Kuulun hematologian eturyhmään ja nautin aina muiden teknikoiden lähettämistä tapaustutkimuksista ja kysymyksistä. Tämä ryhmä on monikansallinen, joten näen viestejä teknikoilta kaikkialta maailmasta. On mielenkiintoista nähdä, miten samankaltaisia ja erilaisia vakiotoimintatavat ovat ja millaisia rooleja teknikot hoitavat eri alueilla ja eri maissa. On myös mielenkiintoista huomata, että me kaikki törmäämme samantyyppisiin ongelmiin ja vaikeisiin näytteisiin!Viime kuukausien aikana olen nähnyt tässä hematologian eturyhmässä monia kysymyksiä ja kommentteja, jotka koskevat kyhmyisten verihiutaleiden ratkaisemista, ja siksi käytän tätä tilaisuutta hyväkseni valottaakseni hieman näitä hankalia näytteitä. Esittelemäni tapaus ja kuvat ovat peräisin Abu Jad Caesarilta, joka on Medicare Laboratories – Tulkarmin toimipisteen laboratoriopäällikkö, Palestiinassa.
Potilaalle tehtiin verenkuva Nihon Kohden 6410 -laitteella. WBC oli 12,7 x 103μL, impedanssi trombosyyttien määrä oli 20 000/μL ensimmäisellä ajokerralla, muut parametrit näyttivät olevan normaalirajoissa. Näyte lämmitettiin ja pyydettiin Na-sitraattiputki pseudotrombosytopenian poissulkemiseksi.Lämmittämisen jälkeen EDTA-mittaus suoritettiin uudelleen, ja trombosyyttien määrä oli 0/μl. Na-sitraattiputki otettiin, ja trombosyyttien määrä oli 189 000/μl. (Kuva 1) Na-sitraattiputken veri:antikoagulantti-suhteen vuoksi käytettiin kerrointa 1,1, jolloin Na-sitraatti-trombosyyttien määrä oli 207 900/μl. Objektiolevyt valmistettiin, värjättiin ja tutkittiin. Kuvassa 1 näkyy EDTA-putkessa tapahtunut paakkuuntuminen. Kuvassa 2 on Na-sitraattiputken preparaatti, jossa ei ole näkyviä hyytymiä.
Kokonaisverenkuva raportoitiin seuraavin huomautuksin: Havaittiin verihiutaleiden paakkuuntumista, otettiin 2 näytettä trombosytopenian poissulkemiseksi. EDTA-kokoverinäytteessä todettiin useita verihiutaleiden paakkuja (EDTA:n aiheuttama trombosytopenia). Päätelmät: Verihiutaleet ovat riittävät ja niitä arvioidaan olevan noin 200 000/μl.
Normaalialueella olevat verihiutalemäärät eivät yleensä aiheuta suuria ongelmia raportoinnissa, vaikka niissä olisikin jonkin verran paakkuuntumista, lähinnä siksi, että ne ovat normaaleja. Riittävät verihiutalemäärät kuuluvat tyypilliselle viitealueelle, joka on noin 150-450 x 103/μl.Jos verihiutaleiden epänormaalin hajontakuvauksen tai verihiutaleiden paakkuuntumisen vuoksi on olemassa instrumenttimerkkejä, on suositeltavaa toistaa testaus toisella menetelmällä. Jos alkulaskenta suoritetaan impedanssilaskennalla, monet analysaattorit voivat ilmoittaa myös optisen tai fluoresoivan verihiutalemäärän. Impedanssilaskennassa hyvin pienet verihiutaleet tai fragmentit voidaan laskea verihiutaleiksi, jolloin verihiutaleiden määrä kasvaa virheellisesti. Optisessa laskennassa suuret verihiutaleet voidaan laskea verihiutaleiksi, jolloin määrä laskee virheellisesti. Joissakin Sysmexin hematologian analysaattoreissa käytetään impedanssi- ja optista laskentaa, ja niissä on myös fluoresoiva verihiutaleiden laskenta, jossa käytetään verihiutaleille spesifistä väriainetta ja joka antaa tarkan verihiutaleiden lukumäärän ilman muiden menetelmien aiheuttamia häiriöitä. Normaali verihiutalemäärä, vaikka verihiutaleet kasaantuisivat ja näkyisivätkin näytteessä, arvioidaan yleensä edelleen normaaliksi (tai se voi joskus olla suurentunut).
