Albers-Schönbergin tauti (autosomaalinen dominoiva osteopetroosi, tyyppi II) johtuu ClCN7-kloridikanavageenin mutaatioista

Abstract

Albers-Schönbergin tauti eli autosomaalinen dominantti osteopetroosi, tyyppi II (ADO II) on yleisin osteopetroosin muoto, joka on ryhmä sairauksia, joille on ominaista lisääntynyt luuston massa, joka johtuu heikentyneestä luun ja ruston resorptiosta. Sen jälkeen, kun ADO II:n aiheuttava geeni on määritetty kromosomille 16p13.3, raportoimme nyt seitsemästä eri mutaatiosta ClCN7-kloridikanavaa koodaavassa geenissä kaikissa 12 analysoidussa ADO II -perheessä. Lisäksi eräällä potilaalla, jolla on vaikea, autosomaalisesti resessiivisesti periytyvä, lapsuusiän osteopetroosin muoto (ARO), todettiin ClCN7-mutaation homotsygootti. Genotyypin ja fenotyypin korrelaatioiden perusteella näyttää siltä, että ADO II heijastaa dominoivaa negatiivista vaikutusta, kun taas ClCN7:n toimintakyvyn menetysmutaatiot eivät aiheuta poikkeavuuksia heterotsygoottisilla henkilöillä. Koska joillakin ARO-potilailla on mutaatioita ClCN7-geenin molemmissa kopioissa, ADO II on alleelinen osajoukon ARO-tapausten kanssa.

Vastaanotettu 2. lokakuuta 2001; Tarkistettu ja hyväksytty 11. lokakuuta 2001.

TOIMINTA

Terveydessä luukudoksen uudelleenmuodostus on seurausta luun muodostumisen ja resorption tasapainoisista prosesseista. Liiallinen resorptio aiheuttaa osteoporoosia, joka on syynä useimpiin ei-traumaattisiin murtumiin (1). Sitä vastoin puutteellinen luun resorptio aiheuttaa osteopetroosia, jolle on ominaista tiheä mutta yleensä hauras luusto. Ihmisillä on kuvattu ainakin kahdeksan erilaista osteopetroosia (2). Hiilihappoanhydraasi II -isoentsyymin puutos aiheuttaa autosomaalisesti resessiivisen osteopetroosin (ARO), johon liittyy munuaisten tubulaarinen asidoosi ja aivokalsifikaatioita (3; MIM 259730), kun taas suurin osa pahanlaatuisista ARO-tapauksista (4; MIM 259700) on seurausta TCIRG1-geenin mutaatioista (5,6). Joissakin harvinaisissa osteopetroositapauksissa, joilla on ilmeisesti autosomaalinen resessiivinen periytymistapa, fenotyyppi on lievempi, ja niitä kutsutaan siksi ”välimuodoksi” (7,8; MIM 259710).

Autosomaalinen dominantti osteopetroosi (ADO) on paljon yleisempi kuin resessiiviset tapaukset (9). ADO:n esiintyvyys on kuitenkin aliarvioitu, koska sen kliininen kuva on suhteellisen hyvänlaatuinen ja monet potilaat ovat oireettomia ja havaitaan vain sattumanvaraisessa röntgentutkimuksessa. ADO:ta sairastavissa perheissä raportoidaan yleensä kaksi alatyyppiä, jotka perustuvat ensisijaisesti radiografisiin ominaisuuksiin (10,11). Tyypissä I (ADOI) esiintyy yleistynyttä, diffuusia osteoskleroosia, joka vaikuttaa erityisesti kallon holviin (11). Tyyppi II (ADO II; MIM 166600), Albers-Schönbergin alun perin vuonna 1904 kuvaama muoto (12), on yleisin, ja sen arvioitu esiintyvyys on jopa 5,5/100 000 (13). Kliinisiä ilmenemismuotoja ovat muun muassa ei-traumaattiset murtumat, erityisesti pitkien luiden murtumat, kallohermophalvaukset, lonkan nivelrikko ja alaleuan osteomyeliitti (14). ADO II ilmenee röntgenologisesti segmentaarisena osteoskleroosina, pääasiassa nikamalevyissä (”rugger jersey -selkäranka”), suoliluun siivissä (”luu luun sisällä” -merkki) ja kallonpohjassa (9) (kuva 1) (kuva 1).

