Alkuperäiset ongelmatEdit
LämpökestävyysEdit
FLP-FRT-rekombinaasin alkuperäinen käyttö ei toiminut nisäkkäillä. FLP-proteiini oli termolabiili (denaturoituu korotetuissa lämpötiloissa), eikä se siksi ollut käyttökelpoinen nisäkäsmallissa näiden mallijärjestelmien kohonneiden ruumiinlämpötilojen vuoksi. Cre-Lox-rekombinaation käyttöä koskevien patenttien ja rajoitusten vuoksi oltiin kuitenkin hyvin kiinnostuneita tuottamaan lämpöstabiilisempi FLP-FRT-kasetti. Buchholz et al. (1997) saivat joitakin ensimmäisiä tuloksia käyttämällä syklistä mutageneesiä Escherichia coli -bakteerissa. Heidän tutkimuksessaan kirjoittajat transfektoivat E. coli -soluja kahdella plasmidilla: toinen koodasi satunnaisesti mutatoituja FLP-proteiineja arabinoosipromoottorin jälkeen ja toinen sisälsi lacZ-geenipromoottorin FRT-kasetin sisällä. E. coli -bakteereja kasvatettiin arabinoosilevyillä 37 °C:ssa ja 40 °C:ssa, ja jos rekombinaatiota tapahtui, lacZ-geenin ilmentyminen heikkeni ja pesäkkeet näyttivät valkoisilta. Jokaisesta sukupolvesta valittiin valkoiset pesäkkeet, joita kasvatettiin uusilla arabinoosilevyillä samoissa lämpötiloissa kahdeksan sukupolven ajan. Kun rekombinaatio oli varmistettu western-blottingilla ja mutatoituneet FLP-geenit oli sekvensoitu, tämä kahdeksannen sukupolven FLP-proteiini (FLPe) transfektoitiin nisäkässoluviljelmiin, ja rekombinaatio nisäkässoluissa varmistettiin. Tässä FLP:n muunnoksessa on vain 4 aminohapposubstituutiota: P2S, L33S, Y108N ja S294P.
Geneettisen mosaiikin tuottaminen Muokkaa
Geneettistä mosaiikkia esiintyy organismin sisällä, kun samankaltaiset solutyypit ilmentävät erilaisia fenotyyppejä, jotka johtuvat erilaisista genotyypeistä tietyissä lokuksissa. Yksinkertaisesti sanottuna tämä tapahtuu, kun yksi organismi sisältää erilaisia genotyyppejä, mikä on yleensä harvinaista luonnossa. Tämä voidaan kuitenkin helposti (ja ongelmallisesti) tuottaa FLP-FRT-rekombinaation avulla. Jos solussa on kaksi erilaista FRT-kohtaa ja FLP:tä on sopivina pitoisuuksina, FRT-kasetti leikkautuu edelleen ja asettuu kahden FRT-kohdan väliin. Tämä prosessi jatkuu, kunnes FLP-proteiinien pitoisuudet laskevat alle vaadittujen pitoisuuksien, mikä johtaa siihen, että organismin soluilla on eri genotyypit. Tätä on nähty hedelmäkärpäsistä hiiriin, ja se ei tee eroa tiettyihin kromosomeihin (somaattisiin ja sukupuolisiin) tai solutyyppeihin (somaattisiin ja sukusoluihin).
Solulinjojen määrittäminenTiedosto
Ennen Dymeckin ym. julkaisua (1998) Cre-rekombinaasia käytettiin hiirten neuronaalisten kantasolujen soluaseman kartoitukseen En2-promoottoria käyttäen. Näin ollen Dymeckin ja muiden (1998) kirjoittajat arvelivat, että FLP-rekombinaasia voitaisiin käyttää vastaavalla tavalla ja samalla tehokkuudella kuin Cre-rekombinaasia hiirissä. Kirjoittajat loivat kaksi siirtogeenistä hiirilinjaa: neuronaalisen Wnt1::Flp-fuusiolinjan ja linjan, jossa oli tm1Cwr:n 18. eksonia reunustava FRT-kasetti. Kirjoittajat valitsivat tämän eksonin poistettavaksi, koska jos se poistetaan, se johtaa nollafenotyyppiin. Kirjoittajat parittivat nämä kaksi linjaa ja antoivat jälkeläisten saavuttaa täysi-ikäisyyden ennen kuin jälkeläiset uhrattiin. RNA:ta uutettiin hermo-, lihas-, suolisto- ja häntäkudoksesta. Käänteistranskriptio-PCR ja northern blotting vahvistivat tm1Cwr:n 18. eksonin erkaantumisen runsaasti aivokudoksessa ja kohtalaisesti lihaskudoksessa (johtuen lihaksen sisällä olevista Scwhann-soluista). Odotetusti excisionia ei havaittu muissa kudoksissa. Kirjoittajat näkivät FLP-rekombinaasin olevan yhtä tehokas, ellei jopa parempi, solun kohtalon määrityksessä kuin Cre-rekombinaasin.