Trombosytopenia sen sijaan voi olla haaste hematologian laboratoriossa. Trombosytopeniassa lääkärit tarvitsevat tarkan lukumäärän diagnosoidakseen, hoitaakseen tai seuratakseen potilaita. Pienikin nousu tai lasku voi olla merkittävä, kun kyseessä on vaikea trombosytopenia. Kun verihiutaleita on vähemmän, jokainen verihiutale on tärkeä!
Yksi ensimmäisistä kysymyksistä, joita on kysyttävä näennäisen trombosytopenian yhteydessä, on se, onko kyseessä todellinen trombosytopenia vai pseudotrombosytopenia (PTCP). Todellinen trombosytopenia edustaa potilasta, jolla on alhainen verihiutaleiden määrä ja joka saattaa tarvita seurantaa tai lääketieteellisiä toimenpiteitä. Vääränlainen trombosytopenia voi olla vaarallista, mutta on myös vaarallista ilmoittaa matala verihiutalemäärä potilaalle, jolla on näennäinen trombosytopenia ja joka ei todellisuudessa ole trombosytopeeninen. Pseudotrombosytopenia eli väärennetty trombosytopenia määritellään keinotekoisesti tai virheellisesti alhaiseksi verihiutaleiden määräksi. PTCP:ssä alhainen verihiutalemäärä johtuu kokkareista, jotka lasketaan yhdeksi verihiutaleeksi. (Nämä suuret kokkareet voidaan laskea myös verihiutaleiksi, jolloin verihiutaleiden määrä kasvaa virheellisesti).
Voidaan jakaa PTCP kahteen luokkaan Trombosyyttikertymät johtuvat yleisimmin analyysia edeltävistä virheistä, kuten liian tai liian vähän täytetyistä EDTA-putkista, hyytyneistä näytteistä tai näytteenoton ja testauksen välisestä viiveestä. Teknikoiden on tarkistettava putki hyytymien ja näytetilavuuden varalta sekä tehtävä delta-tarkistus, jotta trombosytopenia ja PTCP voidaan erottaa toisistaan. Jos näyttäisi siltä, että näyte on ”hyvä”, seuraava vaihe olisi kuitenkin preparaattitutkimus. Jos näytteessä näkyy kokkareita, on päätettävä, mikä on aiheuttanut kokkareet. Onko kyseessä ensimmäinen luokka, jokin näistä yleisistä preanalyyttisistä ongelmista, vai onko kyseessä PTCP:n toinen luokka, verihiutaleiden in vitro -agglutinaatio? Tiloja, jotka voivat aiheuttaa verihiutaleiden in vitro -agglutinaation, ovat mm. kylmäagglutiniinit, multippeli myelooma, infektiot, antikardiolipiinivasta-aineet, korkeat immunoglobuliinitasot, absiximabihoito ja EDTA:n aiheuttama pseudotrombosytopenia. (EDTA-PTCP) Näistä EDTA:n aiheuttama pseudotrombosytopenia on yleisin syy. (Nakashima,2016).
