Tässä tutkimuksessa oletimme, että erilaiset RNA:n eristämistavat vaikuttavat tuloksiin analysoitaessa geeniekspressiota kudoksissa. RNA:n uuttomenetelmiä voidaan karkeasti luonnehtia joko fenoli:kloroformi-uuttoon, jota seuraa alkoholisaostus (TRIzol), fenoli:kloroformi-uuttoon, jota seuraa kiinteän faasin uutto (pylväspohjainen; miRVana ja miRNeasy), ja kiinteän faasin erotteluun affiniteettihartsin kanssa tai ilman (Norgen total ja Isolate II). Nämä menetelmät on ensisijaisesti kehitetty pitkien mRNA:iden uuttamista varten, ja ne ovat perustuneet oletukseen, että kaikki RNA:t puhdistuvat yhtä hyvin. Lisäksi tietyn RNA:n uuttomenetelmän valintaan liittyy useita näkökohtia, kuten laatu, määrä, hinta ja helppokäyttöisyys (aika uuttamiseen). Tässä esitämme tietoja, jotka osoittavat, että RNA:n uuttamismenetelmä tuottaa myös vaihtelevia tuloksia eri menetelmiin verrattuna tuotantoketjun loppupään sovelluksissa, ja siksi se on toinen tärkeä näkökohta.
Tämä tutkimus osoittaa, että RNA:n eristysmenetelmät vaihtelevat RNA-näytteiden määrän ja laadun sekä miRNA:n ja kohdegeenien ilmentymisen analysoinnin suhteen. Valitsimme elimiä, joista RNA:n eristäminen voi olla vaikeaa eri syistä. Esimerkiksi RNA:n eristämisen aivoista on usein todettu johtavan alhaisiin saantoihin niiden korkean lipidipitoisuuden vuoksi. Tämä oli erityisen ilmeistä Bioline Isolate II -kitillä. Valmistajan protokollan mukaan 10 mg:sta rotan/hiiren aivoja olisi puhdistettava enintään 5 μg RNA:ta. MiRNeasy-käsikirjan mukaan aivoista pitäisi kuitenkin saada 5-20 μg RNA:ta samalla määrällä lähtöaineistoa. Valmistajan verkkosivustolla olevassa vianmäärityksessä kuvataan, että yksi ongelma lipidipitoisten kudosten kanssa on pylvään tukkeutuminen, ja ehdotetaan näytemäärän pienentämistä tai lyysipuskurin tilavuuden lisäämistä. Meidän uuttomme suoritettiin protokollan ehdotetuissa rajoissa. Tämän jälkeen he suosittelevat esiuuton suorittamista TRIsure-reagenssilla (Biolinen vastine TRIzolille) ja sen jälkeen pylväspohjaista erottelua kitillä vesifaasin puhdistamiseksi. Tämä menetelmä olisi tällöin verrattavissa miRVana- ja miRNeasy RNA:n uuttomenetelmiin ja saattaisi johtaa parempaan saantoon tässä kudoksessa. Lisäksi RNA:n laatu korreloi kudospesifisten vasteiden kanssa fysiologiseen stressiin sekä ennen kudoksen kuolemaa että sen jälkeen. Keuhkojen ja maksan kaltaisilla kudoksilla on tyypillisesti alhaiset RIN-arvot ja pieni 28S-piikki, koska nämä kudokset ovat alttiita RNA:n nopeammalle hajoamiselle korkeiden nukleaasipitoisuuksien vuoksi. Nukleaasien inaktivoimiseksi kudos jäädytetään nopeasti ja sulatus estetään, kunnes punnittu materiaali lisätään uuttopuskuriin. Vaikka kudoksen sulaminen estettiin, emme voi sulkea pois sitä, että aika, joka kului eläimen eutanasiasta ja elinten poistamisesta pikapakastamiseen, olisi vaikuttanut osaltaan alhaisiin RIN-arvoihin ja joihinkin hajoamistuotteisiin, joita havaittiin kaikissa keuhkonäytteissä käytetystä eristyssarjasta riippumatta. Vaihtoehtoinen menetelmä nukleaasien inaktivoimiseksi on käyttää RNA:ta stabiloivaa liuosta, kuten RNAlateria (ThermoFisher Scientific), jonka avulla jäädyttämättömät kudosnäytteet voidaan