Yleinen blotting-menetelmä alkaa kokonais-RNA:n uuttamisella homogenoidusta kudosnäytteestä tai soluista. Eukaryoottinen mRNA voidaan sen jälkeen eristää oligo(dT)-selluloosakromatografialla, jolla eristetään vain ne RNA:t, joilla on poly(A)-häntä. RNA-näytteet erotetaan sitten geelielektroforeesilla. Koska geelit ovat hauraita eivätkä koettimet pääse matriisiin, RNA-näytteet, jotka on nyt erotettu toisistaan koon mukaan, siirretään nailonkalvolle kapillaari- tai tyhjiöblotting-järjestelmän avulla.
Kapillaariblottausjärjestelmän asetelma RNA:n siirtämiseksi elektroforeesigeeliltä blottauskalvolle.
Positiivisesti varautunut nailonkalvo soveltuu parhaiten pohjoiseen blottaukseen, koska negatiivisesti varautuneilla nukleiinihapoilla on suuri affiniteetti niitä kohtaan. Blottingissa käytettävä siirtopuskuri sisältää yleensä formamidia, koska se alentaa koetin-RNA-vuorovaikutuksen annealing-lämpötilaa, jolloin ei tarvita korkeita lämpötiloja, jotka voisivat aiheuttaa RNA:n hajoamista. Kun RNA on siirretty kalvolle, se immobilisoidaan kovalenttisen sidoksen avulla kalvoon UV-valon tai lämmön avulla. Kun koetin on leimattu, se hybridisoidaan kalvolla olevaan RNA:han. Hybridisaation tehokkuuteen ja spesifisyyteen vaikuttavia kokeellisia olosuhteita ovat muun muassa ionivahvuus, viskositeetti, dupleksin pituus, epäsopivat emäsparit ja emäskoostumus. Kalvo pestään sen varmistamiseksi, että koetin on sitoutunut spesifisesti, ja taustasignaalien syntymisen estämiseksi. Hybridisignaalit havaitaan sitten röntgenfilmillä, ja ne voidaan kvantifioida densitometrialla.
RNA-näytteet erotetaan yleisimmin agaroosigeeleillä, jotka sisältävät formaldehydiä RNA:n denaturoivana aineena sekundaarirakenteen rajoittamiseksi. Geelit voidaan värjätä etidiumbromidilla (EtBr) ja tarkastella UV-valossa RNA:n laadun ja määrän havainnoimiseksi ennen blottia. Polyakryyliamidigeelielektroforeesia urean kanssa voidaan myös käyttää RNA:n erottamiseen, mutta sitä käytetään yleisimmin fragmentoituneeseen RNA:han tai mikroRNA:han. RNA:n tikapuut ajetaan usein näytteiden rinnalla elektroforeesigeelillä saatujen fragmenttien koon tarkkailemiseksi, mutta kokonais-RNA-näytteissä ribosomaaliset alayksiköt voivat toimia kokomarkkereina. Koska suuri ribosomaalinen alayksikkö on 28S (noin 5 kilotavua) ja pieni ribosomaalinen alayksikkö on 18S (noin 2 kilotavua), geelillä näkyy kaksi merkittävää kaistaa, joista suurempi on lähes kaksi kertaa voimakkaampi kuin pienempi.
KoettimetEdit
Pohjablottauksessa käytettävät koettimet koostuvat nukleiinihapoista, joilla on komplementaarinen sekvenssi koko kiinnostuksen kohteena olevalle RNA:lle tai sen osalle, ne voivat olla DNA:ta, RNA:ta tai oligonukleotideja, joissa on vähintään 25 komplementaarista emästä kohdesekvenssin kanssa. RNA-koettimet (riboprobeja), jotka transkriboidaan in vitro, kestävät tiukemmat pesuvaiheet ja estävät osan taustakohinasta. Yleensä cDNA:ta luodaan merkityillä alukkeilla kiinnostavaa RNA-sekvenssiä varten, jotta se toimisi koettimena northern blotissa. Koettimet on leimattava joko radioaktiivisilla isotoopeilla (32P) tai kemiluminesenssillä, jossa emäksinen fosfataasi tai piparjuuriperoksidaasi (HRP) hajottaa kemiluminesenssisubstraatteja, jolloin syntyy havaittava valon emissio. Kemiluminesenssimerkintä voi tapahtua kahdella tavalla: joko koetin on kiinnittynyt entsyymiin tai koetin on merkitty ligandilla (esim. biotiinilla), jonka ligandi (esim. avidiini tai streptavidiini) on kiinnittynyt entsyymiin (esim. HRP). Röntgenfilmillä voidaan havaita sekä radioaktiiviset että kemiluminesenssisignaalit, ja monet tutkijat suosivat kemiluminesenssisignaaleja, koska ne ovat nopeampia, herkempiä ja vähentävät radioaktiivisten leimojen aiheuttamia terveysriskejä. Sama kalvo voidaan tutkia jopa viisi kertaa ilman, että kohde-RNA:ta menetetään merkittävästi.