Abstract
Xiao-Yao-San (XYS) Abkochung ist eine Formel der traditionellen chinesischen Medizin. Ziel dieser Studie war es, die Wirkung von XYS auf die kognitiven Fähigkeiten und den zugrundeliegenden Mechanismus bei ovarektomierten Ratten zu untersuchen. Weibliche Sprague-Dawley-Ratten wurden ovarektomiert und mit XYS (3 g/kg oder 9 g/kg) durch Schlucken behandelt, mit subkutaner Injektion von 17-β-Östradiol (E2, 2 μg/kg) als positive Arzneimittelkontrolle und Schlucken von 1 ml Kochsalzlösung (0,9%) als Placebokontrolle. Nach 6 Wochen Behandlung wurden die Ratten mit dem Morris-Wasserlabyrinth-Test untersucht. Der Östradiolspiegel im Serum und im Hippocampus wurde mittels ELISA gemessen. Zur Beobachtung der neuronalen Morphologie im Hippocampus wurde eine Golgi-Färbung durchgeführt. Die Apoptose von Hippocampuszellen wurde durch TUNEL-Färbung beobachtet. Der Proteingehalt von N-Methyl-D-Aspartat-Rezeptor (NMDAR) 2A und 2B in der CA1-Region des Hippocampus wurde durch Western Blot und Immunhistochemie bestimmt. Die Expression des Östrogenrezeptors (ER) und der PI3K-Signalübertragung wurde durch Western Blot nachgewiesen. Im Vergleich zur Scheingruppe waren bei ovarektomierten Ratten sowohl das Lernen als auch das Gedächtnis beeinträchtigt. Ratten, die mit E2 oder hochdosiertem XYS behandelt wurden, zeigten im Vergleich zu den mit Kochsalzlösung behandelten Ratten bessere Lern- und Gedächtnisleistungen. Eine hohe XYS-Dosis verringerte die Latenzzeit für die Flucht in der räumlichen Akquisitionsprüfung signifikant, während die Kreuzungszeiten und die Dauer im Probequadranten in der räumlichen Probeprüfung erhöht wurden. Hochdosiertes XYS förderte die De-novo-Synthese des E2-Gehalts im Hippocampus, hatte aber keine signifikante Wirkung auf den E2-Serumspiegel. Die Golgi-Färbung zeigte, dass hochdosiertes XYS die Anzahl der Verzweigungen und die Dichte der dendritischen Dornen im CA1-Bereich des Hippocampus erhöhen konnte. Die TUNEL-Färbung zeigte, dass hochdosiertes XYS die durch die Ovariektomie ausgelöste neuronale Apoptose milderte. Die Expression von NMDAR2A und NMDAR2B im CA1-Bereich des Hippocampus wurde durch die Behandlung mit XYS hochreguliert. Die positive Wirkung von XYS wurde durch die Aktivierung der ERα-PI3K-Signalübertragung erzielt. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass eine hochdosierte XYS-Behandlung die kognitiven Fähigkeiten von ovarektomierten Ratten verbessern kann, indem sie die Hippocampus-Neuronen schützt und den E2-Spiegel im Hippocampus wiederherstellt.
1. Einleitung
Perimenopausale Frauen leiden häufig unter Angstzuständen und Depressionen, die mit Schwankungen des Östrogenspiegels zusammenhängen. Neben Angstzuständen und Depressionen ist Vergesslichkeit eine weitere häufige Beschwerde bei Frauen in der Perimenopause. Die Seattle Midlife Women’s Health Study berichtet, dass 60 % der Frauen mittleren Alters eine Verschlechterung ihres Gedächtnisses feststellen. Die Study of Women’s Health Across the Nation (SWAN) stellte fest, dass die Perimenopause bei Frauen mittleren Alters ein abhängiger Risikofaktor für die selbstberichtete Vergesslichkeit war. Da das Gehirn ein wichtiges Ziel der Östrogenregulierung ist, wird spekuliert, dass Östrogenmangel für die kognitive Beeinträchtigung verantwortlich sein könnte. Die Ergebnisse von Beobachtungsstudien über den Einfluss auf die Kognition sind jedoch nicht ganz einheitlich. Außerdem sind wirksame therapeutische Hormoninterventionen zur Verbesserung der kognitiven Leistung noch nicht bekannt. Darüber hinaus können auch andere Faktoren, wie wahrgenommener Stress, Stimmung und körperliche Gesundheit, zu Gedächtnissymptomen beitragen. Die Östrogenproduktion der Eierstöcke wirkt sich eher bei einem abrupten Rückgang als bei einem natürlichen Übergang auf das Gedächtnis aus. Im Gegensatz zu den widersprüchlichen Ergebnissen von Humanstudien stützen die Befunde bei ovarektomierten Tieren den Zusammenhang zwischen Östrogenmangel und kognitiven Veränderungen und der Wirksamkeit einer Hormonersatztherapie.
