FFPE-näytteet – Ihmiskudosnäytteiden valmistelu – Lab-Ally

Sisällysluettelo

Esittely |Kudosten hankinta |FFPE-kudosten käsittely |Poikkileikkaus |Viitteet

Jos tarvitset FFPE-näytteitä tai muita ihmisperäisiä kudosnäytteitä tutkimustasi varten, ota yhteyttä.

Introduction

Monet nykypäivän tutkijat käyttävät mieluiten FFPE-kudosnäytteitä IHC-, histologisiin tai in-situ-genomianalyyseihinsa. FFPE tulee sanoista ”Formalin-Fixed Paraffin-Embedded” ja kuvaa tämän kudossäilytysmenetelmän kahta keskeistä ominaisuutta. Formaliini on formaldehydiliuos, ja sitä on käytetty siitä lähtien, kun saksalainen lääkäri Ferdinand Blum 1800-luvun lopulla havaitsi formaldehydin säilöntävaikutukset (Fox, et al., 1985). Kudokseen infusoidaan parafiinia formaldehydillä tapahtuvan fiksaation jälkeen, ja kudosta ympäröi myös parafiinikotelo, joka auttaa tukemaan kudosta ja suojaamaan sitä hapettumiselta. Ammattimaisesti kiinnitetyt ja upotetut FFPE-näytteet ja niiden sisältämät biomolekyylit ovat kohtuullisen vakaita huoneenlämmössä. Rakenteeltaan kiinnitetyt ja upotetut kudokset ovat kestäviä, ja niitä voidaan käyttää mikroskooppisiin anatomiatutkimuksiin lähes loputtomiin, mutta ajan mittaan joidenkin proteiinien antigeenisyys heikkenee, mikä rajoittaa IHC-tutkimukset enintään muutaman vuosikymmenen ikäisiin näytteisiin. Kaksisäikeinen DNA on yllättävän stabiili FFPE-lohkoissa, mutta muut vähemmän stabiilit biomolekyylit, kuten RNA, voivat hajota vuosikymmenessä tai lyhyemmässäkin ajassa, varsinkin kun leikkeet on leikattu.

Arkistot, joihin on kertynyt suuria määriä FFPE-näytteitä, ovat erityisen rikkaita tietolähteitä silloin, kun monien tapausten vertailu (eli FFPE-näytteet useilta eri näytteen antajilta) on toivottavaa, jotta voidaan tehdä tilastollisesti luotettavia johtopäätöksiä yksittäisten indikaatioiden ominaisuuksista. Jos FFPE-näytteitä aiotaan käyttää ”korkean panoksen” biolääketieteellisessä tutkimuksessa, on tärkeää, että kaikki valmisteluprosessin vaiheet suorittavat täysin koulutetut ja sertifioidut ammattilaiset, mieluiten CLIA-sertifioidussa (eli valtion tarkastamassa) tai CAP-akkreditoidussa (College of American Pathologists) laboratoriossa.

On huomattava, että FFPE-prosessi ei ole yleisesti standardoitu, ja laitokset eri puolilla maailmaa saattavat käyttää hieman erilaisia protokollia erilaisilla formaliiniliuoksilla tai muulla tavoin räätälöidä prosessin mieltymystensä ja vaatimustensa mukaiseksi. Seuraavassa esitetään yleiskatsaus prosessiin ja kuvaukset siitä, mitä kukin vaihe sisältää, sekä joitakin yleisiä variaatioita.

