Citrobacter BSI -isolaattien keruu
Vertailtuna muihin Gram-negatiivisiin lajeihin, jotka aiheuttavat säännöllisesti BSI-infektioita, C. freundii -bakteerin fysiologiasta isäntäympäristössä on saatavilla vain vähän tietoa. Tämän puutteen korjaamiseksi keräsimme ensin kahdeksan C. freundii -kompleksiin kuuluvaa isolaattia potilailta, joilla oli BSI Michiganin yliopiston terveydenhuoltojärjestelmässä. Ribosomaaliseen RNA:han perustuvalla fylogenialla voidaan erottaa kolme Citrobacter-lajiryhmää, joista ryhmä I käsittää vähintään kahdeksan lajia ja sisältää C. freundii:n23,24. 16S-rRNA-sekvenssiin ja massaspektrometriaan perustuvat tunnistustavat tarjoavat kuitenkin vain rajallisen fylogeneettisen resoluution tämän Citrobacter-lajiryhmän sisällä. Tämän vuoksi tässä tutkimuksessa käytetyt isolaatit arvioitiin tarkemmin käyttämällä monilokus-sekvenssianalyysimenetelmää. Kahdeksasta kerätystä isolaatista kuusi klusteroitui läheisesti vakiintuneiden C. freundii -kantojen kanssa (kuva 1), ja niiden keskimääräinen nukleotidi-identiteetti oli >98 prosenttia ATCC 8090 -tyyppikannan kanssa, mikä ylittää tyypillisesti hyväksytyn 95 prosentin raja-arvon saman lajin isolaateille. Kahdesta jäljelle jääneestä isolaatista UMH17 klusteroitui läheisimmin Citrobacter pasteurii -tyyppikannan CIP 55.13 kanssa ja UMH18 Citrobacter werkmanii -kantojen kanssa.
Tässä tutkimuksessa kerättyjen kantojen fylogeneettinen jakautuminen. Maximum-likelihood-puu luotiin ketjutettujen fusA-, leuS-, rpoB- ja pyrG-alleelien nukleotidisekvensseistä. Tyyppikannoista saadut tiedot otettiin mukaan, jos niitä oli saatavilla, ja tässä tutkimuksessa kerätyt kannat (UMH13-19 ja HM38) on merkitty punaisella fontilla. Puu juurrutettiin manuaalisesti C. koserii -lajin ja kahdeksan C. freundii -kompleksiin kuuluvan lajin väliseen solmuun. Mittakaavapalkki kuvaa nukleotidisubstituutioita paikkaa kohti.
C. freundii -bakteeremia
Ennen Citrobacterin kuntovaatimusten tutkimista BSI:n aikana kehitettiin hiirimäinen bakteerimalli perustuen aiempaan työhön, joka oli tehty muiden suolistoperäisten lajien kanssa25. Citrobacter BSI -isolaateista valittiin tässä tutkimuksessa käytettäviksi ehdokkaiksi kannat UMH14 ja UMH15. Isolaatti UMH14 osoitti johdonmukaisempaa annosriippuvaista pernan ja maksan kolonisaatiota 24 tunnin kuluttua häntälaskimoinjektiosta (kuva S1), ja se valittiin tarkempaan karakterisointiin. Oli myös tarpeen testata infektiomalli mahdollisten kolonisaation pullonkaulojen varalta ennen kuin arvioitiin yksittäisten C. freundii -geenien osuutta kuntoon käyttämällä suurta transposonimutaatiokokoelmaa. Eristettiin UMH14:n spontaani nalidiksiinihappoa kestävä mutantti (UMH14Nal), jolla todettiin olevan vastaava in vitro -kunto rinnakkaisviljelyssä kantakannan kanssa rikkaassa väliaineessa (kuva S2). Sen määrittämiseksi, voisiko verenkiertoon vakiintua monimuotoinen mutanttiväestö ilman yksittäisten kloonien stokastista häviämistä, UMH14Nal- ja UMH14-kannat sekoitettiin eri suhteissa ja inokuloitiin hiiriin. Vuorokauden kuluttua jopa suhteet 1:10 000 (UMH14Nal:UMH14) siedettiin ilman, että aliedustettu kanta hävisi spontaanisti pernassa (kuva S2), mikä osoittaa, että yhteen hiireen mahtuu vähintään 10 000 yksilöllistä transposonimutanttia 5 × 107 bakteerin kokonaisannoksella tätä mallia käyttäen.
