Epäadaptiivinen hypoteesi ja sen ennusteet
Katsotaanpa genomista paikkaa koodaavalla alueella, joka on tällä hetkellä G:llä ja joka ei hyväksy A:ta (ks. ylin rivi kuviossa 1.2.a). Kun muokkausaktiivisuus lajissa kasvaa, G:stä A:ksi muuttuva mutaatio kyseisessä kohdassa voi muuttua neutraaliksi ja kiinnittyä, jos tuloksena oleva A muokataan takaisin G:ksi riittävän suuressa osassa mRNA-molekyylejä (ks. keskimmäinen rivi kuvassa 1a). G:stä A:ksi tapahtuvan substituution jälkeen kohteen korkea editointitaso säilyy valikoivasti, koska mRNA-tasolla sallitaan G eikä A. Koska edellä kuvattu tilanne koskee vain nonsynonyymisiä G:stä A:han tapahtuvia substituutioita ja niihin kytkeytyvää nonsynonyymistä A:sta G:hen tapahtuvaa muokkausta, se paisuttaa nonsynonyymien muokkauskohtien lukumäärää ja nonsynonyymien muokkaustasoja suhteessa vastaaviin synonyymisiin arvoihin. Vaikka tässä tapauksessa nonsynonyyminen muokkaus on mahdollistanut muuten haitallisen G-A-mutaation kiinnittymisen, johdettu genotyyppi, jossa genominen A on pitkälle muokattu, ei ole sopivampi kuin alkuperäinen genotyyppi, jossa on genominen G. Muokkaus ei siis ole adaptiivista. Oletimme edellä esitetyssä skenaariossa, että muokkauksen taso on niin korkea, että muuten haitallinen G-A-mutaatio muuttuu neutraaliksi. On myös mahdollista, että muokkaustaso ei ole riittävän korkea, jolloin G-A-mutaatio on hieman haitallinen (ks. kuvan 1a alin rivi). Hieman haitallinen mutaatio voi kuitenkin kiinnittyä ja muokkaustasoa voidaan valikoivasti nostaa myöhemmässä evoluutiossa. Jopa tässä skenaariossa alkuperäisestä genotyypistä, jossa on genominen G, ei synny nettokuntohyötyä johdettuun genotyyppiin, jossa on genominen A, joka on pitkälle muokattu. Kutsumme edellä esitettyä ei-adaptiivista mallia, joka sisältää molemmat kuvatut skenaariot, haitan sallivaksi malliksi, koska RNA-editointi sallii muuten haitallisten mutaatioiden kiinnittymisen. Vaikka RNA-editoinnin aiheuttaman haitan sallimisen mahdollisuutta on ehdotettu useaan otteeseen31,38,39,40, erityisesti organellien transkriptomien editoinnin osalta, empiiristä näyttöä siitä, että se on kokonaan tai ensisijaisesti vastuussa RNA-editoinnin ”adaptiivisten signaalien” luomisesta, ei ole.
