3.1 OMVs: Composition, Biogenesis, and Functional Roles
OMV:t ovat vastustuskykyisiä ja erillisiä pallomaisia lipidikaksikerroksisia nanorakenteita, joiden läpimitta vaihtelee 10-300 nm:n välillä, jotka ovat peräisin solukuoresta ja jotka eivät kykene itsenäisesti monistumaan (Kulp ja Kuehn, 2010; Huang ym., 2016) (Kuva 4). OMV:iden irtoaminen havaittiin ensimmäisen kerran yli 50 vuotta sitten bakteerien soluseinän ultrastruktuuria kuvaavissa läpäisyelektronimikroskooppikuvissa (Bladen ja Waters, 1963; Bayer ja Anderson, 1965; Chatterjee ja Das, 1967). Todettiin, että nämä nanopallomaiset rakenteet koostuvat yhdestä kalvosta, joka ympäröi elektronitiheää keskusta (Work et al., 1966). Myös muissa saman ajanjakson tutkimuksissa raportoitiin ”solunulkoisten pallojen” esiintymisestä ravinteita rajoittavissa kasvuolosuhteissa viljellyn E. coli -bakteerin soluttomassa supernatantissa (Bishop ja Work, 1965; Knox et al., 1966; Work et al., 1966). Siksi aluksi oletettiin, että OMV:iden muodostuminen tapahtuu ainoastaan stressitilanteissa. Jatkotutkimukset osoittivat kuitenkin selvästi, että OMV:tä voidaan havaita myös muissa kuin stressaavissa olosuhteissa sekä laboratorio- että ympäristöolosuhteissa (Hoekstra et al., 1976; Hellman et al., 2000). Nykyään tiedetään, että OMV:t osallistuvat lukemattomiin keskeisiin biologisiin toimintoihin, ja yksi ensimmäisistä tehtävistä, joita OMV:ille on koskaan kuvattu, on niiden osallistuminen patogeneesiin, erityisesti virulenssitekijöiden kuljettamiseen (ks. Ellis ja Kuehn, 2010). Vuosien mittaan OMV:ille on annettu lajista ja viljelyolosuhteista riippuen muitakin toimintoja, kuten lajinsisäistä/lajinsisäistä viestintää, herkkyyttä reagoida kuoristressiin, ravinteiden hankintaa, horisontaalista geeninsiirtoa, toimimista houkutusaineina ja julkishyödykkeinä (yksityiskohtainen kuvaus, ks. Kulp ja Kuehn, 2010 ja Schwechheimer ja Kuehn, 2015). Yleisesti ottaen OMV:t näyttävät edistävän bakteerin selviytymistä tietyssä ympäristön kapeikossa, mikä korostaa niiden merkitystä bakteerien homeostaasin kannalta.
Kuva 4. OMV:t. Gramnegatiivisten bakteerien ulkokalvon vesikkeleitä. (A) Bakteerin solukuoresta (alempi paneeli) peräisin olevan ulomman kalvon vesikkelin (OMV-yläpaneeli) esitys. Ulkokalvon (OM) ja sisemmän kalvon (IM) yksityiskohdat on esitetty, mukaan lukien transmembraaniproteiinit. Periplasmisessa tilassa, jossa on peptidoglykaanikerros (PG), näkyy liukoisia periplasmisia proteiineja, väärin taitettuja proteiineja ja nukleiinihappoja. OMV:n sisältö havainnollistaa osan biomolekyyleistä, jotka on tunnistettu sekä niiden kalvolla että luumenissa. (B ja C) Transmissioelektronimikroskooppikuvat uranyyliasetaattinegatiivisesti värjätystä Synechocystis sp. PCC 6803:n solusta, joka vapauttaa OMV:n (B, 120 000 × suurennos), ja Synechocystis sp. PCC 6803:n soluvapaasta konsentroidusta solunulkoisesta väliaineesta, jossa näkyy useita OMV:itä (C, 40 000 × suurennos).
(A)Perustuu artikkeliin: Jan, A.T., 2017. Gramnegatiivisten bakteerien ulkokalvon vesikkelit (OMV): näkökulman päivitys. Front. Microbiol. 8, 1053.