Citrobacter-kuntoisuusgeenien tunnistamiseksi bakteerimallissa hiiriin ruiskutettiin viisi poolia satunnaisia transposoni-insertiomutantteja, jotka edustivat >44 000:ta yksilöllistä insertiokohtaa, ja pernaa kolonisoivia bakteereja kerättiin talteen 24 tunnin kuluttua (kuva S3). Yksittäisten transposonimutaatioiden suhteellista runsautta inokulaatiossa ja pernan ulostuloissa, jotka määritettiin korkean läpimenon sekvensoinnilla, käytettiin sellaisten geenien tunnistamiseen, jotka edistävät bakteerien selviytymistä mallissa. Yhteensä 177 transposonin vaurioittamaa geeniä aiheutti merkittävää kelpoisuuden menetystä, ja yhdeksän geeniä liittyi mutaation yhteydessä bakteerien kelpoisuuden lisääntymiseen (fold-change ≥2.0, Adj. P < 0.05) (Data S1). Toisessa analyysissä tällä aineistolla tunnistettiin 546 kromosomaalisesti koodattua oletettua olennaista geeniä, joiden osalta lukujen määrä tulopopulaatiossa oli merkittävästi pienempi kuin käytettävissä olevien TA-kohtien ja kirjastopopulaation koon perusteella odotettiin (logFC <-5,17) (Data S2). Käyttämällä tätä opportunistisen ja systeemisen infektion mallia odotettiin, että suurin osa tunnistetuista kuntotekijöistä edustaisi pikemminkin fysiologisia ydinprosesseja kuin prototyyppisiä virulenssitekijöitä (esim. proteiinimyrkkyjä tai adhebiineja). Merkittäviin kuntovirheisiin liittyvien 177 geenin luokittelu ortologisten ryhmien klustereihin (Clusters of Orthologous Groups, COG) osoitti, että C. freundii -bakteremian aikana tarvittavat aineenvaihduntareitit ja solujen ylläpitotoiminnot olivat vallitsevia (kuva 2). Noin puolet tunnistetuista fitness-geeneistä sopi karkeasti viiteen COG-luokkaan, jotka kattavat energiantuotannon, aminohappometabolian, DNA:n replikaation ja korjauksen, translaation sekä soluseinän ja kalvojen biogeneesin.
C. freundii -kuntotekijöiden jakautuminen COG-luokittelun mukaan. Merkitsevyyskriteerit täyttävien bakteerikuntotekijöiden aminohapposekvenssit analysoitiin COG-jakauman osalta. COG-luokat, joita ei ole esitetty, eivät sisältäneet edustavia proteiineja 177 kuntotekijän joukossa. Kaksikymmentäkaksi kuntotekijää ei luokiteltu tällä menetelmällä.
Yksittäisten kuntogeenimutaatioiden validointi
Yksittäisten geenituotteiden kontribuutio C. freundii -kuntotuotteisiin vahvistettiin valituissa UMH14-geeneissä konstruoiduilla itsenäisillä deletioinsertion-mutaatioilla (taulukko 1). Kaikissa tässä raportoiduissa konstruoiduissa kannoissa ei ollut karkeaa replikaatiovirhettä, joka määritettiin kasvattamalla niitä rikkaassa väliaineessa (kuva S4). Kunkin taulukossa 1 luetellun geenin kunto mitattiin infektoimalla yksittäisiä mutantteja UMH14-alkukannan kanssa. Viidellä seitsemästä alun perin testatusta mutantista oli tilastollisesti merkitsevä kilpailuhaitta joko pernassa tai maksassa (kuva 3A), mikä vahvisti transposoniseulan tulokset. ZnuB-mutantti valittiin negatiiviseksi kontrolliksi validointia varten, koska transposoniseulan tulokset osoittivat, että tähän geeniin ei liittynyt kuntovirhettä huolimatta muista bakteerilajeista saadusta todistusaineistosta, joka osoittaa ZnuABC-sinkinkinkuljetusjärjestelmän osuuden hiiri-infektiossa26,27,28. UMH14:n kanssa kilpailtaessa znuB-mutantilla ei havaittu merkittävää kuntovirhettä, mikä vastaa odotettuja tuloksia. UMH14:n viereiset znuA- (fold-change = 1,5, Adj. P = 0,527) ja znuC-geenit (fold-change = 2,0, Adj. P = 0,035) eivät myöskään aiheuttaneet kuntovirhettä tai niiden kuntovirhe oli minimaalinen, kun ne mutatoitiin transposoni-insertiolla (Data S1).