Haitan salliva malli ja strategia haitan sallivan vaikutuksen havaitsemiseksi. a Nonsynonyymisen editoinnin haitan salliva vaikutus. Ylin rivi osoittaa, että kun nonsynonyymistä A-kohtaa ei ole muokattu (tai sitä muokataan vain vähän), G-A-mutaatio kyseisessä kohdassa on liian haitallinen korjautuakseen. Keskimmäinen rivi osoittaa, että kun kohdetta muokataan paljon, G-A-mutaatiosta tulee neutraali ja se kiinnittyy geneettisen ajelehtimisen seurauksena. Korkea muokkaustaso on tällöin valikoivasti rajoitettu. Alin rivi osoittaa, että kun sivuston muokkaustaso on keskitasoa, G-A-mutaatio on hieman haitallinen ja se kiinnittyy geneettisen ajelehtimisen avulla. Muokkaustasoa voidaan edelleen nostaa positiivisella valinnalla (tai ylläpitää negatiivisella valinnalla). Huolimatta keskimmäisen ja alimman rivin suhteellisen korkeista ei-synonyymisistä muokkaustasoista ei sopeutumista (eli nettokuntoisuuden kasvua) tapahtunut, kun lopullista genotyyppiä verrataan alkuperäiseen genotyyppiin. DNA on esitetty sinisellä, kun taas RNA on esitetty punaisella. Muokkauksen jälkeiset nukleotidit on merkitty tähdillä. b Restoratiivinen muokkaus palauttaa esi-isien aminohappotilan, joka menetettiin aminohappojen vaihtuessa, mikä saattoi tapahtua tässä esitetyssä ulkoisessa haarassa tai jossakin aikaisemmassa haarassa. Toisin sanoen muokkauksen jälkeinen tila on identtinen muokkausta edeltävän esivanhemman tilan kanssa. c Monipuolistava muokkaus luo aminohappotilan, joka eroaa muokkausta edeltävistä tiloista tarkastellussa esivanhempien joukossa. Vaikka tässä esitetään vain yhden esi-isän tila, voidaan tarkastella useiden esi-isien tiloja. Kohdissa b ja c X ja Y edustavat eri aminohappotiloja, kun taas nuoli osoittaa muokkauksen vaikutuksen. Restoratiivinen mutta ei diversifioiva muokkaus voi antaa haittaa sallivan vaikutuksen.
Kun otetaan huomioon poikkeuksellisen suuri muokkausaktiivisuus koleoidissa hermokudoksissa25,27, oletamme, että raportoitu ei-synonyymisen muokkauksen ylivoima selittyy haittaa sallivalla mallilla ja että se ei ole adaptiivista. Tämän hypoteesin testaamiseksi jaamme ei-synonyymisen muokkauksen kahteen luokkaan: korjaavaan ja monipuolistavaan41. Restoratiivinen muokkaus muuttaa aminohappotilan takaisin esivanhempaan tilaan (kuva 1b), kun taas diversifioiva muokkaus muuttaa aminohappotilan ei-esivanhempaan tilaan (kuva 1c). Koska restoratiivinen muokkaus, mutta ei diversifioiva muokkaus, voi antaa haittoja sallivan vaikutuksen, hypoteesimme ennustaa, että raportoitu ei-synonyymisen muokkauksen enemmistö koleoideissa johtuu restoratiivisesta, mutta ei diversifioivasta muokkauksesta. Erityisesti ennustamme, että (i) muokattavien kohtien taajuus on suurempi restoratiivisen (FR) kuin synonyymisen (FS) muokkauksen yhteydessä ja että (ii) muokkauksen mediaanitaso on korkeampi restoratiivisen (LR) kuin synonyymisen (LS) muokkauksen yhteydessä. Lisäksi se ennustaa, että (iii) muokattujen kohteiden taajuus ei ole suurempi monipuolistavassa (FD) kuin synonyymisessä (FS) muokkauksessa ja että (iv) muokkauksen mediaanitaso ei ole korkeampi monipuolistavassa (LD) kuin synonyymisessä (LS) muokkauksessa. Sitä vastoin sopeutumishypoteesilla ei ole erityisiä ennusteita FR:stä ja LR:stä, mutta se ennustaa, että FD ja LD ovat vastaavasti suurempia kuin FS ja LS. On huomionarvoista, että vaikka vain korjaava muokkaus voi olla haittaa sallivaa, kaikki korjaava muokkaus ei välttämättä ole haittaa sallivaa. Esimerkiksi restoratiivinen muokkaus olisi neutraalia, jos se palauttaa neutraalin G-A-substituution.
Patterns of restorative and diversifying editing
Testataksemme ei-adaptiivista hypoteesia analysoimme julkaistuja neuraalisia transkriptomeja kuudesta nilviäislajista27 , joiden fylogeneettiset suhteet on esitetty kuvassa 2a. Niistä neljällä koleoidilla on laajalle levinnyt koodaava A-G-editointi hermokudoksissa, kun taas kahdella ulkoryhmällä on huomattavasti vähemmän editointikohteita27.