käsitellä myöhemmin. Se voi auttaa varmistamaan RNA:n eheyden, mutta se ei ole yhteensopiva kaikkien RNA:n eristysmenetelmien kanssa, ja käyttäjien olisi tarkistettava oma menetelmänsä ennen uuton suorittamista. Bioanalysaattorilla tehdyssä analyysissä joissakin näytteissä 60 sekunnin jälkeen esiintyvä piikin lisäys viittaa gDNA-kontaminaatioon. Joillakin sarjoilla pylväille voidaan tehdä ylimääräinen DNaasikäsittely, mutta gDNA:n poistaminen käänteisen transkriptiovaiheen aikana on erittäin suositeltavaa. Tämän vaiheen sisällyttäminen menetelmiimme saattaa selittää, miksi Norgenin keuhkonäytteiden mRNA-ekspression analysoinnissa ei esiintynyt häiriöitä, mutta se vaikutti miRNA-ekspression analyysiin, koska Taqmanin miRNA-määritysprotokolla ei sisällä gDNA:n poistoa. Lisäksi RNA-näytteiden puhtaus on kriittinen tekijä, sillä vaikka näytteiden, joiden RIN > 7, pitäisi toimia moitteettomasti useimmissa jatkojalostussovelluksissa, nukleaasit, metalli-ionit tai orgaaniset epäpuhtaudet voivat estää entsymaattisia reaktioita sisältäviä näytteitä, kuten qPCR:ää. Yleisesti ottaen Bioline Isolate II RNA -näytteiden 260/230-suhteet olivat alhaisemmat, ja epäpuhtaudet saattoivat vaikuttaa sen huonoon suorituskykyyn. Lopuksi havaittiin eroja miRNA:iden rikastumisessa kokonais-RNA-valmisteessa. Koska miRNA:t edustavat pientä osaa koko RNA-repertuaarista, niiden osuutta voi olla vaikea määrittää eheysanalyysin perusteella. Qubit-mikroRNA-määritys tarjoaa erittäin selektiivisen pienten RNA-määrien havaitsemisen jopa yleisten epäpuhtauksien läsnä ollessa. MiRVana- ja Norgen-uuttomenetelmillä havaittiin yleisesti suuria osuuksia miRNA:ta, mutta kun otetaan huomioon Norgenin kokonais-RNA-valmisteiden eheysanalyysi, on mahdollista, että miRNA-rikastuminen on yliarvioitu, koska pienempiä RNA-fragmentteja havaitaan suurempien RNA:iden (mRNA:iden, rRNA:iden tai tRNA:iden) hajoamisen tai hapettumisen seurauksena, tai keuhkonäytteiden tapauksessa DNA-kontaminaatio, joka häiritsee Qubit-menetelmällä saatuja tuloksia. Näin ollen RNA-näytteiden määrä, laatu ja puhtaus ovat erittäin tärkeitä tekijöitä valittaessa tiettyä RNA:n uuttomenetelmää, ja jatkotutkimus siitä, miten nämä menetelmät voidaan optimoida kiinnostuksen kohteena olevaa kudosta varten, voi auttaa parantamaan näitä tekijöitä.
MiRNA:iden profilointi voi antaa tietoa biomarkkereiksi diagnostisiin tai ennusteellisiin sovelluksiin. Esimerkiksi miRNA-paneeleja voidaan käyttää erilaisten syöpäfenotyyppien luokitteluun, uusiutumisen ennustamiseen tai hoitovasteen ennustamiseen . MiRNA-pohjaisten biomarkkereiden löytämiseksi ja kliiniseksi soveltamiseksi tarvitaan kuitenkin optimoituja ja standardoituja käytäntöjä RNA:n uuttamiselle, jotta vältytään ristiriitaisilta tuloksilta. Esimerkiksi Zhou et al. (2014) tekemässä 63 julkaistun tutkimuksen meta-analyysissä havaittiin epäjohdonmukaisia ja jopa ristiriitaisia tuloksia arvioitaessa oncomiR:n, miR-21:n, ennustearvoa. Kirjoittajat selittävät heterogeenisuuden johtuvan eroista näytteiden lähteessä, havaitsemismenetelmissä ja normalisointimenetelmissä, mutta eivät viitanneet RNA:n uuttamismenetelmiin, joiden osoitamme myös vaikuttavan asiaan.