Kilpailutilainfektiot valituilla C. freundii -mutanteilla. (A) C. freundii UMH14 -alkukannan ja mutanttijohdannaisten seokset (1:1) koinokuloitettiin hiiriin häntälaskimoinjektion kautta. Pernassa (ympyrät) ja maksassa (neliöt) elävien bakteerien CI laskettiin 24 tunnin kuluttua esiintyneiden villityypin ja mutanttien bakteerien lukumäärän perusteella. znuB-mutantilla ei odotettu olevan kuntovirhettä, ja se on erotettu mustilla symboleilla. Hypoteettinen CI 1,0, joka osoittaa, ettei suhteellisessa kunnossa tapahdu muutosta, on esitetty katkoviivalla. Tähdillä on merkitty mutantit, joiden mediaanikunto (yhtenäiset vaakasuorat viivat) laski merkitsevästi oletettuun arvoon verrattuna Wilcoxonin allekirjoitetun järjestystestin avulla määritettynä (n ≥ 7, P < 0,05). (B) Suhteellinen kunto villityypin kannan UMH14 ja komplementoidun tatC-mutantin (tatC/tatC+) välillä. Kokeet ja tilastolliset analyysit suoritettiin kuten paneelin A kohdalla on kuvattu.
Kaksoarginiinitranslokaatiojärjestelmän komponenttia koodaavan tatC-geenin mutaatio aiheutti kaikkien testattujen mutanttien joukossa suurimman kuntotappion (kuva 3). Sen määrittämiseksi, voitaisiinko tämän mutantin heikentynyt kunto palauttaa geneettisellä komplementoinnilla, tatC-mutanttiin lisättiin tatC:n avointa lukukehystä sisältävä plasmidi pBBR1MCS-5 ja testattiin tuloksena syntyneen kannan suhteellinen kunto. TatC-mutantilla oli aluksi 67-kertainen kuntovika pernassa kilpailtaessa villityypin kannan kanssa (kuva 3A), kun taas komplementoidulla tatC-mutantilla oli vain kaksinkertainen kuntovika samoissa olosuhteissa (kuva 3B). Vastaavasti komplementoitu tatC-mutantti ei kilpaillut merkittävästi maksassa UMH14:ään verrattuna. Kantaplasmidin pBBR1MCS-5 tiedetään säilyvän vakaana infektion aikana ilman valintaa29 , ja C. freundii tatC -mutantin in vitro -viljelyssä, jossa oli joko pBBR1MCS-5 tai tatC+ -komplementtiplasmidi, ei havaittu havaittavaa plasmidin häviämistä 24 tunnin aikana ilman valintaa (kuva S5). Yhdessä nämä tulokset osoittavat vakuuttavasti TatC:n toiminnan vaatimuksen Citrobacter-bakteremian aikana.