Hiljattain koko genomin kattavan haun perusteella ADO II:n taustalla oleva geeni osoitettiin kromosomille 16p13.3 (15). Mielenkiintoista on, että ClCN7-kloridikanavaa koodaava geeni sijaitsee 8,4 cM:n ehdokasalueella (16). Kloridikanava on itse asiassa välttämätön solunulkoisen resorptiolakuunan happamoitumiselle, joka on välttämätöntä osteoklastien välittämälle luukudoksen hajoamiselle (17), ja se on mutaantunut yhdellä ARO-potilaalla (17). Tämän vuoksi pidimme ClCN7:ää sekä sijainnillisena että toiminnallisena kandidaattigeeninä Albers-Schönbergin taudin aiheuttajana.

TULOKSET

Mutaatioanalyysi ADO II -perheissä

Koska ClCN7-geenin sisältävä genomisekvenssi on saatavissa sekvenssitietokannoista (GenBankin liittymisnumerot AL031600 ja AL031705), mutaatioanalyysi eksonien ja intronien ja eksonien välisistä raja-arvoista on mahdollista tehdä genomista DNA:ta käyttäen. Näin saatiin selville seitsemän erilaista mutaatiota ClCN7-geenissä (kuva 2) 12:ssa sukuun kuulumattomassa ADO II -perheessä (taulukko 1). Viisi mutaatiota on missense-mutaatioita, yksi johtaa yhden aminohapon poistoon ja yksi poistaa kaksi nukleotidia aiheuttaen frameshiftin, joka vaikuttaa proteiinin C-terminaaliseen päähän. Yhtäkään näistä mutaatioista ei löytynyt 100 kontrollikromosomissa.

Neljä mutaatiota on redundantteja mutaatioita. Mutaatio 2423delAG tunnistettiin ranskalaisessa perheessä ja yhdysvaltalaisessa perheessä. G215R-mutaatio esiintyi ranskalaisessa, tanskalaisessa ja amerikkalaisessa perheessä. P249L-mutaatio todettiin ranskalaisessa ja saksalaisessa perheessä. R767W-mutaatio havaittiin ranskalaisessa ja yhdysvaltalaisessa perheessä (taulukko 1). Tutkittujen perheiden erilainen maantieteellinen alkuperä sekä ClCN7-geeniä reunustavien mikrosatelliittimerkkien analyysi (tietoja ei ole esitetty) viittaavat siihen, että kyse on itsenäisistä mutaatioista, jotka eivät siis ole periytyneet yhteisestä esi-isästä.

ARO-potilaan mutaatioanalyysi

Linkkausanalyysi kromosomin 16p13.3 markkereilla osoitti selvästi homotsygoottiutta kaikkien markkereiden osalta ARO-potilaalla, joka on syntynyt verenperintönä syntyneistä terveistä vanhemmista (tietoja ei ole esitetty). Tämän vuoksi tehtiin ClCN7:n mutaatioanalyysi, joka osoitti homotsygoottisen missense-mutaation paikassa 766 (L766P) (kuva 2). Molemmat vanhemmat ovat heterotsygoottisia tämän mutaation suhteen.

