Deoksinukleotiditrifosfaatit (dNTP:t) ovat nukleiinihappomolekyylien välttämättömiä rakennuspalikoita, ja siksi ne ovat välttämättömiä komponentteja PCR-sekoituksissa, sillä uutta (monistettua) DNA:ta ei synny ilman niitä. DNA-sekvenssin muodostavat neljä yksittäistä deoksinukleotidia (ts. deoksiadenosiinitrifosfaatti, dATP; deoksitymidiinitrifosfaatti, dTTP; deoksisytosiinitrifosfaatti, dCTP; ja deoksiguanosiinitrifosfaatti, dGTP) lisätään yleensä PCR- ja RT-PCR-sekoituksiin samanmoisina määrinä, mutta jos PCR:llä monistettava kohde-DNA-sekvenssi koostuu pääasiassa dATP/dTTP:stä (AT-suhde) tai pääasiassa dGTP/dCTP:stä (GC-suhde), PCR-sekoitukseen lisättävien dNTP:iden moolista suhdelukua voidaan muuttaa tämän epätasapainon huomioon ottamiseksi. dNTP:t ostetaan yleensä joko yksittäin tai (ekvimolaarisena) seoksena kaupallisilta toimittajilta (esim. Roche, Promega jne.), ja ne ovat kemiallisesti stabiileja, kun niitä säilytetään lievästi emäksisissä vesiliuoksissa -20 °C:ssa. On kuitenkin huomattava, että dNTP:t ovat luonnostaan happamia liuoksessa, joten työ- ja varastoliuokset on ehkä neutraloitava emäksisillä yhdisteillä ennen pitkäaikaista varastointia. Neutraloidut dNTP-liuokset säädetään tavallisesti 10 mM:n kantaliuoksiksi spektrofotometrialla tai lisäämällä oikea määrä steriiliä vettä lyofilisoituun tuotteeseen suoraan sen kemiallisen synteesin jälkeen. Joissakin PCR:issä voi olla hyötyä erittäin puhdistettujen ”PCR-grade” dNTP:iden (Roche) käytöstä, jotka sisältävät alle 0,9 % deoksinukleotidifosfaatteja (dNDP), ovat >99 % puhtaita ja vapaita epäpuhtauksista, kuten modifioiduista nukleotideista ja tetrapyrofosfaatista. Nämä (kalliimmat) erittäin puhtaat dNTP:t voivat auttaa PCR-DNA:n monistamisessa valmisteista, jotka sisältävät hyvin pieniä kohde-DNA:n kopiolukuja.
Joissain PCR-sovelluksissa ja -protokollissa yksi neljästä dNTP:stä voidaan korvata analogisella dNTP:llä, esim. inosiinilla, 7-deatsa-2′ -deoksiguanosiinilla, tai modifioidulla dNTP:llä, esim. biotiinilla, fluorofoorilla tai radioaktiivisesti leimatulla dNTP:llä. Tällaiset modifikaatiot mahdollistavat PCR:n jälkeisten jatkokäsittelysovellusten suorittamisen.