Kuntoisuusgeenien säilyminen Citrobacter-isolaattien välillä
Tässä tutkimuksessa määritettiin jokaisen Citrobacter-isolaatin täydellinen genomisekvenssi ja verrattiin kunkin kannan ennustettua proteomia UMH14:ään referenssinä. UMH14-kromosomissa koodatuista 4666 ennustetusta geenituotteesta 3742 on konservoitunut ≥95 prosentin identtisyydellä kaikkien tämän tutkimuksen C. freundii -isolaattien välillä (kuva 4A). Konservoitujen proteiinien (≥95 % identtisyys) määrä kaikkien kantojen välillä vähenee 2545:een, kun UMH17:n ja UMH18:n ennustetut proteomit otettiin mukaan, mikä vastaa näiden isolaattien sijoittumista C. freundii -haaran ulkopuolelle monilokussekvenssianalyysin perusteella (kuva 1). UMH14:n kuntotekijöiden konservoituneisuus oli myös suuri, sillä 145 ennustetuista 177 proteiinista konservoitui ≥95 prosentin aminohappoidentiteetillä kahdeksan bakteerikannan välillä (kuva 4B), mukaan lukien kaikki seitsemän alkuperäistä kuntotekijää, jotka valittiin validoitaviksi (taulukko 1 ja kuva 3). Kun UMH17 ja UMH18 poistettiin tarkastelusta, konservoitujen kuntotekijöiden määrä nousi 162:een (92 %). Nämä tulokset viittaavat Citrobacterin selviytymisstrategiaan bakteremian aikana, joka on suurelta osin riippuvainen lajin sisällä konservoiduista proteiineista. Mielenkiintoista on, että vain harvat kuntotekijät olivat täysin ainutlaatuisia (<30 % identiteetti) UMH14:n kanssa tässä kantojen osajoukossa. Yksi merkittävä esimerkki on oletettu kolmen geenin operoni (CUC46_23440-CUC46_23450), jonka havaitut kuntoviat vaihtelevat 6- ja 14-kertaisina. Kaikki kolme avointa lukukehystä koodaavat hypoteettisia proteiineja, ja näistä vain CUC46_23450:n ennustetaan koodaavan konservoitunutta domeenia, jolla on määritetty funktio (cd01713, fosfoadenosiinifosfosfosulfaattireduktaasi).
Kahdeksan Citrobacter- bakteereita sisältävän isolaattikokoonpanon vertailu. (A) Kaikkien tässä tutkimuksessa kerättyjen Citrobacter-isolaattien ennustettuja proteiinisekvenssejä verrattiin referenssikannan UMH14 kromosomi- ja plasmidikoodattuihin (p1 ja p2) sekvensseihin PATRIC-verkkopalvelimen avulla. (B) 177 C. freundii -kuntotekijän aminohapposekvenssejä käytettiin referenssinä homologien tunnistamiseksi muissa Citrobacter-isolaateissa. Aminohapposekvenssi-identiteetin taso on merkitty värillä. DNA:n rekombinaatioon ja korjaukseen osallistuvat RecBCD- ja RuvABC-entsyymikompleksit edustavat tällaista esimerkkiä. RecBCD-entsyymi on aktiivinen duplex-DNA:n päissä, ja sitä tarvitaan homologisen rekombinaation ja rekombinaationaalisen DNA:n korjauksen prosesseissa. Näihin tehtäviin liittyen RuvABC-entsyymi helpottaa Holliday-liitoksen haarojen siirtymistä ja resoluutiota30,31. Transposonin insertio joko recB:hen, recC:hen tai recD:hen johti 6-8-kertaiseen kunnon heikkenemiseen, ja vastaavasti sekä ruvA:n että ruvC:n häiritseminen transposonin insertiolla johti >30-kertaiseen kunnon heikkenemiseen (Data S1). Tärkeää on, että ruvA:n kuntovirhe vahvistettiin kilpailutartunnalla villityyppistä kantaa vastaan käyttämällä itsenäisesti rakennettua mutanttia (Kuva 3A). Kahdesta moniproteiinikompleksista ainoastaan RuvB:tä ei tunnistettu merkittäväksi kuntotekijäksi aineistossamme. Molempien proteiinikompleksien tiedetään osallistuvan normaalin kromosomisynteesin aikana esiintyvien pysähtyneiden tai romahtaneiden DNA:n replikaatiohaarakoiden ratkaisemiseen30 , vaikka on tärkeää, että ruvA-mutantti kasvoi samalla tavalla kuin villityyppikanta nopean replikaation aikana rikkaassa väliaineessa (kuva S4). On houkuttelevaa spekuloida, että isäntäympäristössä tapahtuvat bakteerien DNA-vauriot, mahdollisesti immuunisolujen välittämien reaktiivisten happilajien tuotannon kautta, voivat myös osaltaan vaikuttaa näiden kompleksien tarpeeseen.
