissa havaittuun lisääntyneeseen fluoresenssiin (kuva 2a).

Yritettiin järkiperäistää dimerijäljitelmissä havaittujen fluoresenssitilojen kirjo ja laatia kaikkien mitattujen intensiteettien histogrammi (kuva 2c). Toisin kuin sfGFPWT (lisäyskuva 6), jossa on yksi log-normaalijakauma49 , sfGFP148x2 suosi kaksikomponenttista sovitusta50 (kuva 2c). Mitatussa intensiteettijakaumassa on vallitseva matalamman intensiteetin huippu (~90 laskentaa) ja osittain päällekkäinen korkeamman intensiteetin huippu, mikä on seurausta yksittäisten molekyylien fluoresenssijäljissä havaituista lyhyistä siirtymistä korkeamman intensiteetin tiloihin. Vaikka tavallisesti voitaisiin odottaa bimodaalista intensiteettijakaumaa dimeerissä, joka koostuu kahdesta rinnakkain sijaitsevasta, toisistaan riippumattomasti aktiivisesta fluorofoorista, joissa kumpikin fluorofori valohäviää peräkkäin, yksittäisen molekyylin intensiteettiä kuvaavat aikajäljet eivät ole johdonmukaisia tämän mallin kanssa, vaan niissä ei näy kahta hyvin määriteltyä tilaa. Yksinkertaista sfGFPWT:n on/off-tilakäyttäytymistä havaitaan harvoin dimeerijäljissä, jotka eivät itsessään ole kahden monomeerijäljen odotettu adduktio, vaan osoittavat monimutkaisempaa käyttäytymistä.

Lisääntynyt toiminta muodostettaessa sfGFP204x2-dimeeriä

Tutkiaksemme, miten erilaiset linkityskohdat voivat saada aikaan toiminnallisia vaikutuksia, tutkimme edellä konstruoitua vaihtoehtoista sfGFP204x2-dimeeriä (kuva 5a) (kuva 1d). Havaitsimme, että dimerisaatio paransi spektriominaisuuksia enemmän kuin pelkkä monomeeristen tai sfGFPWT-proteiinien lisääminen, mikä korostaa jälleen kerran dimerisaation synergistisiä etuja. Joko azF:n tai SCO:n sisällyttämisellä jäännökseen 204 ei ollut juurikaan vaikutusta spektriominaisuuksiin verrattuna sfGFPWT 46:een (kuva 5b ja taulukko 1). B CRO-muoto oli vallitseva monomeerimuodoissa; sekä molaarinen absorbanssi että emissiointensiteetit olivat samankaltaisia keskenään ja sfGFPWT:n kanssa. SfGFP204SCO:n fluoresenssiemissio oli hieman heikentynyt (80 % sfGFPWT:stä; taulukko 1). Muodostettaessa sfGFP204x2-dimeeri (ks. kuva 1d ja täydentävä kuva 2 todisteeksi) spektrianalyysi osoitti toiminnallista parannusta keskeisten spektristen parametrien osalta: molaarinen absorptiokerroin (ε) ja fluoresenssiemissio (kuva 5b ja taulukko 1). Dimerisaatiossa ε kasvoi jopa 400 % lähtömonomeereihin verrattuna 160 000 M-1 cm-1:een. Tämä vastaa keskimääräistä CRO-molaarista absorbanssia 80 000 M-1 cm-1, mikä lähes kaksinkertaistaa kirkkauden lähtömonomeereihin verrattuna ja on 31 000 M-1 cm-1 korkeampi verrattuna sfGFPWT:hen. Lisääntyneen valon absorptiokyvyn myötä myös fluoresenssiemissio lisääntyi; normalisoitu CRO-emissio oli 180 % suurempi kuin sfGFP204azF-monomeerillä. Strickler-Berg51 -laskennan avulla (verkkosivusto huygens.science.uva.nl/Strickler_Berg/) fluoresenssin elinajat laskevat sfGFPWT:n 3,2 ns:stä sfGFP204x2:n 0,92 ns:iin. Näin ollen, kuten sfGFP148x2:n kohdalla, sfGFP204x2:n dimerirakenteessa elektronisen herätteen ja fluoresenssilähdön todennäköisyys on lisääntynyt monomeerisiin määriin nähden (ks. lisäyskuva 8, jossa on esitetty dimereiden spektrianalyysi). Tämä on sitäkin vaikuttavampaa molempien dimeerimuotojen osalta, koska sfGFPWT on vihreän fluoresoivan proteiinin suorituskyvyn vertailuarvo.