Kudosten hankinta

Kudosten käsittelyä edeltää kudosten hankinnan välttämätön vaihe. Tämä on itse asiassa vaikein osa-alue valvoa, koska se kietoutuu yhteen potilaan hoidon, 41CFR46-vaatimusten noudattamisen ja Yhdysvalloissa sisäisen arviointilautakunnan (IRB) valvonnan kanssa. Lääketieteellisen toimenpiteen erityispiirteet ja tavanomaisen hoidon käytännöt ovat tärkeitä, koska ne voivat vaikuttaa muuttujiin, kuten anestesian antamisen ja verisuonten ligoimisen välisiin aikaväleihin, kudoksen poistamiseen ja ennen fiksaatiota kuluneeseen aikaan, jotka kaikki voivat vaikuttaa näytteen laatuun. Esimerkiksi RNA:ssa ja proteiineissa tapahtuu todennäköisesti muutoksia verenkierron katkaisun ja kudoksen poiston välisen ajanjakson aikana, jota kutsutaan lämpimäksi iskemia-ajaksi (Dash ym., 2002). Tämä iskemia-aika voi vaihdella minuuteista tunteihin riippuen elimestä, laitoksen vakiotoimintamenettelyistä, kirurgista ja muusta hoitohenkilökunnasta sekä kirurgisesta lähestymistavasta. Tästä syystä on suositeltu, että tämä aika kirjataan jokaisesta näytteestä ja että se pidetään mahdollisimman lyhyenä (Hewitt, ym., 2008).

FFPE-kudosten käsittely

Kudosnäytteen hankkimisen jälkeen saatetaan tarvita ylimääräistä triagea, leikkelyä tai mikrodissektiota (yhteisnimityksellä grossing), jotta voidaan eristää ja valmistella tietty kudososuus, joka kulkee jäljelle jäävien käsittelyvaiheiden läpi. Kudosten käsittely on nykyään usein täysin automatisoitu viimeiseen vaiheeseen, upottamiseen asti, joka voidaan suorittaa manuaalisesti. Saatavilla on monia kudosprosessoreita, mutta kaikki noudattavat edellä esitettyä neljän ensimmäisen vaiheen järjestystä. Eri vaiheiden automatisointi auttaa eliminoimaan menettelyssä esiintyvät vaihtelut, jotka voivat aiheuttaa vaihtelua eri FFPE-näytteiden kokeellisten tulosten välillä.

Fiksaatio

Fiksaatio on FFPE-kudosten käsittelyn ensimmäinen vaihe. Kriittisiä huomioon otettavia tekijöitä ovat käytettävä liuos, fiksaation kesto sekä fiksoitavan kudosnäytteen paksuus ja histologiset ominaisuudet.

– Liuos

Fiksaatioaine, jota useimmat laboratoriot käyttävät, on neutraalipuskuroitu 10 %:n formaliini. Formaliini on neste, joka on 37-40 % formaldehydiä ja 10 % metanolia (painosta) vedessä; 10 %:n formaliiniliuos sisältää siis noin 3,7 – 4 % formaldehydiä ja 1 % metanolia (Hewitt, et al., 2008; Kiernan, 2000). Todellisuudessa formaldehydi esiintyy liuoksessa pääasiassa metyleeniglykolin monomeereinä tai pieninä polymeereinä (metaanidioli, formaldehydimonohydraatti), joka muodostuu formaldehydin reversiibelistä reaktiosta veden kanssa. Suuripainoisia metyleeniglykolipolymeerejä kutsutaan paraformaldehydiksi, ja ne saostuvat liuoksesta, mutta metanoli hidastaa tätä polymerisaatioprosessia, minkä vuoksi se sisältyy formaliiniliuoksiin. Vedellä laimennettu formaliini (esimerkiksi 10-prosenttinen formaliini) – varsinkin jos se on puskuriliuos – sisältää pääasiassa monomeerejä, koska suuri määrä vesimolekyylejä hajottaa mahdolliset metyleeniglykolipolymeerit, joita normaalisti olisi ollut korkeamman formaldehydipitoisuuden liuoksessa (Kiernan, 2000). Puskureita, jotka ovat formaliinin jäljellä oleva komponentti, lisätään myös siksi, että formaldehydillä on taipumus hapettua muurahaishapoksi (Fox ym., 1985). Muurahaishappo kudosten fiksaatiossa voi johtaa formaliinipigmenttirakeiden (happohematiini) saostumiseen, jotka voivat muistuttaa joidenkin loisten tuottamia pigmenttejä (Pizzolato, 1976). Formaliinin puskurointi estää tämän tapahtumisen. Yleisiä puskuriaineita ovat magnesiumkarbonaatti-, kalsiumkarbonaatti-, sitraatti-, tris- ja fosfaattipuskurit (Hewitt, et. al., 2008). Kaupallinen formaliini sisältää usein fosfaattipuskureita. ”Neutraalipuskuroitu”, mikä on tyypillisesti formaliinin valmistustapa, tarkoittaa yksinkertaisesti sitä, että pH pidetään noin 7:ssä.