Tunnistimme näissä kuudessa lajissa 3587 yksikäsitteistä ortologista geeniä ja päättelimme esivanhempien koodaavia sekvenssejä kaikissa lajipuun sisäsolmupisteissä (Kuva 2a). Katsoimme, että nonsynonyyminen muokkaustapahtuma puun sisemmässä solmussa, joka muuttaa aminohappotilan X:stä Y:ksi, on korjaava, jos johdettu genomisekvenssiin perustuva aminohappotila on Y missä tahansa puun solmussa, joka on esivanhempaa kuin keskeinen ulkosolmu (kuva 1b; ks. myös ”Menetelmät”), tai monipuolistava, jos Y:tä ei ole missään puun solmussa, joka on esivanhempaa kuin keskeinen ulkosolmu (kuva 1c). On syytä huomata, että nämä määritelmät perustuvat aminohappotiloihin ja että niitä sovelletaan vain ei-synonyymiseen muokkaukseen. Synonyyminen muokkaus on oletettavasti neutraalia, joten sitä ei tarvitse erottaa korjaavaan ja monipuolistavaan muokkaukseen. Lisäksi synonyymisen muokkauksen erottaminen näihin kahteen luokkaan olisi epätarkempaa, koska synonyymisten paikkojen esivanhempien sekvenssien päättelyyn on vähemmän luotettavuutta. Nonsynonyymisten muokkauskohteiden kahdesta luokasta diversifioivien muokkauskohteiden määrä on 8,4-13,9 kertaa suurempi kuin restoratiivisten muokkauskohteiden määrä neljässä koleoidissa (lisätaulukko 1).
Kussakin neljässä koleoidissa FR ja LR ovat merkittävästi suuremmat kuin FS (kuva 2b) ja LS (kuva 2c). Sitä vastoin FD on merkittävästi pienempi kuin FS (kuva 2b), kun taas LD ei eroa merkittävästi LS:stä (kuva 2c). Nämä tulokset vahvistavat kaikki neljä ei-adaptiivisen hypoteesin ennustetta ja ovat ristiriidassa adaptiivisen hypoteesin ennusteiden kanssa, mikä viittaa vahvasti siihen, että ei-synonyymisen muokkauksen ylivoima koleoidissa selittyy haittoja sallivalla mallilla ja on ei-adaptiivista. Kuvasta 2c nähdään, että vaikka LR on huomattavasti suurempi kuin LS kussakin koleoidissa, se on pienempi kuin 2,5 %. Voidaan kysyä, voiko näin alhainen korjaavan muokkauksen mediaanitaso olla haittoja salliva. Kuten mainittiin, kaikki korjaava muokkaus ei välttämättä ole haittoja sallivaa, mikä voisi selittää, miksi LR ei ole erityisen korkea. Kuvasta 2c käy kuitenkin ilmi, että restoratiivisen muokkauksen osuus on suurempi kuin synonyymisen muokkauksen osuus, jolla on huomattavat muokkaustasot. Esimerkiksi kalmarilla 33,37 %:lla ja 13,31 %:lla restoratiivisista muokkauskohteista mutta vain 22,97 %:lla ja 6,74 %:lla synonyymisistä muokkauskohteista muokkaustaso on >5 % ja >20 %. Riippuen G-A-mutaation haitallisuudesta ja A- ja G-isoformien suhteellisesta dominanssista, nämä huomattavat A-G-editointitasot voivat lisätä G-A-mutaation kiinnittymistodennäköisyyttä huomattavasti. On myös huomattava, että haittoja sallivaa hypoteesia ehdotetaan vaihtoehtona adaptiiviselle hypoteesille. Jos kohtalainen määrä ei-synonyymistä muokkausta voisi olla hyödyllistä, kuten sopeutumishypoteesissa väitetään, ei ole mitään syytä, miksi se ei voisi olla haittoja sallivaa. Lisäksi yleinen suuntaus LR > LS ja LD < LS tukee haittoja sallivaa hypoteesia suhteessa adaptiiviseen hypoteesiin.
