PMC

Representative Results

Plakkimääritysten kyky arvioida virustitterit tarkasti riippuu lukuisista tekijöistä: sopivasta isäntäsolujen valinnasta, asianmukaisista väliaineista ja kasvuolosuhteista solujen ja virusten elinkelpoisuutta varten, immobilisoidusta virusten levittämisestä ja viruksen inkubaatioajan tarkasta määrittelystä siten, että on olemassa riittävästi aikaa erillisten ja laskettavissa olevien plakkien muodostumiseen.

Tähän tutkimukseen valittiin viruksia kolmesta edustavasta perheestä, jotta voitiin osoittaa erot seuraavissa asioissa: päällekkäisvalinta, inkubaatioajat ja plakkien morfologia eri näytetyypeissä. (+)ssRNA-virusmalliksi valittiin Venezuelan Equine Encephalitis (VEEV), joka voi aiheuttaa merkittäviä tauteja hevoseläimillä ja ihmisillä ja edustaa Togaviridae-heimoa. Influenssa B Taiwanin kanta, segmentoitu (-)ssRNA-virus, joka tarttuu pääasiassa ihmisiin, edustaa Orthomyxoviridae-heimoa. Rift Valley -kuumevirus (RVFV), niveljalkaisten synnyttämä (-)ssRNA-virus, joka tarttuu pääasiassa niveljalkaisiin, märehtijöihin ja ihmisiin, valittiin Bunyaviridae-heimon edustajaksi.

RVFV:n osalta (kuva 1) titterit määritettiin RVFV:n rekombinanttisen elävän heikennetyn MP12-kannan kantaliuoksesta 12 kuoppalevyformaatissa käyttäen CMC-, agaroosi- tai Avicel-päällysteitä, joita inkuboitiin vierekkäin 72 tuntia infektion jälkeen (hpi). Edustava levy, jossa laimennokset vaihtelevat 10-4:n ja 10-7:n välillä, näkyy paneelissa A. CMC- ja agaroosipeittoja käyttäneet plakit osoittivat pieniä, kirkkaita ja selviä plakkeja, joissa oli hyvin määritelty pyöreä reuna. Nesteellä päällystetyt plakit olivat hieman runsaampia ja suurempia verrattuna agaroosi- ja CMC-plakkeihin, ja niissä oli vähemmän selkeä raja. Virustittereitä verrattiin paneelissa B, ja kaikki peittokerrokset suoriutuivat vertailukelpoisella tavalla.

Jotta saataisiin selkeämpi visuaalinen vertailu MP12:n peittokerrosten välillä sekä suurempi otoskoko toistettavuuden määrittämiseksi, myös 6 kuoppalevyä testattiin kolmena kappaleena (kuva 2). Kuuden kuopan levymuodossa CMC-päällysteen käyttö osoitti pienempiä plakkeja kuin agaroosi- tai nestepäällysteet, jotka olivat kooltaan vertailukelpoisia keskenään. Vaikka virustitterit olivat samankaltaisia kaikkien kolmen päällyslevyn välillä (paneeli D), agaroosi- ja nestemäisissä päällyslevyissä muodostuneet plakit osoittautuivat helpommiksi laskea niiden suuremman koon vuoksi.

VEEV-titterit ja plakkien morfologia eri päällyslevyjen välillä poikkesivat selvästi toisistaan, toisin kuin RVFV:n kohdalla (kuva 3A). CMC-päällysteissä muodostuneet plakit osoittivat selkeää ja selkeää morfologiaa, kun käytettiin 12 kuoppalevyformaattia, plakkien koon ja herkkyyden kustannuksella (paneeli B). Toisin kuin CMC:ssä, agaroosi- ja nestemäisten päällysteiden käyttö johti huomattavasti suurempiin plakkeihin, mikä osoittaa vähäisempää viruksen estoa ja lisääntynyttä herkkyyttä VEEV:n replikaatiolle. Tämä vahvistettiin aiemmin, kun yksinomaan verrattiin agaroosia ja CMC:tä Juarezin ym. julkaisemassa artikkelissa 4. Vaikka agaroosi- ja nestemäiset peittokerrokset tuottivat suurempia plakkeja kuin CMC, plakkeilla oli huonosti määritellyt rajat, ja niitä oli vaikea laskea 12 kuopan formaatissa, ja nestemäiset peittokerrokset tarjosivat suurimman rajadiffuusion. Kun plakkeja kokeiltiin 6 kuoppalevyillä (kuva 4), suurempi 6 kuoppalevyjen formaatti poisti ongelman selvästi suurista plakeista, joita oli vaikea erottaa 12 kuoppalevyn formaatissa, ja agaroosi- ja nestemäiset päällekkäislevyt osoittautuivat CMC-päällekkäislevyjä paremmiksi plakkien määrittelyn ja herkkyyden suhteen (kuva 4D).