– Prosessi ja mekanismi

Formaalihydin ja metyleeniglykolin alhaisen molekyylipainon vuoksi formaliini (ensisijaisesti liuoksessa oleva metyleeniglykoli) tunkeutuu kudoksiin suhteellisen nopeasti, kudostyypistä riippuvalla nopeudella, mutta keskimäärin nopeudella, joka on noin 1 millimetri tunnissa (Hewitt, ym., 2008). Kiinnittämisprotokollat vaihtelevat siis sen mukaan, minkä tyyppinen kudos on tarkoitus kiinnittää. Kudoksen sisään päästyään liuoksessa olevat formaldehydimolekyylit alkavat ristikytkeytyä proteiinien kanssa, mutta tämä tapahtuu paljon hitaammin kuin diffuusionopeus. Formaldehydin reaktio kudoksen kanssa vetää formaldehydiä ulos liuoksesta ja vetää käänteistä formaldehydistä metyleeniglykoliksi tapahtuvaa reaktiota takaisin formaldehydin suuntaan niin, että formaldehydiä syntyy enemmän, vaikka sitä kulutetaankin (Fox ym., 1985). Lysiini-aminosivuketjut ovat kaikkein reaktiivisimpia formaldehydin kanssa, mutta muita formaldehydin kanssa jonkin verran reagoivia ovat arginiini, asparagiini, histidiini, glutamiini, seriini ja tyrosiini (Howat ja Wilson, 2014). Reaktion jälkeen kompleksiin kiinnittynyt syntynyt hydroksimetyyliryhmä voi edelleen reagoida saman proteiinin tai muiden proteiinien kanssa, jolloin muodostuu stabiileja metyleenisiltoja (proteiini-CH2-proteiini) (Kiernan, 2000). Juuri tämä saa aikaan liukenemattomuuden ja jäykkyyden kudoksissa, jotka on formaliinilla fiksoitu ja siten säilötty. Tarvitaan noin 24-48 tuntia, jotta tämä ristisilloittuminen tapahtuisi riittävästi koko kudoksessa (Thavarajah, et al., 2012), mutta on suositeltu, että tälle prosessille annettaisiin aikaa enintään 36 tuntia, sillä pidempi fiksaatio heikentää FFPE-näytteissä olevien biomolekyylien laatua, esimerkiksi lyhentämällä uutettavien nukleiinihappojen pituutta (Hewitt, et al, 2008).

– Rajoitukset

Formaldehydin – erityisesti neutraalipuskuroituna, 10-prosenttisena formaliinina – käytön suurin hyöty on se, että se säilyttää monenlaisia kudoksia ja komponentteja. Sillä on kuitenkin rajoituksia. Esimerkiksi elektronimikroskopiassa käytetään yleensä formaldehydin ja glutaraldehydin (C5H8O2) yhdistelmää tai pelkkää glutaraldehydiliuosta (Kiernan, 2000), koska nämä liuokset ovat parempia kudosrakenteiden säilyttämiseen tätä tarkoitusta varten. On huomattava, että glutaraldehydi- tai glutaraldehydi-aldehydiliuoksella valmistettuja kudoksia ei pidetä FFPE-näytteinä. Toinen haaste on DNA- ja RNA-molekyylien talteenotto FFPE-kudoksesta, sillä formaliinilla on taipumus muuttaa nukleiinihappoja – jopa niin pitkälle, että DNA:han syntyy keinotekoisia mutaatioita – ja hajottaa ne pieniksi fragmenteiksi (Srinivasan, Sedmak ja Jewell, 2002). FFPE-kudoksesta on kuitenkin mahdollista saada analyysiin soveltuvia DNA- ja RNA-fragmentteja, kuten Tangin ym. (2009) kirjoittamassa protokollassa kuvataan, ja nukleiinihappojen talteenoton avaintekijä on asianmukainen proteaasien pilkkominen. Saatavilla on myös kaupallisia sarjoja nukleiinihappojen uuttamiseksi FFPE-näytteistä.