Kaksoarginiinitranslokaatiojärjestelmä
Kaksoarginiinitranslokaatiojärjestelmä toimii gramnegatiivisissa bakteerilajeissa siten, että se erittää laskostuneita valkuaisaineita sytoplasmakalvon läpi. TatC:n rooli tässä konservoituneessa moniproteiinijärjestelmässä on tämän reitin kautta vietävien proteiinien erityssignaalisekvenssien tunnistaminen. Kun oli todettu, että TatC-geenillä on merkittävä vaikutus C. freundii -bakteerin in vivo -kuntoon (kuva 3), pääteltiin, että Tat-järjestelmän erittämiä proteiineja saatetaan tarvita kuntoon myös hiirimallissa. Potentiaalisten Tatin erittämien proteiinien tunnistamiseksi kunkin 177 kuntotekijän N-terminaalinen sekvenssi analysoitiin TatP 1.0 -ennustusohjelmiston32 avulla. Kahden geenin, CUC46_16565 ja CUC46_16060, tunnistettiin koodaavan Tat-riippuvaisia signaalipeptidejä, jotka sisältävät kaksoisarginiinimotiiveja. CUC46_16565-tuotteella on 94 prosentin aminohappoidentiteetti E. coli SufI -proteiinin kanssa, mukaan lukien 100 prosentin säilyvyys kaksoisarginiinimotiivissa ja signaalipeptidin hydrofobisessa osassa33. C. freundii sufI -geeni mutatoitiin, ja kuntoa arvioitiin kilpailussa UMH14-alkukannan kanssa sen määrittämiseksi, johtuuko TatC:n menettämiseen liittyvä kuntovika mahdollisesti SufI:n toiminnan häiriöstä (kuva 5A). SufI-mutantti-kanta todellakin kilpaili 7-kertaisesti pernassa ja 17-kertaisesti maksassa villityypin kantaan verrattuna. Koska tatC-mutaation kuntokustannukset vaihtelivat kuitenkin 67-kertaisesta 112-kertaiseen kilpailussa villityyppisten bakteerien kanssa (Kuva. 3), sufI-mutaation verrattain alhaiset fitness-kustannukset viittaavat siihen, että myös muut Tat-riippuvaiset substraatit voivat vaikuttaa fitnessiin. Yritykset saada aikaan Tat-riippuvainen SufI:n eritys C. freundii -bakteerissa eivät onnistuneet, koska C-terminaalisen FLAG-epitiopilla merkityn SufI-konstruktion ilmentämiseen liittyi ilmeisiä myrkyllisyysongelmia, erityisesti tatC-mutaatiokannassa (tietoja ei ole esitetty). SufI:tä on kuitenkin käytetty Tat-erittyvän proteiinin mallina lukuisissa E. coli Tat-järjestelmää luonnehtivissa tutkimuksissa.
Epäiltyjen Tat-erittyvien proteiinimutaatioiden sopivuushäiriöt ja Tat-järjestelmän osallistuminen C. freundii:n liikkuvuuteen. (A) C. freundii UMH14 -alkukannan ja sufI- tai pepP-mutanttien seoksia (1:1) käytettiin hiirten koinokulaatioon häntälaskimoinjektion kautta. Pernassa (ympyrät) ja maksassa (neliöt) elävien bakteerien CI laskettiin 24 tunnin kuluttua esiintyneiden villityypin ja mutanttien bakteerien lukumäärän perusteella. Hypoteettinen CI 1,0, joka osoittaa, ettei suhteellisessa kunnossa tapahdu muutosta, on esitetty katkoviivalla. Tähdillä on merkitty mutantit, joiden mediaanikunto laski tilastollisesti merkitsevästi (yhtenäiset vaakasuorat viivat) verrattuna oletettuun arvoon Wilcoxonin allekirjoitetun rank-testin avulla määritettynä (n ≥ 8, P < 0,05). (B) Uintiliikkuvuuden kvantitointi villityypin, tatC-mutaation ja täydennetyn tatC-mutaation (tatC/tatC+) kannoille. Bakteerit inokuloitiin LB-väliaineeseen, joka oli kiinteytetty 0,3-prosenttisella agarilla, ja uintiliikkuvuus kvantifioitiin mittaamalla kasvuvyöhykkeen halkaisija sen jälkeen, kun sitä oli inkuboitu 37 °C:ssa 16 tuntia. Pylväät edustavat kolminkertaisten levyjen keskiarvoa ± keskihajonta. TatC-mutantilla oli t-testin mukaan huomattavasti vähemmän liikkuvuutta kuin villityypin ja komplementtimutanttien kannoilla (tähdet, P < 0,001). (C) Edustavat agar-levyt, jotka osoittavat uintiliikkuvuutta.