Hyvin harvojen miRNA:iden biologiset funktiot ja kohteet on validoitu kokeellisesti, mutta tämä on ratkaisevaa miRNA-pohjaisen terapian potentiaalin hyödyntämisen kannalta. Lisäksi kudosspesifisten biologisten toimintojen paljastaminen auttaa tunnistamaan niiden terapeuttisen vaikutuksen ja mahdolliset off-target-vaikutukset normaaleissa kudoksissa. MiRNA-mRNA-vuorovaikutusten validointi suoritetaan ensisijaisesti soluviljelytesteissä, joihin liittyy endogeenisten miRNA:iden keinotekoinen manipulointi. Soluviljelyssä tapahtuvalla manipuloinnilla (esim. jäljittelijöiden transfektiolla) saavutetut tasot eivät kuitenkaan yleensä vastaa in vivo havaittuja fysiologisia tasoja, minkä vuoksi on tärkeää toistaa tulokset asianmukaisissa eläinmalleissa. Tällä hetkellä ei ole raportteja, joissa olisi suoraan verrattu miRNA:n ja kohdegeenin havaitsemista kokonais-RNA-näytteistä eri uuttomenetelmiä käyttäen. Osoitamme, että RNA:n uuttomenetelmät eroavat toisistaan tehokkuudeltaan sekä lyhyen että pitkän RNA:n eristämisessä, ja siksi sopivan menetelmän valintaa on harkittava huolellisesti, jos samasta näytteestä halutaan havaita molemmat.
Varhaisemmissa tutkimuksissa on yleisesti oletettu, että kaikenlainen RNA puhdistuu yhtä hyvin. Useat raportit ovat kuitenkin osoittaneet, että uuton tehokkuudessa on eroja riippuen RNA:n eristämiseen käytetystä menetelmästä. Kim ja muut (2011) peruuttivat Molecular Cell -lehdessä julkaistun artikkelinsa, koska he havaitsivat, että heidän päätelmänsä eroista miRNA:n ilmentymisessä soluissa, joita kasvatettiin eri konfluenssissa (korkea tiheys vs. matala tiheys) ja kun ne irrotettiin kasvatusmaljasta (adherentti vs. suspensio), johtuivat itse asiassa eroista RNA:n uuttamistehokkuudessa TRIzol-menetelmää käyttäen. He havaitsivat, että miRNA:t, joilla oli alhainen GC-pitoisuus ja vakaa sekundäärirakenne, hävisivät uuton aikana sen sijaan, että ne hajoaisivat soluissa, kuten he olivat alun perin julkaisseet . Aiemmissa El-Khouryn ym. (2016) tuloksissa havaittiin eroja miRNA:n talteenotossa soluista, plasmasta ja virtsasta/plasmasta peräisin olevista eksosomeista, kun verrattiin TRIzol LS-, miRNeasy-seerumi-/plasma- ja miRCURY-bioneste-uuttosarjoja . Kirjoittajat havaitsivat, että miRCURY-kitillä eristettiin erittäin puhdasta RNA:ta mutta huonosti miRNA:ta, TRIzolilla saatiin huonosti puhdasta RNA:ta, mikä vaikutti PCR:n tehokkuuteen, kun taas miRNeasy-kitillä saatiin huonolaatuista RNA:ta, mutta se toimi parhaiten miRNA:n havaitsemisessa. Vastaavasti McAlexander ym. (2013) havaitsivat eroja miRNA:n uuttamisessa plasmasta ja aivo-selkäydinnesteestä . He vertasivat miRVana-, miRCURY Cell and Plant kit- ja TRIzol LS -uutteita glykogeenin kanssa ja ilman sitä kantajana. miRVana oli samanlainen glykogeenin kanssa tai ilman sitä, kun taas miRCURY:llä ilman glykogeeniä miRNA:n talteenotto oli hieman alhaisempi kuin miRVana:lla. Glykogeeni paransi kuitenkin huomattavasti miRNA:n talteenottoa miRCURY-kitillä, mutta pahensi TRIzol-uuton heikkoa saantoa ja vaihtelua. Tämän jälkeen he vertasivat miRCURY Cell and Plant -kittiä miRCURY Biofluids – ja miRNeasy-seerumin/plasman uuttomenetelmiin, joissa oli glykogeeni kantaja-aineena, ja totesivat, että miRCURY Biofluids -menetelmässä oli suurin suhteellinen määrä piikitettyä eksogeenista miRNA:ta, ja päättelivät, että tämä oli ylivoimainen menetelmä heidän sovelluksessaan. Yhdessä nämä tutkimukset korostavat eroja RNA:n talteenotossa eri uuttomenetelmillä ja viittaavat siihen, että on tarpeen optimoida menetelmä kiinnostuksen kohteena olevan solun, kudoksen ja/tai nesteen osalta.