Kun teknikot puhuvat verihiutaleiden paakkuuntumisongelmista, se johtuu yleensä siitä, että etsimme tapoja ratkaista tai arvioida tarkasti verihiutaleiden määrä näissä näytteissä, eikä yhtä helppoa vastausta näytä olevan.Paakkuuntuminen tekee tarkan laskennan mahdottomaksi, ja arviotkin voivat olla hyvin hankalia. Miten näitä lukumääriä voidaan arvioida? Ilmoitammeko vain, että verihiutaleet ovat kasaantuneet ja että ne näyttävät normaaleilta, pienentyneiltä tai suurentuneilta? Vai pitäisikö meidän jakaa arviomme useampiin vaihteluväleihin, jotta lääkärit saisivat arvokkaampaa tietoa?Entä jos palveluntarjoaja haluaa todellisen lukumäärän antaakseen potilaalle parhaan mahdollisen hoidon, emmekä pysty ratkaisemaan hyytymistä? Mitä voimme tehdä tarjotaksemme lukumäärän? Joitakin ensimmäisiä suositeltuja toimenpiteitä ovat näytteen pyörittäminen 2 minuutin ajan verihiutaleiden paakkujen hajottamiseksi ja sen jälkeen analysoiminen uudelleen. Näytteiden lämmittäminen voi myös auttaa ratkaisemaan verihiutaleiden paakkuja, erityisesti näytteissä, joissa on kylmiä agglutinineja tai jotka on kuljetettu tai säilytetty huoneenlämmössä tai sitä alhaisemmassa lämpötilassa, tai joiden testaus on viivästynyt. Jos trombosyyttipaakkuja esiintyy edelleen ja näytteen uudelleen kerääminen johtaa edelleen trombosyyttipaakkuuntumiseen, voidaan sulkea pois analyysia edeltävä virhe ja epäillä EDTA:n aiheuttamaa pseudotrombosytopeniaa. Monissa laboratorioissa otetaan vaihtoehtoinen putki tai käytetään toista menetelmää hyytymien poistamiseksi.
Mitä on siis EDTA:n aiheuttama trombosytopenia (EDTA-PTCP)? Tämä ei edusta tiettyä kliinistä kuvaa, eikä se ole minkään sairauden tai lääkehoidon diagnoosi, vaan se on laboratorioilmiö, joka johtuu EDTA-riippuvaisten IgM/IgG-autovasta-aineiden läsnäolosta.Nämä vasta-aineet sitoutuvat verihiutaleiden kalvojen glykoproteiineihin EDTA:n läsnä ollessa. Vaikka kyseessä on in vitro -ilmiö, potilailla, joilla on tiettyjä sairauksia, kuten pahanlaatuisia kasvaimia, krooninen maksasairaus, infektio, raskaus ja autoimmuunisairaudet, on lisääntynyt EDTA-PTCP:n riski. EDTA-PTCP:tä on kuitenkin havaittu myös potilailla, joilla ei ole sairautta. (Zhang, 2018)
Mitkä ovat joitakin vaihtoehtoisia menetelmiä, jotka auttavat ratkaisemaan EDTA:n aiheuttamat verihiutaleiden hyytymishaasteet? Todennäköisesti yleisin on ottaa näyte uudelleen Na-sitraattiputkeen. Sekä EDTA- että Na-sitraattiputket olisi vedettävä. Todellisessa EDTA-PTCP:ssä, kuten tapaustutkimuksessamme nähtiin, EDTA-putkesta otetussa näytteessä pitäisi näkyä paakkuja eikä Na-sitraattiputkesta otetussa näytteessä pitäisi näkyä paakkuja. Na-sitraattiputkessa olevan antikoagulantin määrän vuoksi Na-sitraattiputkesta