Toinen tunnistettu potentiaalinen tat-erittyvä kuntotekijä, jota koodaa CUC496_16060, on ennustettu proliiniaminopeptidaasi (PRK10879), joka kuuluu PepP-superperheeseen. Mutanttikanta, josta puuttuu pepP-geeni, oli n. 3-kertainen pernassa ja n. 2-kertainen maksassa, mutta havaittu fitness-haitta villityyppiin verrattuna ei ollut tilastollisesti merkitsevä (kuva 5A). PepP:n subcellulaarinen lokalisaatio määritettiin kuitenkin käyttämällä C-terminaalista FLAG-epitooppimerkittyä johdannaista, joka oli monikopioidulla plasmidilla (PepPFLAG). TatC-mutantissa havaittiin odottamattoman alhaisia PepPFLAG-pitoisuuksia verrattuna UMH14:ään; PepPFLAG-fuusioproteiini löytyi kuitenkin pääasiassa molempien testattujen kantojen sytoplasmafraktiosta (Kuva S6), eikä näyttöä PepP-proteiinin Tat-riippuvaisesta subcellulaarisesta lokalisaatiosta saatu. Yhdessä sufI-mutantin kilpailutartuntatulosten kanssa nämä tiedot tukevat entisestään käsitystä siitä, että C. freundii -bakteerissa esiintyy muitakin Tat-riippuvaisia kuntotekijöitä tai että proteiinien translokaation kumulatiivinen menetys Tat-järjestelmän kautta on suurempi kuin yksittäisen substraatin toiminnan menetys.
Yksi vallitsevista fenotyypeistä, jotka yhdistetään toimintakyvyn menettäneisiin tat-mutantteihin eri lajeissa, on liikkuvuuden heikkeneminen34,35,36,37. C. freundii on lippulaivabakteeri, joka kykenee uintiliikkuvuuteen pehmeässä agarmatriisissa. C. freundii tatC -mutaation uintiliikkuvuus väheni noin 2-kertaiseksi villityyppikantaan verrattuna, ja uintiliikkuvuus palautui täysin geneettisellä komplementoinnilla trans-muodossa (Kuva 5B,C). Nämä tulokset osoittavat selvästi, että TatC:n toiminnan puuttuessa syntyy motiliteettivirhe; koska tatC-mutantissa havaittiin kuitenkin edelleen vähäistä uintia, jonkinlainen lippusolujen toiminta on todennäköisesti säilynyt. FliQ:ta lukuun ottamatta bakteeriperäisessä bakteremiassa tunnistettujen lippuloihin liittyvien fitness-geenien yleinen puuttuminen viittaa siihen, että tatC:n merkitys C. freundii -kannan fitnessille voi olla suurelta osin riippumaton tässä kannassa havaitusta lippuloiden toimintahäiriöstä.