Mutatoituneiden aminohappojen sijainti ja säilyminen

ClC-kloridikanaville ehdotettu transmembraanitopologia viittaa 10-12 transmembraanidomeeniin (18). Viisi aminohappoa, jotka ovat mukana ADO II:n missense-mutaatioissa sekä ARO-potilaan mutaatiossa, ovat kaikki erittäin konservoituneita ClC-kloridikanavien geeniperheen eri jäsenten keskuudessa (kuva 3). G215R- ja P249L-mutaatiot ovat toistuvia mutaatioita, joita havaittiin kolmen ja kahden sukulaisuudeltaan toisistaan riippumattoman perheen potilailla (taulukko 1). G215 on erittäin konservoitunut jäännös, joka sijaitsee D2:n ja D3:n välissä (kuva 4), alueen, jonka tiedetään vaikuttavan kanavien huokosominaisuuksiin (19), kun taas P249 osallistuu erittäin konservoituneeseen rakenteelliseen elementtiin, joka muodostaa merkittävän osan ClC-kanavan huokoksesta (20). R286 sijaitsee solunulkoisessa tilassa, aivan transmembraanidomeenin D5 ulkopuolella. Tämä aminohappo on konservoitunut eri ClC-proteiinien välillä lukuun ottamatta ClC1:tä ja ClC2:ta, joilla on poikkeava sekvenssi tällä proteiinin alueella. Kaksi muuta ADO II -mutaatiota ja ARO-mutaatio ovat proteiinin sytosolisessa, C-terminaalisessa osassa, ja ne koskevat viereisiä aminohappoja. G765, L766 ja R767 sijaitsevat D13-jaksolla, joka osuu yhteen CLCN7-proteiinissa kuvatun toisen CBS-domeenin (kystationiini-β-syntaasi) kanssa (21). Kaikki kolme mutaatiota sijaitsevat CBS-domeenin β2-säikeessä, jonka mutaatioiden on raportoitu aiheuttavan sairauksia ihmisillä (22). Tämän domeenin tarkka funktio on edelleen epäselvä, mutta sen on ehdotettu liittyvän proteiinien lajitteluun (21).

Lopuksi kaksi pientä deleeraatiota koskee ClCN7:n solunsisäisen C-terminaalisen osan aminohappoja. Yhdellä potilaalla deletoitu aminohappo L688 sijaitsee kahden CBS-domeenin välissä, kun taas kahden nukleotidin poisto alkaen nukleotidipaikasta 2423 johtaa kahdessa toisistaan riippumattomassa perheessä proteiiniin, joka eroaa villityyppisestä ClCN7:stä vain 10 viimeisen aminohapon osalta.

KESKUSTELU

Nisäkkäiden osteopetroosit muodostavat heterogeenisen ryhmän sairauksia, joihin kuuluu ainakin kahdeksan erilaista kliinistä kokonaisuutta ihmisillä (2) ja noin yhdeksän spontaania eläinmutaatiota (23). Lisäksi useiden geenien knockout-hiirimallit aiheuttavat osteopetroottisia fenotyyppejä, mikä havainnollistaa osteoklastien erilaistumiseen ja aktivoitumiseen osallistuvien tekijöiden moninaisuutta (23).

Hiljattain ihmisen osteopetroosien heterogeenisuutta on korostanut geneettinen heterogeenisuus jopa ADO II -alatyypin sisällä (24,25). Tämä paljastus perustui tanskalaiseen suurperheeseen kohdistuneeseen linkitystutkimukseen, jossa ADO II -geeni osoitettiin kromosomille 1p21 (26). Tätä osoitusta ei kuitenkaan vahvistettu muita ADO II -perheitä koskevissa tutkimuksissa. Itse asiassa äskettäisessä linkitystutkimuksessamme, johon kuului kuusi ADO II -perhettä, paikansimme tautia aiheuttavan geenin kromosomille 16p13.3 ja havaitsimme samassa tanskalaisessa perheessä ADO II:n ja kromosomin 16p13.3 haplotyypin välistä yhteissegregaatiota (15). Siksi arvelimme, että todisteet linkittymisestä kromosomiin 1p21 tässä perheessä heijastivat satunnaista yhteenkietoutumista. Tässä tutkimuksessa vahvistimme tämän hypoteesin tunnistamalla tautia aiheuttavan mutaation (G215R) ClCN7-geenissä tässä tanskalaisessa perheessä. Tämä ja se, että tämän geenin mutaatioita löytyi kaikista 12 analysoidusta ADO II -perheestä, viittaavat siihen, että ADO II on geneettisesti homogeeninen.