Työnkulussa on useita vaiheita, jotka voivat aiheuttaa kokeellista vaihtelua. Alkaen kudoksen kiinnitys- tai pakastusmenetelmästä, materiaalin varastoinnista, RNA:n uuttomenetelmästä, käänteiseen transkriptioon ja qPCR-monistukseen käytetystä menetelmästä tai muista jatkojalostusalustoista. Tässä tutkimuksessa olemme pyrkineet kontrolloimaan joitakin näistä muuttujista pikapakastamalla kudokset, säilyttämällä ne – 80 °C:ssa, estämällä sulattamisen ennen uuttamista ja käyttämällä suositeltavimpia käytäntöjä miRNA-ekspression analysoinnissa. Esimerkiksi sekvenssispesifisten RT-alkuaineiden käyttö universaalin RT-alkuaineen sijaan on osoittautunut paremmaksi spesifisen tuotteen monistamisen kannalta. qPCR:ää pidetään kultaisena standardina miRNA- ja kohde-ekspression analysoinnissa sen herkkyyden ja spesifisyyden vuoksi verrattuna globaaleihin profilointialustoihin. Tärkeää on, että saatujen tulosten laatu on tärkeämpää kuin suurilla sekvensointiin perustuvilla alustoilla profiloitujen miRNA:iden pelkkä määrä. Lisäksi, vaikka emme vertailleet miRNA-rikastuksen vaikutusta RNA-näytteistämme, aiemmissa raporteissa on suositeltu sitä vastaan, erityisesti globaalien miRNA-profilointialustojen osalta. Esimerkiksi Redshaw et al. (2013) havaitsivat, että lyhyen RNA:n rikastusmenettely johtaa huomattavasti pienempiin suhteellisiin miRNA-tasoihin verrattaessa kokonais-RNA:ta ja rikastettua materiaalia, erityisesti rikastusmenettely vähensi miRNA:iden kopiolukumäärää jopa 25 %:lla siitä, mitä se oli esirikastetuissa näytteissä, ja että tämä menetys vaihteli eri miRNA-sekvenssien osalta. Tämän vuoksi kokonais- ja lyhyistä RNA-valmisteista saadut miRNA-tiedot eivät välttämättä ole suoraan vertailukelpoisia. Lisäksi on esitetty, että suurempi RNA voi toimia pienten RNA:iden kantajana. Jää vielä selvittämättä, johtaisivatko kaikkien yritysten miRNA-rikastetut menetelmät parempaan talteenottoon kudoksista. Vaikka Bioline ehdottaa erillistä kittiä miRNA:n eristämistä varten, käytimme Isolate II total RNA -kittiä verrataksemme sitä suoraan muihin uuttomenetelmiin, koska miRNA-spesifinen kitti ei mahdollista sekä lyhyen että pitkän RNA:n eristämistä samasta eluoinnista. Pikemminkin miRNA-lajit rikastetaan ja eristetään ensin, ja pitkät RNA:t voidaan uuttaa sen jälkeen, jolloin saadaan kaksi erillistä fraktiota. Vaikka Isolate II:ta ei ole optimoitu pienten RNA:iden eristämiseen kuten miRVana- tai miRNeasy-kittejä, se ei myöskään ollut ylivoimainen kohdegeenien ilmentymisen kannalta. Koska tiettyjen kittien välillä on suuria eroja, tutkijoiden olisi valittava vankempi uuttomenetelmä.