– Näytteen paksuus

Yksi toinen tärkeä seikka, joka on otettava huomioon formaliinifiksaation yhteydessä, on kudosnäytteen paksuus. Vaikka formaliini läpäisee kudoksen suhteellisen nopeasti, kuten edellä mainittiin, kudoksen paksuus vaikuttaa kiinnitetyn näytteen laatuun. Formaliinin pääsy paksumpien kudosnäytteiden keskelle kestää kauemmin. Samalla kun formaliini diffundoituu vähitellen näytteen sisimpään osaan, ulommilla alueilla kiinnittymisprosessi on jo alkanut, joten siellä olevat biomolekyylit hajoavat todennäköisemmin täydelliseen kiinnittymiseen tarvittavan pitkän ajan kuluessa. Jos lisäksi noudatetaan aikarajoja (kuten edellä mainittua enintään 36 tuntia), on mahdollista, että kudosnäytettä ei kiinnitetä (säilytetä) riittävästi kokonaisuudessaan. Tästä syystä fiksoitavat kudokset, jotka ovat leveydeltään suurempia kuin muutama millimetri tai ehkä yksi tai kaksi senttimetriä, olisi parempi leikata ohuempiin osiin optimaalisen fiksaation varmistamiseksi (Hewitt, et al., 2008). Laitoksilla voi olla erilaisia protokollia eri leveydeltään erilaisten kudosnäytteiden tarvitseman fiksatiivin keston ja määrän suhteen, mutta yleisesti ottaen fiksatiivin määrän ja kudoksen määrän suhteen tulisi olla 10:1 (Klatt, 2016).

Dehydratointi

F FFPE-näytteiden käsittelyn toinen vaihe on dehydratointi. Koska parafiini on veden kanssa sekoittumaton, kaikki formaliiniliuoksen vesi on poistettava kudoksesta ennen kuin parafiini voi tunkeutua siihen. Käytetään useita alkoholiliuoksia (usein etanolia), jotka aloitetaan usein 70-prosenttisesta ja jatketaan 100-prosenttiseen alkoholiin, jotta kaikki vesi saadaan poistettua kudoksesta. Optimaalinen dehydraatio edellyttää uusien liuosten käyttöä tai käytettyjen liuosten vaihtamista usein, koska alkoholi laimenee käytön myötä. On myös ehdottoman tärkeää, että tämä vaihe suoritetaan kokonaan loppuun (ja siihen varataan riittävästi aikaa), koska riittämätön dehydraatio voi johtaa kudoksen hajoamiseen (Klatt, 2016; Hewitt, et al., 2008).

Puhdistaminen

Sen vuoksi, että parafiini ei itse asiassa myöskään ole sekoitettavissa alkoholeihin, seuraavassa vaiheessa alkoholi poistetaan aineella, joka on sekoitettavissa parafiinin kanssa. Tätä vaihetta kutsutaan clearingiksi, ja ksyleeni on useimmiten käytetty clearingaine (Klatt, 2016; Hewitt, ym., 2008).

Paraffiini-infiltraatio

Kunnollisen fiksaation, dehydraation ja clearingin jälkeen kudokselle voidaan lopuksi tehdä parafiini-infiltraatio (tai impregnointi). Tämäkään vaihe ei ole standardoitu, ja eri puolilla maailmaa toimivat laitokset saattavat käyttää erilaisia parafiineja ja koostumukseltaan erilaisia vahaseoksia. Parafiineilla on erilaiset sulamispisteet ja koostumukset, jotka vaikuttavat lopulliseen kudoslohkoon ja sen ominaisuuksiin. Yhdysvalloissa ja Länsi-Euroopassa käytetään yleensä synteettisiä parafiineja, joiden sulamispisteet ovat alhaiset (55 °C-63 °C), jotta saavutetaan parhaat tulokset. Lateksia, dimetyylisulfoksidia ja omia ”pehmittimiä” voidaan sisällyttää formulaatioon lopullisen kudosnäytteen tekstuurin ja muovautuvuuden muuttamiseksi (Hewitt, et al., 2008).