Drosophila melanogasterissa (hedelmäkärpäsessä)Edit
Flp-rekombinaasia on tähän mennessä hyödynnetty useita kertoja D. melanogasterissa. Flp-rekombinaasin vertailun Cre-rekombinaasiin D. melanogasterissa julkaisivat Frickenhaus ym. (2015). Frickenhausin ym. (2015) kirjoittajilla oli kaksi tavoitetta: luonnehtia ja verrata Flp-rekombinaasin ”knock-outin” tehokkuutta Cre-rekombinaasin ”knock-outiin” ja RNAi knockdowniin sekä paljastaa cabezan (caz), kärpäsen FUS:n ortologin, toiminta D. melanogasterin hermosoluissa ja lihaskudoksessa. FUS on vahvasti mukana amyotrofisessa lateraaliskleroosissa (ALS) ja frontotemporaalisessa dementiassa ihmisillä . Kirjoittajat käyttivät elav-Gal4/UAS-Flp- tai Cre-järjestelmää ilmentääkseen rekombinaasia erityisesti neuroneissa ja Mef2-Gal4/UAS-Flp- tai Cre-järjestelmää ilmentääkseen sitä erityisesti lihaksissa. Kirjoittajat päättelevät, että Flp-rekombinaasin ”knock-out”-työkalu on tehokkaampi kuin sekä RNAi- että Cre-rekombinaasi, kun halutaan tyrmätä tietyt geenit tietyissä kudoksissa tai solulinjoissa, koska sekä Cre-proteiinissa että RNAi-transkriptiossa ei ole havaittavissa vuotavaa ilmentymistä. Lisäksi kirjoittajat havaitsivat Cre-proteiinille toksisuutta, jota ei ole havaittu Flp-proteiinilla.
Danio rerio (seeprakala)Edit
Wong ym. (2009) arvioivat FLPe-rekombinaasijärjestelmän tehokkuutta seeprakalassa. Alkioihin, jotka olivat hemizygootteja FRT:n reunustamalle tehostetulle vihreälle fluoresoivalle proteiinille (EGFP) lihasspesifisen promoottorin alapuolella, injektoitiin FLPe-proteiinia. Ilman FLPe:tä näiden alkioiden pitäisi ilmentää EGFP:tä kaikessa lihaskudoksessa, ja jos ne risteytetään villityypin säikeen kanssa, 50 %:n tuloksena syntyneistä jälkeläisistä pitäisi myös ilmentää EGFP:tä lihaskudoksessa. FLPe:tä ruiskutetuilla alkioilla EGFP:n ilmentyminen lihaskudoksessa väheni merkittävästi, ja myös mosaiikkisuutta havaittiin. Kun nämä alkiot saavuttivat aikuisuuden, ne paritettiin villin tyypin kannan kanssa, ja tuloksena syntyneissä poikueissa oli huomattavasti vähemmän jälkeläisiä, jotka ilmaisivat EGFP:tä lihaskudoksessa (0-4 %). Nämä tulokset osoittavat, että FLPe on erittäin tehokas somaattisissa soluissa, mutta myös seeprakalojen sukusoluissa,
KasveissaEdit
”Fytosensoreiden” tai ”vartijoiden” luominen Arabidopsis thalianassa ja TupakassaEdit
Fytosensorit ovat geneettisesti muunneltuja kasveja, jotka pystyvät ilmoittamaan bioottisten tai abioottisten epäpuhtauksien esiintymisestä. On selvää, että näiden muunnettujen kasvien tuottaminen on erittäin lupaavaa maataloudessa ja laboratorioissa. Sopivan raportointivektorin luominen on kuitenkin osoittautunut ongelmalliseksi. cis-säätelevillä elementeillä on suuri merkitys kasvien geenien transkriptionaalisessa aktivoinnissa, eikä monia niistä tunneta hyvin. Monet kasvianturit joko aliekspressoivat raportointigeenejään tai antavat vääriä positiivisia tuloksia synteettisten promoottoreiden vuoksi. Kirjoittajat Rao et al. (2010) käyttivät FLP-rekombinaasityökalua erittäin tehokkaan fytosensorin tuottamiseen. Kirjoittajat käyttivät lämpösokkipromoottoria FLP:n tuotannon indusoimiseksi, kun taas FRT-siivellä varustettu vektori erotti CaMV 35S -promoottorin beta-glukuronidaasigeenistä (GUS). Kun kasvit altistettiin lämpöshokille, FLP:n indusointi johti FRT:n reunustaman vektorin irtoamiseen, jolloin GUS-geeni siirtyi tehokkaasti suoraan CaMV 35S -promoottorin alavirtaan. GUS:n aktivoituminen johti siihen, että kasvien lehdet muuttuivat vihreästä siniseksi; näin fytosensori ilmoitti tehokkaasti stressistä mallijärjestelmään!
Cre-rekombinaasillaEdit
Gate-way-ready indusoituvan MiRNA:n (GRIM) ilmentämisjärjestelmän tuottaminenEdit
RNA-interferenssi (RNAi) on aiheuttanut paradigmanvaihdoksen geenien ilmentämisessä ja potentiaalisissa geenien tyrmäämisissä Eukaryooteissa. Ennen GRIM-ekspressiojärjestelmän valmistamista RNAi-vektoreiden luominen oli kallista ja aikaa vievää. Vektorit tuotettiin perinteisellä copy-and-paste-molekyylikloonausmenetelmällä. Garwick-Coppens et al. (2011) kehittivät paljon tehokkaamman menetelmän RNAi-vektoreiden tuottamiseen, jossa RNAi:n ilmentyminen voidaan tyrmätä Cre-rekombinaasin avulla ja tyrmätä Flp-rekombinaasin avulla. Uudenlainen GRIM-ekspressiojärjestelmä mahdollistaa keinotekoisia RNAi-konstruktioita sisältävien ekspressiovektorien paljon nopeamman tuottamisen. Kirjoittajat osoittivat edelleen, että heidän ekspressiojärjestelmänsä toimii varsin tehokkaasti ihmisen alkion munuaissoluissa (HEK), joka on molekyylitutkimuksessa yleinen ihmisen kuolematon solulinja.