Vertailtaessa RVFV:hen tai VEEV:hen influenssaan liittyy plakkeja tehtäessä useita ainutlaatuisia haasteita, kuten vaatimus ulkoisen proteaasin olemassaolosta. Influenssaviruksen herkkyys erilaisille päällekkäisvalinnoille on myös dokumentoitu hyvin aiemmin, sillä merkittäviä muutoksia on havaittu, kun on käytetty niinkin vähäisiä muutoksia kuin eri agaroosimerkkejä9.

Interenkiintoista on, että Taiwanin influenssa B -kannan osalta CMC:n käyttö päällekkäislevynä johti selvästi pienempiin plakkeihin, joita oli vaikea laskea ja joita oli vaikea pisteyttää luotettavasti (kuva 5A). Agaroosipeittokerroksen käyttö tuotti parhaat plakit (paneeli C) ja johti tummempaan taustavärjäykseen (todennäköisesti monokerroksen lisääntyneestä elinkelpoisuudesta johtuen), ja siinä näkyi selkeämpiä ja terävämpiä plakkeja suorassa vertailussa nestemäisen peittokerroksen käyttöön (paneeli B).

Nestemäisten polymeerien selvä etu kiinteisiin ja puolikiinteisiin peittokerroksiin, kuten agaroosiin ja CMC:hen, nähden piilee irrotuksen ja levityksen helppoudessa. Puolikiinteät päällysteet vaativat kuumentamista, ja jähmettyminen voi osoittautua ongelmalliseksi käsittelyssä ja poistamisessa. Näiden etujen hyödyntämiseksi ja Avicelin käytännöllisyyden määrittämiseksi RVFV:ssä korkean läpimenon menetelmällä kokeiltiin 96-kuoppalevyformaattia vaihtelevilla päällekkäispitoisuuksilla (kuva 6). RVFV MP-12:n osalta laimennokset tehtiin nelinkertaisina sekä 0,6 että 1,2 prosentin Avicel-loppupitoisuuksilla. Päällysteen levittäminen ja poistaminen osoittautui yksinkertaiseksi, eikä toistojen välillä tai pitoisuuksien välillä havaittu ilmeisiä eroja, mikä osoittaa, että toistettavuus on hyvä. Pisteytettäessä plakit olivat erottuvia ja laskettavissa paljaalla silmällä, mikä osoittaa, että RVFV:n nestemäisten päällekkäisyyksien hyödyntäminen suurella läpivirtauksella on mahdollista.

Kuvio 1:RVFV-plakkien päällekkäisyyksien vertailut 12-kuoppalevyjä hyödyntäen. Veroja istutettiin 2,5 x 105 solua 12 kuoppalevyille ja infektoitiin 200 µl:lla käyttäen samaa sarjalaimennettua MP12-alkunäytettä. Infektion jälkeen levitettiin 1,5 ml 0,3-prosenttista agaroosia, 0,6-prosenttista Avicelia tai 1-prosenttista CMC:tä (lopulliset pitoisuudet) sisältäviä päällekkäisnäytteitä, jotta päällekkäisnäytteitä voitiin verrata suoraan, kuten on esitetty paneelissa A. Plakit laskettiin ja titteröitiin paneelissa B. .

Kuvio 2:RVFV:n plakkien päällekkäisnäytteen vertailut kuuden kuopan levyjä hyödyntäen. Veroja istutettiin 5 x 105 solua 6 kuoppalevyihin ja infektoitiin 400 µl:lla käyttäen samaa sarjalaimennettua MP12-alkunäytettä. Kolme millilitraa 0,3-prosenttista agaroosia, 0,6-prosenttista Avicelia tai 1-prosenttista CMC:tä sisältäviä päällekkäisyyksiä levitettiin päällekkäisyyksien suoraa vertailua varten, kuten on esitetty paneeleissa A, B ja C. Erilliset kokeet suoritettiin identtisesti paneeleissa A-C kuvatulla tavalla, ja plakit laskettiin ja titteröitiin paneelissa D (N = 3).