Tarkastellaksemme tulostemme kestävyyttä teimme neljä lisäanalyysiä. Ensinnäkin tarkastelimme vastaavasti kullekin neljälle koleoidille ominaisia muokkauspaikkoja, koska lajikohtaisilla muokkaustapahtumilla on samanlainen evoluutioikä, mikä mahdollistaa oikeudenmukaisemmat vertailut. Saadut tulokset ovat hyvin samankaltaisia kuin kuvassa 2 esitetyt tulokset, ja ne ovat kestäviä lajikohtaisen muokkauksen mahdollisille virheellisille tunnistuksille (täydentävä kuva 1). Toiseksi tutkimme bimacin yksittäisistä kudoksista tunnistettuja muokkaustapahtumia. FR > FS ja FD < FS pitävät paikkansa kaikissa kudoksissa, mutta editointitason vertailut ovat enimmäkseen merkityksettömiä, mikä johtuu todennäköisesti pienentyneestä tilastollisesta tehosta pienentyneen otoskoon vuoksi (lisätaulukko 2). Kolmanneksi, koska vierekkäisten muokkauskohtien muokkaustasoihin voi vaikuttaa samanaikaisesti mutaatio, mikä vähentäisi tilastollista tehoa vertailtaessa synonyymisiä ja ei-synonyymisiä muokkauskohteita, vertasimme synonyymisiä muokkauskohteita geenijoukon toisessa puoliskossa ja ei-synonyymisiä muokkauskohteita toisessa puoliskossa. Tarkemmin sanottuna järjestimme kaikki geenit mustekalan ja kalmarin ortologien dN/dS-suhteen mukaan ja ryhmittelimme vastaavasti geenit, joilla oli parittomat sijat, lokeroon 1 ja geenit, joilla oli parilliset sijat, lokeroon 2. Tämän jälkeen vertasimme synonyymistä muokkausta lokerossa 1 ei-synonyymiseen muokkaukseen lokerossa 2 sekä synonyymistä muokkausta lokerossa 2 ei-synonyymiseen muokkaukseen lokerossa 1. Tulokset (Täydentävä kuvio 2) ovat samankaltaisia kuin kaikista muokkauskohteista saaduista tuloksista saadut tulokset (kuvio 2). Neljänneksi tutkimme FR/FS- ja FD/FS-arvoja viidellä muokkaustasoalueella (0-20 %, 20-40 %, 40-60 %, 60-80 % ja 80-100 %) kussakin koleoidissa (täydentävä kuva 3). Sekä FR/FS että FD/FS kasvavat yleensä muokkaustason kasvaessa. Vaikka FR/FS on lähes aina yli 1, FD/FS on pienempi kuin 1, paitsi kun muokkaustaso on yli 60 %. On tärkeää korostaa, että vain muutama prosentti koleoidin monipuolistuvista muokkauskohteista sijoittuu tälle muokkaustasoalueelle (lisätaulukko 3), mikä viittaa siihen, että valtaosa monipuolistuvasta muokkauksesta ei ole sopeutuvaa (kvantitatiiviset arviot ks. jäljempänä).