Aineenvaihdunnalliset fitness-reitit
Kuten aiemmin todettiin, huomattavan osan tunnistetuista Citrobacterin fitness-geeneistä ennustettiin toimivan aineenvaihdunnallisiin reitteihin kuuluvina geeneinä (kuva 2). Kolme eri geeniä, jotka edustavat keskeisen hiiliaineenvaihdunnan (pfkA), fruktoosi- ja mannoosiaineenvaihdunnan (mtlD) ja aminohappojen biosynteesin (cysE) komponentteja, valittiin jatkotutkimuksiin. Bakteerien kysteiinin biosynteesi tapahtuu L-seriinistä O-asetyyli-L-seriinin (OAS) välituotteen kautta. Tätä E. coli -mallireitin ensimmäistä vaihetta katalysoi CysE O-asetyylitransferaasientsyymi, ja cysE:n menettäminen johtaa kysteiinin aksotrofiaan38,39. C. freundii cysE -mutantti ei myöskään kykene lisääntymään määritellyssä väliaineessa, josta puuttuu kysteiini (kuva 6A), mutta se voi saavuttaa lähes villin tyypin tiheyden, kun väliaineeseen lisättiin joko OAS:ää (kuva 6B) tai kysteiiniä (kuva 6C). cysE-mutaation geneettinen komplementointi johti kasvun osittaiseen palautumiseen ilman kysteiiniä. Mielenkiintoista on, että cysE-mutanttibakteerien täydellinen kasvun puute ilman OAS:ää tai kysteiiniä in vitro on ristiriidassa infektion aikana havaitun osittaisen kuntovian kanssa (kuva 3A). Tämä viittaa siihen, että Citrobacter saattaa pystyä hankkimaan näitä aineenvaihduntatuotteita verenkiertoympäristöstä, mutta biosynteettisen reitin katkeamiseen liittyy silti kuntokustannus.
C. freundii -metaboliamutaatioiden kasvu määritellyssä väliaineessa. Villityyppistä (WT) C. freundii -kantaa UMH14, vektorikontrolliplasmideja sisältäviä mutantteja ja komplementoituja mutantteja kasvatettiin määritellyssä M9-alustassa. Bakteerien kasvu mitattiin optisella tiheydellä (600 nm) 15 minuutin välein, ja kukin piste edustaa kolminkertaisten viljelmien keskiarvoa ± keskihajonta. Lisäaineita lisättiin M9-perussuolaliuokseen seuraavasti: (A) 22 mM glukoosia; (B) 22 mM glukoosia ja 10 mM OAS:a; (C) 22 mM glukoosia ja 1 mM kysteiiniä; (D) 22 mM glukoosia; (E) 22 mM mannitolia; (F) 22 mM glukoosia.
Osana tutkimustamme, joka käsitteli Citrobacterin isäntään sidottua metaboliaa, selvitettiin tämän bakteerin kykyä hyödyntää erilaisia hiilenlähteitä. Muiden suolistoperäisten lajien PfkA-fosfofruktokinaasientsyymiä on luonnehdittu laajasti, ja se edustaa glykolyysin ensimmäistä sitoutunutta vaihetta katalysoimalla fruktoosi-6-fosfaatin fosforylaatiota fruktoosi-1,6-bisfosfaatiksi. UMH14:n osalta pfkA:n mutaatio poisti tämän kannan kyvyn lisääntyä glukoosilla ainoana hiililähteenä (kuva 6D), mikä voitiin osittain palauttaa tarjoamalla pfkA monikopioidulla plasmidilla. Tämä glukoosin hyötykäytön täydellinen menetys in vitro korreloi bakteeriperäisen kunnon kaksinkertaiseen alenemiseen (kuva 3A). Mannitoli-1-fosfaatti-5-dehydrogenaasiproteiini, MtlD, helpottaa mannitoli-1-fosfaatin ja fruktoosi-6-fosfaatin kaksisuuntaista muuntumista käyttäen NAD+:a tai NADH:ta kofaktorina41,42. Useat suolistoperäiset bakteerilajit voivat käyttää sokerialkoholia mannitolia ainoana hiililähteenä sen jälkeen, kun se on kulkeutunut heksitoli-fosfoenolipyruvaatti-riippuvaisen fosfotransferaasijärjestelmän kautta, mikä johtaa mannitoli-1-fosfaatin kertymiseen solunsisäisesti43,44. Yksi mahdollinen mannitoli-1-fosfaatin kohtalo on MtlD-riippuvainen hapettuminen fruktoosi-6-fosfaatiksi ja sen jälkeinen siirtyminen glykolyyttiseen reittiin. C. freundii mtlD -mutantin kunto laski viisinkertaisesti hiiren maksassa (kuva 3A), ja tämä havainto johti kokeisiin, joissa selvitettiin, kykeneekö C. freundii tämäntyyppiseen metaboliaan in vitro. UMH14- ja mtlD-johdannaiskantoja viljeltiin mannitolia sisältävässä määritellyssä väliaineessa, ja tuloksena saadut kasvukäyrät osoittavat, että villityyppiset bakteerit ja täydennetty mutantti pystyivät lisääntymään näissä olosuhteissa, kun taas mtlD-kanta ei pystynyt (kuva 6E). Odotetusti mtlD-mutantti pystyi lisääntymään lähes villin tyypin tasolle, kun sille annettiin glukoosia hiililähteenä aerobisissa olosuhteissa (kuva 6F). Yhdessä nämä tulokset osoittavat sekä C. freundii:n kyvyn hyödyntää mannitolia ainoana hiililähteenä että mtlD:n vaatimuksen tässä prosessissa.