Kuvio 3:VEEV-plakkien päällekkäisyyksien vertailut 12 kuoppalevyjä hyödyntäen. Veroja istutettiin 2,5 x 105 solua 12 kuoppalevyille ja infektoitiin 200 µl:lla käyttäen samaa sarjallisesti laimennettua lähtönäytettä VEEV TC-83 -rokotekannasta. Infektion jälkeen levitettiin 1,5 ml 0,3-prosenttista agaroosia, 0,6-prosenttista Avicelia tai 1-prosenttista CMC:tä 1,5 ml:n päällekkäiskerroksia, jotta päällekkäiskerroksia voitiin verrata suoraan, kuten paneelissa A on esitetty. Plakit laskettiin ja titteröitiin paneelissa B.

Kuvio 4: VEEV:n plakkien päällekkäiskerroinvertailut kuuden kuopan levyjä hyödyntäen. Veroja istutettiin 5 x 105 solua 6 kuoppalevyihin ja infektoitiin 400 µl:lla käyttäen samaa sarjalaimennettua VEEV TC-83:n lähtönäytettä. Infektion jälkeen levitettiin 3 ml 0,3-prosenttista agaroosia, 0,6-prosenttista Avicelia tai 1-prosenttista CMC:tä sisältäviä päällekkäiskerroksia, jotta päällekkäiskerroksia voitiin verrata suoraan, kuten paneeleissa A, B ja C on esitetty. Erilliset kokeet suoritettiin identtisesti kuten paneeleissa A – C on kuvattu, ja plakit laskettiin ja titteroitiin paneelissa D (N = 3).

Kuvio 5: Influenssataipumuksen aiheuttamat plakkien päällekkäiskerrosten vertailut. MDCK-soluja istutettiin 5 x 105 solua 6 kuoppalevyihin ja infektoitiin 400 µl:lla inokulaatiota käyttäen samaa sarjaan laimennettua lähtönäytettä influenssa B Taiwanista. Kasvualustoissa tai päällekkäisyyksissä ei käytetty naudan sikiöseerumia (FBS), koska FBS voi estää influenssan etenemistä estämällä tiettyjä proteaaseja, joita tarvitaan viruksen fuusioitumiseen. Kaikkiin päällysteisiin lisättiin TPCK-trypsiiniä ennen levittämistä, jotta viruksen fuusio ja pääsy isäntäsoluihin helpottuisi. Infektion jälkeen levitettiin 3 ml 0,3-prosenttista agaroosia, 0,6-prosenttista Avicelia tai 1-prosenttista CMC:tä sisältäviä päällekkäisyyksiä, jotta päällekkäisyyksiä voitiin verrata suoraan, kuten on esitetty paneeleissa A, B ja C. Erilliset kokeet suoritettiin samalla tavalla kuin paneeleissa A – C on kuvattu, ja plakit laskettiin ja titteröitiin paneelissa D (N = 3). Vaikka CMC-plakkien osalta otettiin keskiarvo, niitä osoittautui vaikeaksi laskea luotettavasti, koska ne osoittivat diffuuseja rajoja ja hyvin pieniä plakkikokoja.

Kuvio 6: Korkean läpivirtauksen plakkien päällekkäisyydet. 96 kuoppalevyn Veros-soluja, joihin oli istutettu 3 x 104 solua kuoppaa kohti, infektoitiin 50 µl:lla inokulaatiota käyttäen samaa RVFV MP12:n sarjalaimennettua lähtönäytettä 1 tunnin ajan, nelinkertaisesti. Peittokerroksia varten kokeiltiin 0,6 ja 1,2 %:n lopullisia Avicel-pitoisuuksia, jotta voitiin määrittää nestemäisten peittokerrosten käyttökelpoisuus ja toistettavuus korkean läpimenon menetelmällä, taulukot A ja B.

Taulukko 1:

Taulukko 2:Plakkien ja virusten/solujen kasvumediat

Yläpohjaliuokset eivät vanhene valmistettaessa niin kauan kuin steriiliys säilyy.

Taulukko 3: Overlays Stock

Taulukko 4: Levymuodot

.