saatuun verihiutalemäärään on sovellettava laimennuskerrointa 1,1 tarkan verihiutalemäärän saamiseksi. Huomaa kuitenkin, että hematologiset analysaattorit ovat FDA:n hyväksymiä ja validoituja käytettäväksi EDTA-putkien kanssa. Jos haluat käyttää muuta antikoagulanttia, menetelmä on validoitava laboratoriossasi. Huomaa myös, että vaihtoehtoiset menetelmät ratkaisevat yleensä vain EDTA -PTCP:n, mutta eivät muiden kylmäagglutiniinien, lääkkeiden tai sairauksien aiheuttamaa paakkuuntumista. Lisäksi antikoagulantin aiheuttama trombosytopenia ei rajoitu EDTA:han. Sitä voi esiintyä myös sitraatin ja hepariinin yhteydessä. Eräässä tutkimuksessa havaittiin, että jopa 17 prosentilla potilaista, joilla oli EDTA-PTCPalso, esiintyi tätä ilmiötä myös sitraatilla. Itse asiassa tutkijat ovat havainneet, ja me olemme havainneet omissa validoinneissamme, että jotkin näytteet, jotka eivät kasaannu EDTA:ssa, itse asiassa kasaantuvat Na-sitraatissa. Vaihtoehtoiset putket eivät siis välttämättä ratkaise kaikkia verihiutaleiden paakkuuntumista. (Geok Chin Tan, 2016)
Jotkut laboratoriot ovat validoineet ACD (sitruunahappo, trinatriumsitraatti, dekstroosi) -antikoagulanttiputket EDTA-PTCP:tä varten. Tätä menetelmää käytettäessä EDTA-putki ja ACD-putki on ajettava rinnakkain ja sovellettava muuntokerrointa, joka heijastaa näytteen laimennuksen eroa kahdessa putkessa. Vertailua varten on valittava jokin parametri, kuten RBC. Käyttämällä kaavaa, jossa EDTA:ssa oleva RBC jaetaan ACD:ssä olevalla RBC:llä, saadaan suhde, joka kuvastaa antikoagulanttien välisiä laimennuseroja. Tämä suhde voidaan sitten kertoa ACD:n verihiutalemäärällä, jolloin saadaan ACD:llä korjattu verihiutalemäärä. (CAP Today, 2014). Eräät lähteet ovat suositelleet ACD-putkia, koska NaCitraatilla tapahtuvan paakkuuntumisen esiintyvyys voi olla turhauttavan suuri. On esitetty teoria, että happamampi ACDputki saattaa estää verihiutaleiden paakkuuntumisen paremmin kuin Na-sitraatti. (Manthorpe, 1981)
Vähemmän käytettyjä putkia ovat CTAD (trinatriumsitraatti,teofylliini, adenosiini, dipyridamoli) ja hepariini. CTAD vaikuttaa suoraan verihiutaleisiin ja estää verihiutaletekijä 4:ää, mikä minimoi verihiutaleiden aktivoitumisen. CTAD-putkien haittapuolena on, että ne ovat valoherkkiä ja niitä on säilytettävä pimeässä, ja ne voivat olla kalliita. Ne myös muuttavat veren ja lisäaineen laimennussuhdetta, joten on käytettävä kalkulaatioita, kuten Na-sitraatin ja ACD:n tapauksessa. Hepariiniputket ovat harvemmin hyödyllisiä verihiutaleiden paakkuuntumisongelmien ratkaisemisessa, koska hepariini voi aktivoida verihiutaleita. Hepariiniputket ovat myös kalliimpia, joten ne eivät yleensä ole olleet ensimmäinen valinta EDTA-PTCP:ssä.
