Miten ioninvaihtokromatografia toimii?

Ioninvaihtokromatografia eli ioninvaihtokromatografia (IEX-kromatografia) on tekniikka, jota käytetään yleisesti biomolekyylien puhdistuksessa. Siinä molekyylit erotetaan toisistaan niiden varauksen perusteella.

Tässä tekniikassa hyödynnetään vuorovaikutusta näytteen varattujen molekyylien ja kromatografiamatriisin paikallaan olevan faasin vastakkaisesti varattujen osien välillä. Tämäntyyppinen erottelu on vaikeaa muilla tekniikoilla, koska varausta on helppo manipuloida käytetyn puskurin pH:lla.

Ioninvaihto-erottelu on mahdollista kahdella eri tavalla – kationinvaihto ja anioninvaihto. Anioninvaihdossa stationäärifaasi on positiivisesti varautunut, kun taas kationinvaihdossa se on negatiivisesti varautunut.

Ioninvaihtokromatografian periaate

Ioninvaihtokromatografiaa käytetään varautuneiden biomolekyylien erottamiseen. Nestefaasina käytetään varautuneita molekyylejä sisältävää raakanäytettä. Kun se kulkee kromatografiakolonnin läpi, molekyylit sitoutuvat stationäärifaasin vastakkaisesti varautuneisiin kohtiin.

Varautumisensa perusteella erotetut molekyylit eluoidaan vaihtelevan ionivahvuuden omaavalla liuoksella. Kun tällainen liuos johdetaan kolonnin läpi, tapahtuu molekyylien erittäin selektiivinen erottuminen niiden erilaisten varausten mukaan.

Tekniikka

Ioninvaihtokromatografiamenetelmän keskeiset vaiheet on lueteltu seuraavassa:

• Epäpuhdas proteiininäyte ladataan ioninvaihtokromatografiakolonniin tietyssä pH:ssa.
• Latautuneet proteiinit sitoutuvat hartsin vastakkaisesti varautuneisiin funktionaalisiin ryhmiin
• Erotettujen proteiinien eluointiin käytetään suolagradienttia. Pienillä suolapitoisuuksilla eluoituvat proteiinit, joilla on vähän varattuja ryhmiä, ja korkeammilla suolapitoisuuksilla eluoituvat proteiinit, joilla on useita varattuja ryhmiä.
• Ei-toivotut proteiinit ja epäpuhtaudet poistetaan pesemällä pylväs.

PH-gradienttia voidaan käyttää myös yksittäisten proteiinien eluoimiseksi niiden isoelektrisen pisteen (pI) perusteella eli pisteen, jossa proteiinin aminohapot kantavat neutraalia varausta eivätkä näin ollen vaella sähkökentässä. Koska aminohapot ovat kitterionisia yhdisteitä, ne sisältävät ryhmiä, joilla on sekä positiivisia että negatiivisia varauksia. Ympäristön pH:n perusteella proteiineilla on positiivinen, negatiivinen tai olematon varaus. Isoelektrisessä pisteessään ne eivät ole vuorovaikutuksessa pylvääshartsin varattujen osien kanssa, joten ne eluoituvat. Laskevaa pH-gradienttia voidaan käyttää proteiinien eluointiin anioninvaihtohartsilla ja nousevaa pH-gradienttia proteiinien eluointiin kationinvaihtohartsilla. Tämä johtuu siitä, että liikkuvan faasin puskurin pH:n nostaminen aiheuttaa sen, että proteiinista tulee vähemmän protonoitunut (vähemmän positiivisesti varautunut), jolloin se ei voi muodostaa ionista vuorovaikutusta negatiivisesti varautuneen hartsin kanssa, mikä mahdollistaa eluoitumisen. Vastaavasti liikkuvan faasin pH:n alentaminen saa molekyylin muuttumaan protonoituneemmaksi (vähemmän negatiivisesti varautuneeksi_, jolloin sen eluoituminen mahdollistuu.

Hartsin valinta ioninvaihtokromatografiassa

Ioninvaihtohartseissa on positiivisesti tai negatiivisesti varautuneita funktionaalisia ryhmiä, jotka ovat kovalenttisesti sidoksissa kiinteään matriisiin. Matriisit ovat yleensä selluloosaa, polystyreeniä, agaroosia ja polyakryyliamidia. Hartsin valintaan vaikuttavia tekijöitä ovat muun muassa anioni- tai kationinvaihtaja, virtausnopeus, heikko tai vahva ioninvaihtaja, hartsin hiukkaskoko ja sitoutumiskyky. Kiinnostavan proteiinin stabiilisuus määrää anioni- tai kationinvaihtajan valinnan – kumpaakin vaihtajaa voidaan käyttää, jos stabiilisuudesta ei ole huolta.

Ioninvaihtokromatografian sovellukset

Ioninvaihto on laajimmin käytetty kromatografinen menetelmä varattujen biomolekyylien, kuten polypeptidien, proteiinien, polynukleotidien ja nukleiinihappojen, erottamiseen ja puhdistamiseen. Sen laaja sovellettavuus, suuri kapasiteetti ja yksinkertaisuus sekä korkea resoluutio ovat keskeisiä syitä sen menestykseen erotusmenetelmänä. Ioninvaihtokromatografiaa käytetään laajalti useissa teollisissa sovelluksissa, joista joitakin ovat seuraavat:

• Verikomponenttien, kuten albumiinin, rekombinanttisten kasvutekijöiden ja entsyymien erottelu ja puhdistus.
• Bioteknologia – Analyyttiset sovellukset, kuten laadunvalvonta ja prosessien seuranta
• Elintarvike- ja kliininen tutkimus – vehnälajikkeiden tutkimiseen ja proteinurian korrelaation selvittämiseen eri munuaissairauksien kanssa.
• Käyminen – Kationinvaihtohartseja käytetään fermentaatioprosessin seurantaan ß-galaktosidaasin tuotannon aikana.

Lisälukemista

• Kaikki kromatografiasisällöt
• Kromatografian yleiskatsaus
• Kaasukromatografia-massaspektrometrian (GC-MS) sovellukset
• Korkean suorituskyvyn nestekromatografia (HPLC)
• Nestekromatografia-Massaspektrometria (LC-MS) Sovellukset

Sitaatit