Patogeenien yhteiset kuntoilustrategiat verenkiertoympäristössä
Olemme aiemmin arvioineet toisen opportunistisen patogeenin, S. marcescensin, kuntoiluvaatimuksia käyttäen samanlaista bakteeriperäistä hiirimallia. S. marcescens -tutkimuksen tuloksiin sisältyi 212 fitness-geenin tunnistaminen käyttäen samanlaisia tekniikoita kuin tässä työssä45. Sen selvittämiseksi, onko näillä lajeilla yhteisiä reittejä BSI:n aikana tapahtuvaa kuntoa varten, verrattiin ensin molempien lajien ennustettuja proteomeja. Proteiineja pidettiin homologisina C. freundii- ja S. marcescens -bakteerien välillä, jos niillä oli ≥70 prosentin aminohappoidentiteetti ≥50 prosentissa sekvenssiä. Yhteensä 42 homologista proteiinia tunnistettiin merkittäviksi kuntotekijöiksi molemmissa organismeissa (taulukko S1), ja tässä yhteisten kuntotekijöiden luettelossa on edustettuna useita erilaisia toimintoja. Erityisesti RuvA-proteiini, jonka menetys johti >10-kertaiseen C. freundii -kuntoisuuden laskuun kilpailutartunnan avulla (kuva 3A), tunnistettiin yhdessä RuvC:n kanssa kuntotekijöiksi S. marcescensissa. Nämä tulokset tukevat edelleen hypoteesia, jonka mukaan Holliday-liitoskompleksien resoluutio, mahdollisesti DNA-vaurioiden rekombinaatiokorjauksen aikana, on tärkeää näiden organismien in vivo -kunnon kannalta. Myös PfkA-fosfofruktokinaasientsyymi tunnistettiin kuntotekijäksi molemmissa lajeissa. Kuten Citrobacterin kohdalla havaittiin, S. marcescensin pfkA:ta tarvitaan glukoosin hyödyntämiseen ainoana hiililähteenä, ja sitä tarvittiin lisäksi bakteerien optimaaliseen lisääntymiseen lämpöinaktivoidussa ihmisseerumissa45. Molemmissa organismeissa pfkA vaikutti transposoniseulalla arvioituna pernan kuntoon, vaikka mielenkiintoista onkin, että S. marcescens pfkA -mutantilla oli myös noin 9-kertaisesti heikentynyt kunto munuaisissa kilpailutilanteessa villiä tyyppiä olevan kannan kanssa. Tämän työn aikana havaittiin, että C. freundii UMH14 -villityypin kanta kolonisoitui suhteellisen huonosti munuaisiin BSI-mallissa, mutta Proteus mirabiliksen pfkA-geenin on osoitettu edistävän munuaisten kuntoa virtsatieinfektion jälkeen46. Yhdessä nämä tulokset osoittavat, että on mahdollista tunnistaa konservoituneita kuntostrategioita eri organismeissa tietyssä ympäristössä. Lisätyötä tarvitaan sen selvittämiseksi, tarvitaanko näitä geenituotteita myös muissa BSI:tä aiheuttavissa organismeissa ja voidaanko näitä konservoituneita kuntoratoja hyödyntää.