Kiihdytetyt nonsynonyymiset G-to-A-substituutiot
Haitan salliva malli ennustaa lisäksi, että nonsynonyymisen G-to-A-substituution nopeuden suhteessa synonyymisen G-to-A-substituution nopeuteen (dN/dS G-to-A:lle) pitäisi olla kohonnut, koska korkea muokkausaktiviteetti tekee joistakin muutoin haitallisista nonsynonyymisistä G-to-A-mutaatioista hyväksyttäviä. Lisäksi tämän nousun pitäisi olla erityisen voimakasta geeneissä, jotka ilmentyvät yksinomaan hermokudoksissa, mutta ei geeneissä, jotka eivät ilmentyisi hermokudoksissa, koska suurta editointiaktiivisuutta on toistaiseksi havaittu vain hermokudoksissa25,27. Koska kuitenkin vain bimakilla ja mustekalalla on saatavilla RNA-sekvensointitietoja useista muista kuin hermokudoksista ja koska hermokudoksissa ilmentymättömiä geenejä ei ole mustekalan ja seepian transkriptiosekvenssitiedoissa ja ne on näin ollen jätetty pois kohdistuksistamme, jouduimme määrittelemään kaksi geeniryhmää, joilla on suhteellisen korkea ja suhteellisen matala spesifisyys hermokudosten ilmentymiseen. Geenit, joilla on korkea neuraalisen ilmentymisen spesifisyys, ilmentyvät yksinomaan hermokudoksissa bimakissa tai kalmarissa, kun taas geenit, joilla on matala neuraalisen ilmentymisen spesifisyys, ilmentyvät sekä hermokudoksissa että muissa kuin hermokudoksissa sekä bimakissa että kalmarissa. Haitan salliva malli ennustaa, että dN/dS G-A:lle on suurempi geeneille, joilla on suhteellisen korkea neuraalinen ilmentymispesifisyys, kuin geeneille, joilla on suhteellisen matala neutraalinen ilmentymispesifisyys. Koska harm-permitting-vaikutus on olemassa vain silloin, kun G-A-mutaatio paikassa on haitallinen ilman muokkausta, keskityimme nonsynonyymisiin paikkoihin, jotka ovat konservoituneita kahdessa outgroup-lajissa (eli nautiluksella, merijäniksellä ja kohdelajin välittömällä esi-isällä solmulla on sama muokkausta edeltävä tila) testimme herkkyyden lisäämiseksi. Lisäksi dN/dS:n kohoamisen pitäisi olla spesifistä G:stä A:ksi muutoksille, koska muiden muutosten, kuten C/T:stä A:ksi ja G:stä C:ksi/T:ksi, mahdollisia haittoja ei voida lieventää A:sta G:ksi muokkauksella.
Tässä tarkoituksessa tarkastelimme kaikkia kuutta haaraa, jotka polveutuvat neljän koleoidin yhteisestä esi-isästä. Laskimme kunkin näistä haaroista dN:n ja dS:n käyttäen olemassa olevia ja pääteltyjä esivanhempien sekvenssejä ja laskimme sitten dN/dS:n jakamalla dN:n kokonaismäärän näiden haarojen dS:n kokonaismäärällä. Ennusteemme tueksi G-A-muutosten dN/dS on suurempi geeneille, joilla on suhteellisen korkea neuraalisen ilmentymisen spesifisyys, kuin geeneille, joilla on suhteellisen matala spesifisyys (kuva 3). Bootstrappaamalla vastaavasti kaksi geeniryhmää 200 kertaa havaitsimme, että edellä mainittu ero on tilastollisesti merkitsevä (P = 0,015). Sitä vastoin dN/dS:ssä ei ole merkittävää eroa näiden kahden geeniryhmän välillä, kun otetaan huomioon C/T-A-muutokset tai G-C/T-muutokset (Kuva 3). Huomionarvoista on, että dN/dS < 1 kaikissa kuvassa 3 esitetyissä tapauksissa, mikä on sopusoinnussa haittoja sallivan mallin kanssa, johon ei liity positiivista valintaa.
Koleoidin ei-synonyymisten ja synonyymisten substituutionopeuksien suhdelukujen (dN/dS) suhde (dN/dS) eri nukleotidimuutoksille. P-arvo perustuu 200 bootstrap-näytteeseen; ns, ei merkitsevä. Lähdetiedot toimitetaan Source Data -tiedostona.
Lajien yhteisen muokkauksen mahdollinen hyöty
On esitetty, että useiden lajien yhteinen muokkaus on todennäköisesti hyödyllistä, koska muokkaustilanne ei muuten todennäköisesti ole evolutiivisesti konservoitunut36. Tätä ehdotusta tukee havainto, että jopa nisäkkäillä, joilla suurin osa nonsynonyymisestä muokkauksesta vaikuttaa neutraalilta tai haitalliselta, sekä ihmisellä että hiirellä nonsynonyymisen muokkauksen kohteena olevien konservoitujen paikkojen esiintymistiheys ylittää huomattavasti synonyymisen muokkauksen kohteena olevien konservoitujen paikkojen esiintymistiheyden molemmissa lajeissa36. Samanlainen ilmiö on raportoitu hedelmäkärpäsillä23. Koleoideissa huomattava osa nonsynonyymisestä muokkauksesta on yhteistä ainakin kahdelle lajille, ja korkeasti muokatut kohdat ovat yleensä yhteisiä27. Ymmärtääksemme mahdollisia evolutiivisia voimia, jotka ylläpitävät RNA-editointia tietyissä paikoissa useiden koleoidien välillä, analysoimme kahden tai useamman lajin kladin jakamaa editointia.