Tuloksemme osoittavat myös, että ADO II on alleelinen osajoukon potilaiden kanssa, joilla on vaikea, autosomaalisesti resessiivisesti periytyvä, lapsuusiän osteopetroosin muoto. Aiemmin yksi ARO-potilas on kuvattu yhdistelmäheterotsygoottina nonsense-mutaation (Q555X) ja missense-mutaation (R762Q) suhteen ClCN7-geenissä (17). Nyt löydämme homotsygoottisen mutaation (L766P) toisesta ARO-potilaasta.

Kuva 5 havainnollistaa eri genotyyppien ja fenotyyppien välistä korrelaatiotamme. Kuten ClC-7 knockout -hiiren fenotyyppi osoittaa, ClC-7-kloridikanavan täydellinen toimintakato aiheuttaa ARO-potilailla havaitun vakavan osteopetroosin. Koska ClCN7-mutaatioita on tähän mennessä luonnehdittu vain kahdella ARO-potilaalla, on mahdotonta tietää, heijastavatko fenotyyppiset erot mutaatioiden luonnetta. Joissakin harvinaisissa osteopetroositapauksissa on ”välimuoto”. Näissä tapauksissa ehdotetaan autosomaalista resessiivistä periytymistapaa, mutta fenotyyppi on lievempi kuin ARO:ssa (7,8). Ehkä nämä tapaukset johtuvat kahden ClCN7:n mutaation yhdistelmistä, jotka kumpikin vähentävät Cl-johtavuutta vain lievästi.

Tässä raportoidut ADO II -mutaatiot ovat pääasiassa missense-mutaatioita, joihin liittyy konservoituneita aminohappoja (kuvat 3 ja 4). Kaksi jäljelle jäävää mutaatiota ovat pieniä deletointeja, jotka myös säilyttävät kloridikanavan pääasiallisen anatomian, ja siksi ne johtavat todennäköisesti missense-mutaatioihin verrattaviin vaikutuksiin. Koska kloridikanavat näyttävät järjestäytyvän multimereiksi, todennäköisesti dimeereiksi (27), nämä mutaatiot todennäköisesti heikentävät niiden toimintaa dominoivan negatiivisen vaikutuksen vuoksi. Tällaisilla vaikutuksilla useimmat kloridikanavat eivät toimi, mikä selittää fenotyyppiset poikkeavuudet.

Yleensä ARO-potilaiden vanhemmat ovat fenotyyppisesti normaaleja. Oletamme tämän heijastavan sitä, että tämän geenin haploinsuffisienssi ei todennäköisesti aiheuta kliinisiä komplikaatioita tai radiografisia löydöksiä. Vaihtoehtoisesti tämä voi joissakin tapauksissa johtua ADO II:n alentuneesta penetranssista. Tässä tutkimuksessa esitellyn ARO-potilaan vanhemmilla ei ole ADO II:n kliinisiä oireita, mutta röntgentutkimusta ei ollut saatavilla.

ADO II:n ja ARO:n alleelista luonnetta tukee raportti ADO II:ta segregoivasta laajennetusta suvusta, jossa yhdellä yksilöllä ilmeni ARO (28). Ehkäpä tässä perheessä mutaantunut ClCN7-geeni, jolla on dominoiva negatiivinen vaikutus, aiheuttaa ADO II:n, joka sitten sattuu yhteen de novo -mutaation kanssa, tai toisesta vanhemmasta periytyvä mutaatio, joka aiheuttaa ARO:n. Ehdotettu selitys ClCN7-mutaatioihin liittyville osteopetroosin dominoiville ja resessiivisille muodoille on samankaltainen kuin myotoniaa aiheuttavat ClC-1-geenin mutaatiot. Mutaatiot, jotka johtavat ClC-1:n häviämiseen, aiheuttavat autosomaalisen, resessiivisen muodon (Becker-tyyppi) (29), kun taas missense-mutaatiot ilmentävät lievempää, autosomaalista, dominoivaa muotoa (Thomsen-tyyppi) (30).