Muualla maailmassa käytetään usein mehiläisvahaa formulaatioihin muovautuvuuden parantamiseksi ja käytettävien heikkolaatuisten parafiinien sulamislämpötilan alentamiseksi. Mehiläisvaha sisältää kuitenkin epäpuhtauksia, kuten siitepölyä, ja se heikentää lopullisen näytteen laatua. Korkeampia sulamislämpötiloja on vältettävä, koska ne johtavat myöhemmin kudosnäytteen heikentyneeseen ja riittämättömään deparafinoitumiseen sekä kudoksesta talteen otettavien nukleiinihappojen määrän vähenemiseen (Hewitt, et al., 2008).

Paraffiiniin upottaminen

FFPE-näytteiden käsittelyn viimeinen vaihe on parafiiniin upottaminen. Parafiiniin upotettua kudosnäytettä ympäröi parafiinikerros. On huolehdittava siitä, että kudoslohko suunnataan oikein muotissa (”kasetissa”), koska tämä vaikuttaa leiketasoon, kun lohkosta leikataan mikrotomilla ohuita leikkeitä (Klatt, 2016). Kun parafiinikotelo on jähmettynyt, FFPE-blokki on valmis säilytettäväksi, ja se säilyy hyvin vuosikausia, jopa vuosikymmeniä (Hewitt, ym., 2008).

Leikkaaminen

Kudoksen ollessa upotettu, se on valmis leikattavaksi mikrotomilla. Koska kudos ei aina ole täysin tasainen parafiinin etupuolta vasten, histoteknikon on yleensä ”katsottava” lohkoon päin. Kudoslohko asetetaan mikrotomin lohkotelineeseen, ja samalla kun histoteknikko säätää lohkotelineen kulmaa niin, että kudosta menee hukkaan mahdollisimman vähän, hän kääntää käsipyörää, jolloin lohko liikkuu ylös ja alas terävää terää vasten. Lohkoa leikataan, kunnes kokonainen edustava osa kudoksesta on lohkon etupuolella. Kun kudos on vastakkain, lohko asetetaan jäähän jäähtymään, mikä helpottaa ohuiden leikkeiden leikkaamista; liian lämmin parafiini luo kokoonpuristunutta kudosta ja ryppyisiä leikkeitä. Kun lohko on jäähtynyt, se asetetaan takaisin lohkoteloon. Teknikko kääntää jälleen käsipyörää, tällä kertaa hitaasti ja tasaisesti, jotta saadaan aikaan peräkkäisiä ohuita leikkauksia, jotka tarttuvat toisiinsa ja muodostavat ”nauhan”.” Nauha asetetaan lämpimään vesihauteeseen (lämpötila pidetään hieman parafiinin sulamispisteen alapuolella), jotta muodostuneet rypyt saadaan tasoitettua. Tämän jälkeen teknikko asettaa mikroskooppilevyn vesihauteeseen ja ”kauhoo” valitun pätkän (pätkät) niin, että ne jäävät kiinni levyyn.

Kudosleikkeiden tavallisin paksuus on 3 – 5 mikrometriä (lyhyesti mikronia), mikä vastaa yhden solun paksuutta. Objektiolevyjä, joissa on 3-5 mikrometrin leikkeitä, käytetään tavallisesti värjäykseen, olipa se sitten tavanomainen hematoksyliini-& eosiini- (H&E) värjäys, erikoisvärjäys tai immunohistokemiallinen (IHC) värjäys. Tutkijat pyytävät usein ”kiharoita” ohuiden leikkeiden sijasta objektiolevyillä. Kiharat ovat paksumpia leikkauksia (10 mikronia tai enemmän), jotka laitetaan Eppendorf-putkiin, ja niitä käytetään yleensä silloin, kun FFPE-näytteistä on uutettava RNA:ta tai DNA:ta. Paksut leikkeet voidaan myös asettaa putkien sijasta objektiolevyihin; tämä on optimaalista silloin, kun vain osa kudoksesta käytetään uuttamiseen. Tällöin kudos raaputetaan pois objektilasilta ja laitetaan putkeen. Leikatut FFPE-näytteet ovat rakenteellisesti stabiileja, ja jos niitä käsitellään ja säilytetään asianmukaisesti, niitä voidaan käyttää mikroskooppisiin analyyseihin jonkin aikaa leikkelyn jälkeen, mutta jos kemiallisia uuttoja aiotaan tehdä, leikkeet on yleensä käytettävä mahdollisimman pian leikkaamisen jälkeen, jotta estetään altistuvien kohdemolekyylien hapettuminen ja biologinen hajoaminen.