Lajien kladin jakamaa nonsynonyymistä editointitapahtumaa, joka muuttaa aminohappotilan X:stä Y:ksi, pidetään restoratiivisena, jos pääteltävissä oleva genomisekvenssiin pohjautuva aminohappotila on Y missä tahansa puun solmukohdassa, joka on kladin viimeisimmälle yhteiselle esivanhemmalle, tai diversifioivana, jos Y:tä ei esiinny yhdessäkään tällaisessa esivanhempien solmukohdassa. Tutkittaessa jaettua muokkausta otimme huomioon keskimääräisen muokkaustason siinä kladissa, jossa muokkaus on jaettu. Mustekalan ja bimacin sekä mustekalan ja seepian yhteisten muokkauskohtien osalta FR ja FD ovat molemmat huomattavasti pienempiä kuin FS (kuva 4a). Sitä vastoin LR ja LD ovat molemmat merkittävästi suurempia kuin LS (kuva 4b). Niiden edellä mainittujen yhteisten muokkauskohteiden osajoukon osalta, jotka ovat yhteisiä kaikille neljälle koleoidille, FD ja LD ovat vastaavasti merkitsevästi suurempia kuin FS (kuva 4a) ja LS (kuva 4b), samoin kuin FR (kuva 4a) ja LR (kuva 4b). Merkittävästi suurempi FD kuin FS jaetun muokkauksen osalta voi johtua i) positiivisesta valinnasta, joka edistää sellaisten mutaatioiden alkuperäistä kiinnittymistä, jotka johtavat ei-synonyymiseen muokkaukseen, ja/tai ii) puhdistavasta valinnasta, joka estää oletettavasti hyödyllisen ei-synonyymisen muokkauksen häviämisen; näin ollen se on selvä indikaattori adaptiivisesta ei-synonyymisestä muokkauksesta. Merkittävästi suurempi LD kuin LS jaetun muokkauksen osalta voi johtua i) positiivisesta valinnasta, joka edistää oletettavasti hyödyllisen nonsynonyymisen muokkauksen muokkaustasojen kasvua, ja ii) puhdistavasta valinnasta, joka estää oletettavasti hyödyllisen nonsynonyymisen muokkauksen muokkaustasojen laskun, (iii) puhdistava valinta estää ensisijaisesti korkeatasoisen nonsynonyymisen muokkauksen häviämisen oletettavasti siksi, että korkeat muokkaustasot liittyvät suurempiin hyötyihin kuin matalat muokkaustasot, ja/tai (iv) positiivinen valinta edistää ensisijaisesti matalatasoisen nonsynonyymisen muokkauksen häviämistä luultavasti siksi, että A:sta G:ksi tapahtuvaa substituutiota suositaan muokatussa paikassa erityisesti silloin, kun muokkaustaso on alhainen. Siitä huolimatta huomattavasti suurempi LD kuin LS viittaa myös adaptiiviseen ei-synonyymiseen muokkaukseen. Näin ollen kaikkien neljän koleoidin yhteinen ei-synonyyminen muokkaus osoittaa voimakkaita ja johdonmukaisia adaptiivisia signaaleja, mikä viittaa siihen, että suuri osa siitä on adaptiivista. Vertailun vuoksi mustekalan ja bimacin sekä mustekalan ja mustekalan ja seepian yhteisessä nonsynonyymisessä muokkauksessa on joitakin mutta ei kaikkia merkkejä sopeutumisesta, ja sopeutumissignaalit ovat paljon heikompia, mikä viittaa siihen, että vain pienempi osa on sopeutuvaa.