Olen kuullut teknikoilta, että heidän laboratorioissaan on saatu erittäin hyviä tuloksia käyttämällä EDTA-putkiin lisättyä amikasiinia, jolla estetään vääränlaiset alhaiset verihiutalemäärät potilailla, joilla on EDTA-PTCP. Amikasiini olisi lisättävä EDTA-putkeen 1 tunnin kuluessa näytteenotosta, ja testi säilyy huoneenlämmössä jopa 4 tuntia. Vuonna 2011 tehdyn tutkimuksen tulokset osoittivat, että amikasiinin lisääminen EDTA-putkeen johti verihiutaleiden kokkareiden nopeaan dissosiaatioon, eikä sillä ollut juurikaan tai lainkaan vaikutusta morfologiaan tai indikaattoreihin. Tämä menetelmä on osoittautunut erittäin lupaavaksi tarkkojen verihiutaleiden lukumäärän ilmoittamiseksi potilailla, joilla on moniantikoagulanttien aiheuttama PTCP. (Zhou, 2011)
Viimeinen antikoagulanttiputki, jonka olen nähnyt monien teknikoiden mainitsevan hematologian eturyhmässä, ovat Sarstedt ThromboExact -putket. Olen nähnyt monia viestejä näitä käyttäviltä teknikoilta, ja niiden onnistumisprosentti näyttää olevan erittäin hyvä. ThromboExact-putket sisältävät magnesiumsuoloja, ja ne on suunniteltu erityisesti verihiutaleiden määrän määrittämiseen PTCP-tapauksissa. Ne on tällä hetkellä validoitu ainoastaan verihiutaleiden lukumäärää varten, ja näytteet pysyvät stabiileina 12 tuntia näytteenoton jälkeen.Mielenkiintoista on, että ennen automatisoituja hematologisia analysaattoreita magnesium oli manuaalisten verihiutaleiden lukumäärän antikoagulantti. EDTA-PTCP on tunnustettu siitä lähtien, kun EDTA-automaattinen verihiutaleiden laskenta otettiin käyttöön 1970-luvulla. Vuonna 2013 Saksassa tehdyssä tutkimuksessa käytettiin ThromboExact-putkia, ja siinä saatiin erinomaisia tuloksia useiden antikoagulanttien aiheuttaman PTCP:n ratkaisemiseksi. Nämä putket tulivat kaupallisesti saataville tutkimuksen aikana vuonna 2013. (Schuff-Werner, 2013) Valitettavasti Yhdysvalloissa näitä putkia ei ole saatavilla Yhdysvalloissa. Olin äskettäin konferenssissa ja menin Sarstedtin edustajien luo ja kysyin näistä putkista. Minulle kerrottiin, että niitä on saatavilla osissa Eurooppaa ja Aasiaa, mutta ne eivät ole FDA:n hyväksymiä Yhdysvalloissa. Kysyin hyvin toiveikkaasti, pyrkivätkö he saamaan FDA:n hyväksynnän, ja minulle valitettavasti sanottiin, että ”he eivät usko, että heillä on riittävät markkinat hyväksynnän tavoitteluun.”
Riippumatta siitä, minkä vaihtoehtoisen menetelmän laboratorionne valitsee käytettäväksi, on suositeltavaa vetää EDTA- ja vaihtoehtoinen putki yhdessä. Näin voidaan verrata kahta laskentatulosta ja sitä, esiintyykö putkissa paakkuuntumista vai ei. Meillä on monia potilaita, joilla on ollut yksi tapaus, jossa verihiutaleet ovat paakkuuntuneet, mutta kun palveluntarjoaja tilaa Na-sitraatti-trombosyyttien laskennan, otamme uuden näytteen sekä EDTA- että Na-sitraattiputkesta yhdessä, eikä EDTA:lla ole havaittavissa merkintää tai paakkuuntumista. Näissä tapauksissa on asianmukaista antaa EDTA-tulokset, koska ei ole näyttöä EDTA-PTCP:stä.
Kun potilaan PLT-arvo on matala, eikä hänellä ole todettu mitään hematologista sairautta, suvussa esiintyvää sairautta ja/tai verenvuototaipumusta, ja esianalyyttiset virheet on suljettu pois, PTCP:tä olisi harkittava. Tämä ei tarkoita, että PTCP:tä sairastavan potilaan verihiutaleiden määrä olisi normaali sen jälkeen, kun paakkuuntuminen on hävinnyt. Kuten edellä todettiin, monilla EDTA-PTCP:tä sairastavilla potilailla on hematologisia tai muita häiriöitä, ja he voivat olla todella trombosytopeenisia. Näiden potilaiden hyytymisen ratkaiseminen antaa meille mahdollisuuden antaa palveluntarjoajalle tarkan verihiutalemäärän, mikä on erittäin tärkeää trombosytopeenisille potilaille.