Yhteenvetona osoitamme, että suurin osa, elleivät peräti kaikki ADO II -tapaukset johtuvat mutaatioista ClCN7-geenissä. ClCN7-mutaatioiden luonteen perusteella ADO II -fenotyyppi johtuu todennäköisesti dominantista negatiivisesta vaikutuksesta. Tuloksemme tukevat hypoteesia, jonka mukaan kloridikanavat toimivat yleensä homomultimeereinä. Lisäksi tutkimuksemme havainnollistaa ADO II:n alleelista luonnetta ja ARO-tapausten osajoukkoa.

MATERIAALI JA MENETELMÄT

PERHEET JA POTILAAT

PERHEET A-F kuvattiin aiemmin, koska niiden avulla paikannettiin Albers-Schönbergin taudin geeni kromosomille 16p13.3 (15). Näytteet G-L ovat Albers-Schönbergin tautia sairastavista henkilöistä perheistä, ja niitä on kuvattu myös useita (31-33) (taulukko 1).

Perhe M asuu Yhdysvalloissa, mutta on kiinalaista syntyperää. Ehdotettu lapsi on terveen pariskunnan lapsi ja syntyi täysiaikaisen raskauden jälkeen. Vanhemmat ovat pikkuserkkuja. ARO diagnosoitiin 3 kuukauden iässä, kun hän esiteltiin Queensin New Yorkin sairaalan lääketieteelliseen keskukseen Bellin halvauksen vuoksi. Röntgenkuvaus luustosta paljasti vakavan osteopetroosin ja useita siirtymättömiä viistomurtumia. Hänellä oli anemia, retikulosytoosi, hepatosplenomegalia ja lievä näköhermon surkastuminen. Lapselle tehtiin epäsopiva allogeeninen luuydinsiirto, mutta hän kuoli 18 kuukauden iässä sepsikseen ja hengitysvajaukseen.

Mutaatioanalyysi

DNA eristettiin verestä tavanomaisin menetelmin. ClCN7:n kaikkia koodaavia eksoneja ja introni-eksonien rajoja monistavat introni-alukkeet (taulukko 2) suunniteltiin genomisekvensseistä (GenBankin liittymisnumerot AL031600 ja AL031705). 25 eksonia monistettiin genomisesta DNA:sta Taq-polymeraasilla tai PCR- tehostinjärjestelmällä (Gibco BRL) tehostinpitoisuuden ollessa 1 ×. Kaikille monistuksille suoritettiin 30 sykliä taulukossa 2 määritellyssä lämpötilassa.

PCR-tuotteet puhdistettiin Concert Rapid PCR -puhdistusjärjestelmällä (Life Technologies) ja sekvensoitiin suoraan monistuksessa käytetyillä alukkeilla käyttäen Big-Dye-terminaattorikemiaa (Perkin-Elmer) ABI 3100 -automaattisekvensserillä. Eksoni 9:n monistaminen johti pituudeltaan vaihtelevaan fragmenttiin, koska tämä eksoni seuraa 50 bp:n sekvenssin tandemtoistoa, jonka kopioluku vaihtelee. Näytteissämme kopiomäärä vaihteli neljästä seitsemään toistoon. Tämä toisto myös häiritsee joissakin näytteissä tämän eksonin sekvensointia eteenpäin-suunnassa.

Kaikki eksonit, joissa havaittiin oletettuja mutaatioita, sekvensoitiin 100:sta kontrollikromosomista ilman, että mutaatioita löydettiin.

LÄHTEET

Kiitämme potilaita ja perheitä sekä kliinikkoja, jotka toimittivat materiaalia. Tätä tutkimusta on tuettu apurahalla (G.0404.00) ”Fonds voor Wetenschappelijk onderzoek” (FWO) W.V.H:lle. Tutkimusta ovat tukeneet myös apurahat ”Société Française de Rhumatologie” (SFR), ”Fonds d’Etude et de Recherche du Corps Médical des Hôpitaux de Paris” (FERCMHP) ja Shriners Hospital for Children (nro 8540).