Symmetrian merkitys synergialle

Luonnolliset proteiinihomodimeerit ovat yleensä symmetrisiä1,52 , ja tällaista symmetriaa jäljiteltiin keinotekoisessa dimeerissämme yhteisen ristisilloitusjäännöksen avulla. Tutkimme yhteisen ristisidosjäännöksen (rakenteellisen symmetrian jäljittelijänä) merkitystä toiminnalliselle synergialle. Biorthogonaalisen kemian etuna on, että keskenään yhteensopivat reaktiokahvat mahdollistavat määriteltyjen parien rakentamisen (eli 148 + 204 = 148-204 eikä 148-148 tai 204-204), jolloin estetään ei-toivottujen tuotteiden muodostuminen, joita on vaikea erottaa toisistaan.

Luotiin dimeerejä, jotka yhdistivät jäännökset 148 ja 204 kahdella käytettävissä olevalla kombinaatiokokoonpanolla (148SCO+204azF ja 148azF+204SOC). Vakaan tilan fluoresenssi osoitti, että molemmissa dimeerimuodoissa CRO:n protonoitu ja deprotonoitu muoto olivat selvästi läsnä (Kuva 6a, b). 148azF-204SCO-sidoksisessa dimeerissä A- ja B-muotojen suhteelliset populaatiot muuttuivat, ja molaarinen absorbanssikerroin 490 nm:ssä kasvoi merkittävästi (kuva 6a); se oli lähes kaksinkertainen alkuperäiseen sfGFP204SCO:hon verrattuna ja ~30 % korkeampi kuin pelkän monomeerispektrin yhteenlaskun perusteella ennustettu arvo. 400 nm:n piikin suhteellinen korkeus pysyy samanlaisena sekä sfGFP148azF:ssä että 148azF-204SCO:n yhdistetyssä dimeerissä, mikä viittaa siihen, että deprotonoidun muodon populaatio on dimeerissä samanlainen kuin alkuperäisessä monomeerissä. Dimeroituminen 148SCO-204azF-yhdistelmällä muutti protonoituneen ja deprotonoituneen muodon suhteellisia populaatioita, mutta 400 nm:n absorbanssipiikin pieneneminen ei johtanut samanaikaiseen 490 nm:n piikin kasvuun (kuva 6b). Itse asiassa dimerisaatio oli suurelta osin haitallista, sillä molempien tärkeimpien absorptiohuippujen molaarinen absorptiokerroin oli pienempi kuin monomeerien pelkissä additiospektreissä (kuva 6b). On selvää, että epäsymmetrisesti kytkeytyneet dimeerit fluoresoivat vähemmän ja sisältävät merkittävän sekapopulaation kahdesta CRO-tilasta verrattuna symmetrisesti kytkeytyneisiin dimeereihin, joten tässä tapauksessa symmetrialla on merkittäviä toiminnallisia vaikutuksia.

Heterodimeerit ja funktionaalinen integraatio

Heterodimeerit, joissa dimeeri muodostuu kahdesta eri proteiinista, ovat yleisesti havaittu vaihtoehtoinen dimerisaatiotila1,2. Sen avulla voidaan myös suunnitella uusia komplekseja, joissa toiminnallisesti erilaiset proteiinit voivat liittyä toisiinsa. Bioorthogonaalisen kytkennän etuna on mahdollisuus tuottaa määriteltyjä, yhden lajin (hetero)dimeerejä, jotka koostuvat kahdesta eri proteiiniyksiköstä (eli A + B = A-B eikä A-A, B-B, A-B seos, jota voi olla vaikea erottaa). Keltainen fluoresoiva proteiini Venus29 valittiin sfGFP:n kumppaniproteiiniksi näiden kahden proteiinin spektrisen päällekkäisyyden vuoksi (täydentävä kuva 9). Sekvenssierot on esitetty täydentävässä kuvassa 10.