Alla olevassa vuokaaviossa (kuva 4) esitetään joitakin asioita, jotka on otettava huomioon verihiutaleiden hyytymistä käsiteltäessä. Tavoitteenamme on ratkaista hyytyminen, jotta voimme ilmoittaa oikean verihiutalemäärän ajoissa. Laboratoriossa, jossa työskentelen, olen validoinut Na-sitraattiputkia, mutta näyttäisi siltä, että ne ratkaisevat paakkuuntumisen alle 50 prosentilla potilaista. Viimeisenä keinona tarkan verihiutalemäärän saamiseksi joissakin artikkeleissa on ehdotettu sormenpäästä otettavaksi verihiutaleet ja manuaalista laskentaa. Lisäsin tämän taulukkoon vaihtoehtona moniantikoagulanttisen PTCP:n yhteydessä, mutta patologimme ovat kuitenkin päättäneet, että emme laske verihiutaleita manuaalisesti, koska verihiutaleita on vaikea kerätä näytteestä ja koska laskenta on subjektiivista ja koska tarvittaviin laskutoimituksiin liittyy ongelmia. Tästä syystä olen tällä hetkellä mukana verihiutaleiden hyytymisen seurannassa ja aion tehdä pienen sisäisen tutkimuksen, jossa vertaillaan rinnakkainACD-, CTAD- ja Na-sitraattiputkia. Tuloksista riippuen voimme testata myös amikasiinia. Jos päädymme valistuneisiin johtopäätöksiin, kirjoitan toisen lyhyen blogin tuloksistamme!
Kiitokset vielä kerran Abu Jad Caesarille, Medicare Laboratories – Tulkarmin toimipisteen laboratoriopäällikölle Palestiinassa, joka toimitti minulle tämän oppikirjamaisen täydellisen PCTP-tapauksen, joka oli helppo ratkaista keräämällä Na-sitraattiin. Toivomme, että he kaikki lukisivat oppikirjoja ja olisivat yhtä yhteistyöhaluisia!
- CAPToday, January 2014. accessed online http://www.captodayonline/qa-column-0114
- ManthorpeR, Kofod B, et al. Pseudothrombocytopenia, In vitro studies on the underlyingmechanisms. Scand J Haematol 1981; 26:385-92
- NakashimaMO, Kottke-Marchant K. Platelet Testing: In: Kottke-Marhchant K, toim. AnAlgorithmic Approach to Hemostasis Testing, 2. painos. CAP Press;2016:101
- Schuff-Werner,Peter, et al.Effective estimation of correct platelet counts in pseudothrombocytopenia usingan alternative anticoagulant based on magnesium salt. Brit J of Haematol Vol162, Issue 5. June 29, 2013
- Tan,Geok Chin et al. Pseudothrombocytopenia due to platelet clumping: A Case Reportand Brief Review of Literature. Case Reports in Hematology. Volume 2016
- Lixia Zhang, MMed,* Jian Xu, MD,* LiGao, MMed, Shiyang Pan, MD, PhD. Spurious Thrombocytopenia in AutomatedPlatelet Count. Laboratoriolääketiede 49:2:130-133. 2018
- Zhou,Xiamian,et al. Amikasiinia voidaan lisätä vereen verihiutaleiden määrän laskun vähentämiseksi. AmJournal of Clinical pathology, Vol 136, Issue 4, Oct 2011.
-Becky Socha, MS, MLS(ASCP)CM BB CM valmistui Merrimack Collegesta N. Andoverissa, Massachusettsissa lääketieteen tekniikan kandidaatiksi ja suoritti kliinisen laboratoriotieteen maisterin tutkinnon Massachusettsin yliopistossa Lowellissa. Hän on työskennellyt lääketieteellisenä teknologina yli 30 vuotta. Hän on työskennellyt kaikilla kliinisen laboratorion aloilla, mutta on erityisen kiinnostunut hematologiasta ja veripankkitoiminnasta. Kun hän ei ole kiireinen hullun tiedemiehenä, hänet voi löytää ulkona pyöräilemästä.