Etsitkö tietoa tiettyjä indikaatioita edustavien FFPE-lohkojen histologiasta ja hankinnasta? Tutustu histologian resurssisivuumme. Lab-Ally on alan markkinajohtaja 45CFR46- ja 21CFR11-vaatimusten noudattamisen, eettisesti hankittujen ihmisbiopreparaattien, bioinformatiikan, tieteellisen tiedon hallinnan ja muun muassa.

1. Fox, C. H., Johnson, F. B., Whiting, J., & Roller, P. P. (1985). Formaldehydin kiinnittäminen. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry, 33(8), 845-853.
2. Dash, A., Maine, I. P., Varambally, S., Shen, R., Chinnaiyan, A. M., & Rubin, M. A. (2002). Muutokset differentiaalisessa geeniekspressiossa radikaalisten prostatektomianäytteiden lämpimän iskemia-ajan vuoksi. The American Journal of Pathology, 161(5), 1743-1748.
3. Hewitt, S. M., Lewis, F. A., Yanxiang, C., Conrad, R. C., Cronin, M., Danenberg, K. D., Goralski, T. J., Langmore, J. P., Raja, R. G., Williams, P. M., Palma, J. F., & Warrington, J. A. (2008). Kudosten käsittely ja näytteiden valmistelu kirurgisessa patologiassa: Nukleiinihappojen talteenottoa formaliiniin kiinnitetyistä, parafiiniin upotetuista kudoksista koskevat kysymykset (Issues Concerning the Recovery of Nucleic Acids From Formalin-Fixed, Paraffin-Embedded Tissue). Archives of Pathology & Laboratory Medicine, 132(12), 1929-1935.
4. Kiernan, J. A. (2000). Formaldehydi, formaliini, paraformaldehydi ja glutaraldehydi: Mitä ne ovat ja mitä ne tekevät. Microscopy Today, 00(1), 8-12. Haettu osoitteesta http://publish.uwo.ca/~jkiernan/formglut.htm.
5. Pizzolato, P. (1976). Formaliinipigmentti (happohematiini) ja siihen liittyvät pigmentit. American Journal of Medical Technology, 42(11), 436-440.
6. Howat, W. J., & Wilson, B. A. (2014). Kudosten fiksaatio ja molekulaaristen fiksatiivien vaikutus myöhempiin värjäysmenetelmiin. Methods, 70(1), 12-19.
7. Thavarajah, R., Mudimbaimannar, V. K., Elizabeth, J., Rao, U. K., & Ranganathan, K. (2012). Rutiininomaisen formaldehydikiinnityksen kemialliset ja fysikaaliset perusteet. Journal of Oral and Maxillofacial Pathology : JOMFP, 16(3), 400-405. http://doi.org/10.4103/0973-029X.102496
8. Srinivasan, M., Sedmak, D., & Jewell, S. (2002). Fixatiivien ja kudoskäsittelyn vaikutus nukleiinihappojen pitoisuuteen ja eheyteen. The American Journal of Pathology, 161(6), 1961-1971.
9. Tang, W., David, F. B., Wilson, M. M., Barwick, B. G., Leyland-Jones, B. R., & Bouzyk, M. M. (2009). DNA:n uuttaminen formaliiniin kiinnitetystä, parafiiniin sulautetusta kudoksesta. Cold Spring Harbor Protocols. http://doi.org/10.1101/pdb.prot5138
10. Klatt, E. C. Histotechniques: Tissue Processing. Mercer University School of Medicine, Savannah. Haettu osoitteesta http://library.med.utah.edu/WebPath/HISTHTML/HISTOTCH/HISTOTCH.html Accessed dec 28, 2016

.