Lukuiset tutkimukset ovat osoittaneet, että OMV:t ovat rikastuneet OM-komponenteilla, nimittäin LPS:llä ja OMP:llä, sekä periplasmisilla proteiineilla, PG-fragmenteilla ja jopa sytoplasma- ja nukleiinihapoilla (Biller ym., 2014, 2017; Lee ym., 2016). Varhaisissa raporteissa ei varsinaisesti erotettu liuoksessa keinotekoisesti muodostettuja MV:itä (johtuen lipidien luonnollisesta käyttäytymisestä ryhmittyä uudelleen vesikkeleiksi, jotka erittelemättömästi sulkevat sisäänsä bakteerien lyysistä peräisin olevaa materiaalia) ehjistä OMV:istä. Viime aikoina parannetut eristysmenetelmät ja nykyaikaiset omics-tekniikat ovat mahdollistaneet OMV:iden koostumuksen huolellisen analysoinnin. Huomionarvoista on, että OMV:t ovat itse asiassa rikastuneet tietyissä solukomponenteissa, kun taas toisissa ne ovat köyhtyneet (Lee et al., 2008), mikä tukee ajatusta siitä, että lastin sisällön valinta ei ole satunnainen prosessi. Esimerkiksi Salmonella sp.:n OMV:iden sisältö vaihteli testattujen kasvuolosuhteiden mukaan: soluista eristetyissä OMV:issä havaittiin ravinnepitoisten olosuhteiden vallitessa ensisijaisesti translaatioon ja solun aineenvaihduntaan osallistuvia sytosolisia proteiineja, kun taas ravinnepitoisten olosuhteiden vallitessa rajoittavat olosuhteet OMV:t olivat rikastuneet kalvoproteiineihin, jotka osallistuivat ravintoaineiden kuljetukseen (Bai ym., 2014). Lisäksi massaspektrometriaan perustuva lähestymistapa osoitti, että OMV:ssä ei havaittu mitään laajalti konservoitunutta spesifistä komponenttia (Schwechheimer ym., 2013), mikä jälleen kerran viittaa vaihtelevaan koostumukseen. Kaiken kaikkiaan on odotettavissa, että erilaiset OMV-koostumukset liittyvät sekä kannasta riippuviin solukuorten erityispiirteisiin että erilaisiin ekologisiin markkinarakoihin (Yoon, 2016).
Kolmea toisiaan poissulkevaa OMV:n muodostumismekanismia on ehdotettu. Yhdessä mallissa vesikulaatio tapahtuu, kun kalvoproteiinien ja PG-kerroksen väliset kovalenttiset ristisidokset rikkoutuvat paikallisesti joko ristisidosten yleisen runsauden tilapäisellä vähenemisellä tai ristisidosten paikallisella siirtymisellä, mikä edistää pienten OM-osien pullistumista. Toinen malli käsittää periplasmiset nanoterritoriot, joihin kerääntyy väärinfoldattuja proteiineja ja muita kuoren komponentteja (LPS tai PG-fragmentteja). Tämän solukomponenttien epänormaalin, rajoitetun kerääntymisen seurauksena kuoren eheys heikkenee paikallisesti, mikä käynnistää lumenin sisällöllä kuormitettujen OM-osien pullistumisen. Lopuksi on myös ehdotettu, että tiettyjen OM-lipidien erityiset biofysikaaliset ominaisuudet voivat edistää vesikulaatiota kohdentamalla LPS:n tai fosfolipidien spesifisen integraation, mikä johtaa muutoksiin kalvon juoksevuudessa ja joustavuudessa. On myös oletettu, että monet muut tekijät vaikuttavat OMV:iden kokoon, tuotantonopeuteen ja koostumukseen, ja jos yksimielinen OMV:iden biogeneesiprosessi on olemassa, sitä ei ole täysin luonnehdittu (Kulp ja Kuehn, 2010; Schwechheimer ja Kuehn, 2015; Yoon, 2016).