Mikä on sopeutumissignaaleja osoittavan yhteisen muokkauksen yleinen hyöty? On olemassa kaksi hypoteesia. Ensinnäkin editointi voi olla hyödyllistä, koska syntyy organismin sisäistä proteiinien monimuotoisuutta25,27,32,42. Toisin sanoen editointi mahdollistaa sen, että organismissa on kaksi proteiini-isomuotoa kutakin editoitua kohtaa kohti, mikä voi antaa korkeamman kelpoisuuden, mikä vastaa heterotsygoottien etua polymorfisissa paikoissa. Vaihtoehtoisesti editointi tarjoaa uuden isomuodon, joka voi yksinkertaisesti olla kelpoisempi kuin editoimaton isomuoto. Tämän jälkimmäisen hypoteesin mukaan editoinnin hyöty on verrattavissa nukleotidisubstituution hyötyyn. Näiden kahden hypoteesin erottamiseksi toisistaan keskityimme kohtiin, jotka ovat editoituja vähintään kolmessa neljästä koleoidista, koska editointia olisi pitänyt olla näissä kohdissa neljän lajin yhteisessä esi-isässä parsimoniaperiaatteen mukaisesti (kuva 2a). Tämän jälkeen arvioimme, kuinka usein muokkaus on korvattu A:sta G:hen tapahtuvalla substituutiolla missä tahansa neljästä lajista. Tällaisten korvausten odotetaan olevan enemmän tai vähemmän neutraaleja synonyymiselle muokkaukselle. Nonsynonyymisen muokkauksen osalta tällaiset korvaukset ovat haitallisia ensimmäisen hypoteesin mukaan proteiinien monimuotoisuuden vähenemisen vuoksi, mutta neutraaleja toisen hypoteesin mukaan. Näin ollen ensimmäinen hypoteesi ennustaa, että tällaisten korvausten esiintymistiheys on pienempi nonsynonyymisessä muokkauksessa kuin synonyymisessä muokkauksessa, kun taas toinen hypoteesi ennustaa, että tällaisten korvausten esiintymistiheys on yhtä suuri synonyymisessä ja nonsynonyymisessä muokkauksessa.
Mielenkiintoista on se, että tällaisten korvausten esiintymistiheys nonsynonyymisessä muokkauksessa on merkitsevästi suurempi kuin synonyymisessä muokkauksessa kaksinapaisen tarkan Fisherin testin mukaan (kuva 4c ja lisätaulukko 4). Koska kyseessä on jaettu monipuolistava muokkaus, jonka osalta hyödyn luonne on kyseenalainen, rajoitimme analyysin koskemaan vain monipuolistavaa muokkausta, mutta saimme samanlaisen tuloksen (kuva 4c ja täydentävä taulukko 4). Huomionarvoista on, että yhtään synonyymistä tai ei-synonyymistä muokkausta ei havaittu korvattavan A:sta C:ksi/T:ksi tapahtuvalla substituutiolla tässä joukossa kohteita (täydentävä taulukko 4). Havaintomme viittaa siihen, että ei-synonyyminen muokkaus korvataan todennäköisemmin A:sta G:ksi kuin synonyyminen muokkaus, luultavasti siksi, että genominen G on parempi kuin genominen A, jota ei voida muokata G:ksi kaikissa mRNA-molekyyleissä. Toisin sanoen tuloksemme hylkäävät ensimmäisen hypoteesin ja viittaavat siihen, että adaptiivisen A:sta G:hen tapahtuvan muokkauksen hyöty on luonteeltaan samanlainen kuin saman nukleotidin substituution hyöty, vaikkakin ensin mainitusta saatava hyöty on pienempi kuin jälkimmäisestä saatava hyöty. Lisäksi kuvassa 4c esitetty havainto viittaa siihen, että kaikkien neljän koleoidin yhteinen huomattavasti suurempi FD kuin FS muokkauksen osalta selittyy paremmin positiivisella valinnalla, joka edistää hyödylliseen ei-synonyymiseen muokkaukseen johtaneiden mutaatioiden alkuperäistä kiinnittymistä, kuin puhdistavalla valinnalla, joka estää hyödyllisen ei-synonyymisen muokkauksen häviämisen.