SfGFP148SCO yhdistettiin vastaavaan azF:ää sisältävään Venukseen (Venus148azF) GFVen148:n tuottamiseksi (ks. todisteet täydentävästä kuvasta 11). Syntyy uusia spektriominaisuuksia, jotka viittaavat siihen, että on luotu integroitu järjestelmä. GFVen148:n muodostaminen tuottaa dimeerin, jonka kirkkaus on parempi kuin sfGFP148SCO:lla tai Venus148azF:llä (kuva 7a ja lisätaulukko 3). Mielenkiintoista on, että dimeerin spektriominaisuudet ovat yksittäisten monomeerien välimaastossa ilman merkittävää piikin levenemistä (kuva 7a, b ja täydentävä kuva 12a), mikä viittaa siihen, että kahdesta CRO-keskuksesta on tullut toiminnallisesti integroituneita fluoresenssiemissiossa. Suurin λmax on 505 nm, joka on sfGFP:n (492 nm) ja Venuksen (517 nm) välissä. B-CRO-muodon ε-ekvivalentti (490-510 nm:n alue) kasvaa merkittävästi (~4-5-kertaiseksi), korkeammaksi kuin monomeerien pelkkä additiivinen spektri, kun taas A-CRO-populaatio vähenee, mutta se on edelleen havaittavissa (kuva 7a). Tätä vastaa emissiointensiteetin ~4-kertainen kasvu 505 nm:ssä tapahtuvassa herätteessä (kuva 7b). Havaitaan yksi emissiohuippu, joka on myös kahden monomeerin välissä riippumatta herätteen aallonpituudesta (λEM 517 nm:ssä; kuvat 7b, c); 490 nm:n herätteessä (joka kykenee herättämään molempia CRO:ita) havaittiin pikemminkin yksi kuin kaksinkertainen tai levennetty huippu, mikä viittaa siihen, että yksi laji emittoi. Yksittäisten monomeerien spektrien additiivinen spektri, joka simuloi kahta itsenäisesti toimivaa proteiinia, tukee ajatusta uudesta integroidusta funktiosta, sillä se on leveämpi ja punasiirtynyt verrattuna mitattuun GFVen148x2:n emissioprofiiliin (täydentävä kuva 12b). Emissio 400 nm:n herätteessä mitattiin myös, koska Venus148azF:llä on vähän absorbanssia tällä aallonpituudella verrattuna GFVen148:aan. Emission intensiteetti oli 30-kertainen GFVen148:lla verrattuna monomeeriseen Venus148azF:ään, ja emissiohuippu oli 517 nm:ssä (kuva 7c ja täydentävä kuva 12c). Sen sijaan, että GFVen148 olisi osoittanut klassista FRET-vaikutusta, kuten voitaisiin odottaa (ks. edellä), GFVen148 näyttää toimivan fluoresenssituoton suhteen yhtenä kokonaisuutena. Tämä voisi viitata siihen, että kaksi CRO:ta toimii nyt pääasiassa yhtenä lajina, jolloin sfGFP148x2:n osalta havaituilla rakenteellisilla seikoilla (kuten vesiverkostolla) on merkitystä. CRO:n merkittävän neutraalin A-tilan esiintyminen viittaa siihen, että kaksi monomeeristä yksikköä ei ole täysin synkronoitu. Tämä ei kuitenkaan poista sitä selvää vaikutusta, joka dimerisaatiolla voi olla GFVen148:n kaltaisten uusien spektriominaisuuksien syntymiseen.

Kuten sfGFP:n kohdalla, azF:n sisällyttämisellä Q204:n tilalle (nimeltään Venus204azF) ei ollut juurikaan vaikutusta Venuksen spektriominaisuuksiin (lisätaulukko 3). Kovalenttinen linkitys 204 SPAAC:n kautta (jolloin GFVen204) tuotti onnistuneesti dimeerin (täydentävä kuva 11). GFVen204 yhdisti molempien monomeerien spektriominaisuudet tuottaen lajin, jonka λMax on sekä 490 että 514 nm:ssä (suhde 1:1,2) (kuva 7e, f ja lisätaulukko 3). Venus204 absorboi myös 490 nm:ssä, mutta suhteessa 1:2,7 514 nm:ään. Dimeerien muodostuminen lisäsi jälleen molaarista absorbanssia yksittäisten monomeerien absorbanssia suuremmaksi; erityisesti ε kasvoi ~26 000 M-1 cm-1 (~27 %) Venukseen liittyvän λmax-arvon (514 nm) osalta, jossa sfGFP:n osuus on vähäinen. Monomeerien välisen kommunikaation tutkimiseksi seurattiin fluoresenssiemissiota herätettäessä neljällä eri aallonpituudella: 400 nm (vain sfGFP); 450 nm (sfGFP, pieni Venus); 490 nm (sfGFP λmax, Venuksen olkapää); 510 nm (Venus, pieni sfGFP). Kaikilla heräteaallonpituuksilla ainoa selkeä emissiopiikki oli 528 nm:ssä (kuva 7b), mikä vastaa Venusta, joka osoittaa kommunikaatiota Försterin resonanssienergian siirron (FRET) avulla. SfGFP204SCO:ta vastaavaa emissiohuippua (~510 nm) ei havaittu edes herätettäessä sfGFP:lle ominaisilla matalammilla aallonpituuksilla. Myöskään GFVen148:lle ominaista välillistä emissiohuippua ei havaittu, mikä korostaa 148-heterodimeerin uusia ominaisuuksia. Merkittävin ero havaittiin 400 nm:ssä tapahtuvassa herätteessä, jossa GFVen204:n emissiointensiteetti 528 nm:ssä kasvoi 14-kertaiseksi Venus204azF:ään verrattuna (kuva 7f, sisäkuva). Laskettu suhteellinen FRET-tehokkuus spektrihajotuksen jälkeen oli noin 90 %. Näin ollen nämä kaksi funktionaalista keskusta kommunikoivat energiansiirron kautta (kuva 7g) erittäin tehokkaasti.