Syanobakteeritutkimuksessa OMV:iden tutkimuskenttä on vielä melko tuore, ja paljon on vielä tutkimatta. Tätä kuvaa erityisen hyvin se, että varhaisin yksinomaan syanobakteerien OMV:iden tutkimukselle omistettu julkaisu on vuodelta 2014 (Biller et al., 2014). Tässä uraauurtavassa tutkimuksessa osoitetaan, että merensyanobakteeri Prochlorococcuksen laboratoriokontrolloidut viljelmät vapauttavat jatkuvasti OMV:tä, mutta myös, että näitä vesikkeleitä löytyy runsaasti merivesinäytteistä. Lisäksi osoitettiin, että Prochlorococcus OMV:t pystyivät tukemaan heterotrofisten bakteeriviljelmien kasvua, mikä osoittaa, että nämä rakenteet osallistuvat merten hiilivirtoihin. Lisäksi havaittiin meren faagi-vesikkeli-vuorovaikutuksia, mikä osoittaa, että OMV:t voivat toimia ”houkutusaineina”. Kaiken kaikkiaan kirjoittajat havainnollistivat joitakin OMV:iden perustavanlaatuisia rooleja ja niiden lukemattomia vaikutuksia mikrobiekosysteemeihin (Biller et al., 2014). Tuoreemmassa julkaisussa Prochlorococcuksen OMV:itä verrattiin kolmen muun merellisen heterotrofisen mikrobin OMV:iin, jotta saataisiin selville DNA:n vesikkeleihin pakkaamisen yleisyys ja vaihtelu eri taksonien välillä (Biller et al., 2017). Tarkastelemalla OMV:iin liittyvän DNA:n määrää ja jakautumista osoitettiin, että DNA kapseloituu eri tavoin OMV-populaatioiden sisällä ja niiden välillä. Vielä ratkaisevammin tämä työ viittaa siihen, että mekanismi, joka paketoi DNA:n OMV:iin, ei toimi samalla tavalla kaikissa bakteereissa (Biller et al., 2017). Prochlorococcuksen ja merellisten Synechococcus-kantojen lisäksi myös muiden syanobakteerien on osoitettu muodostavan ja vapauttavan OMV:itä, mukaan lukien yksisoluiset Synechococcus sp. PCC 7002 (Xu et al., 2013) ja Synechocystis sp. PCC 6803 (Pardo et al., 2015; Oliveira et al., 2016), filamenttinen Jaaginema litorale LEGE 07176 (Brito et al., 2017) ja filamenttinen, heterokystia muodostava Anabaena sp. PCC 7120 (Oliveira et al., 2015a) ja Cylindrospermopsis raciborskii (CYRF-01) (Zarantonello et al., 2018).
Edellä kuvattujen merisyanobakteereista peräisin olevien OMV:iden roolien (Biller et al., 2014) lisäksi näille solunulkoisille vesikkeleille on ehdotettu muitakin tehtäviä. Syanobakteerien vapauttamat OMV:t voisivat toimia tehokkaana eritysreittinä. Metabolisesti muunnetun Synechococcus sp. PCC 7002 -kannan, josta puuttuu kaksi glykogeenisyntaasigeeniä, glgA-I ja glgA-II, osoitettiin vapauttavan huomattavasti enemmän OMV:tä kuin villityypin kanta (Xu et al., 2013). Kirjoittajat olettivat, että koska tämän mutantin havaittiin vievän spontaanisti liukoisia sokereita väliaineeseen, havaitut OMV:t voisivat liittyä tähän erityismekanismiin, vaikka havaittujen OMV:iden sokeripitoisuutta ei arvioitu (Xu et al., 2013). Lisäksi osoitettiin, että Synechocystis sp. PCC 6803 -kannasta, josta puuttuu TolC-homologi (välttämätön kalvoista riippuvaisille erityismekanismeille; ks. kuvat 1 ja 3), vapautuu myös huomattavasti enemmän OMV:tä kuin emokannasta (Oliveira et al., 2016). Koska tolC-knockout oli voimakkaasti heikentynyt solunsisäisten proteiinien, aineenvaihduntatuotteiden ja eksogeenisten yhdisteiden erittymisessä, ehdotettiin, että hypervesikulaatio voisi täyttää erittymistarpeen. Yhteisymmärryksessä syanobakteerien OMV:n on myös ehdotettu kuljettavan biofilmin kehittymiseen tarvittavaa materiaalia. Tätä ehdotettiin, kun havaittiin syanobiontista peräisin olevia vesikkeleitä Azolla microphylla -vesisammalen sporokarpissa (Zheng et al., 2009). Koska geneettistä materiaalia havaittiin näiden vesikkelien sisällä, ne saattoivat toimia vektoreina syanobiontin ja saniaisen välisessä lateraalisessa geeninsiirrossa (Zheng et al., 2009). Syanobakteerien OMV:t voivat kuitenkin toimia myös mekanismina kuoristressin purkamiseksi: Gonçalves et al. luonnehtivat joukon Synechocystis sp. PCC 6803 -kantoja, joista puuttuu useita TolC-riippuvaisiin eritysjärjestelmiin osallistuvia IM-translokaasikomponentteja (Gonçalves et al., 2018). Mielenkiintoista oli, että OMV:ien erilaista vapautumiskapasiteettia esittävien kantojen joukossa tolC-knockout (tutkimuksen korkein OMV-tuottaja) oli ainoa, jolla oli huomattavan korkeat transkriptiotasot spy:lle ja degQ:lle, jotka koodaavat proteiineja, jotka osallistuvat kuoren stressivasteisiin, sekä Spy:n ja DegP:n yliekspressio (Gonçalves et al., 2018). Näin ollen kirjoittajat ehdottivat, että tolC:n deleetio aiheuttaa kuoristressiä ja että tolC-knockoutissa esiintyvä hypervesikulaatio edustaa riippumatonta mekanismia tällaisten stressitilanteiden käsittelemiseksi (Gonçalves et al., 2018).