Die Supplementierung mit Phytoöstrogenen ist eine beliebte alternative Therapie zur Linderung der Symptome der Wechseljahre. Phytoöstrogene, wie Flavonoide, Isoflavone und Lignane, haben eine ähnliche Struktur wie steroidale Östrogene und können eine östrogenähnliche Rolle spielen, indem sie Östrogenrezeptoren (ER) aktivieren. Eine Metaanalyse untermauert die Wirksamkeit einer Supplementierung mit Soja-Isoflavonen zur Verbesserung des visuellen Gedächtnisses bei gesunden Frauen nach der Menopause. Die SWAN Phytoöstrogen-Zusatzstudie zeigte, dass eine hohe Zufuhr von Isoflavonen oder Lignin die Verarbeitungsgeschwindigkeit oder das verbale Gedächtnis in einem bestimmten Stadium der Menopause verbessern kann, wobei der Nutzen auch mit der Ethnizität/Rasse zusammenhängt. Die Wirkung von Phytoöstrogenen auf die Verbesserung der Kognition ist in Tierstudien deutlicher zu erkennen. Ein hydroalkoholischer Extrakt aus Bockshornkleesamen konnte die durch Ovariektomie (OVX) induzierte Schädigung der Hippocampusneuronen abschwächen und die Lern- und Gedächtnisleistung in einem Rattenmodell verbessern.
Xiao-Yao-San (XYS), was auf Chinesisch „glückliches und sorgloses Pulver“ bedeutet, ist eine Formel der traditionellen chinesischen Medizin (TCM), die zur Behandlung von Angstzuständen und Depressionen in den Wechseljahren eingesetzt wird. Die Formel besteht aus Bupleuri radix (Chaihu), Angelicae radix (Danggui), Paeoniae radix alba (Baishao), Atractylodis rhizome macrocephalae (Baizhu), Poria cocos (Fuling), Zingiberis siccatum rhizoma (Shengjiang), Menthae haplocalycis (Bohe), und Glycyrrhizae radix (Gancao). Eine systematische Analyse, die 26 randomisierte Studien einschloss, zeigte, dass XYS den Antidepressiva überlegen war, wie die Ergebnisse der Hamilton-Depressionsskala zeigten, und dass es die Wirksamkeit der Antidepressiva bei der Verbesserung der Ergebnisse der Selbsteinschätzungsskala für Depressionen verstärken konnte. Perimenopausale Frauen mit Exophthalmus und Herzklopfen könnten ebenfalls von einer Behandlung mit XYS profitieren. Einige therapeutische Wirkungen von XYS bei der Linderung des Menopausensyndroms können auf das Vorhandensein von Phytoöstrogenen zurückgeführt werden. In einer Reihe von Studien wurde über das Vorhandensein von Phytoöstrogenen in XYS berichtet. Ergosterol findet sich in Poria cocos (Fuling) , und β-Sitosterol ist bekanntlich in Angelicae radix (Danggui) enthalten. Miller-Marini et al. entwickelten einen Östrogen-chimären Rezeptor/Gal4-response element regulated/luciferase-reporter Assay zum Nachweis von Phytoöstrogenen in komplexen TCM-Formeln. Sie analysierten die Bupleurum & Peony Formula, eine modifizierte Formel von XYS mit denselben Hauptkräutern, und fanden einen messbaren Gehalt an Phytoöstrogenen.
Das Vorhandensein von Phytoöstrogenen in XYS deutet darauf hin, dass XYS das Potenzial hat, durch Östrogenmangel verursachte kognitive Beeinträchtigungen zu behandeln. Eine Tierstudie hat gezeigt, dass XYS die durch chronischen Immobilisationsstress (CIS) verursachten Lern- und Gedächtnisdefizite abschwächen kann. Bislang wurde in keiner Studie die Wirkung von XYS auf die Verbesserung kognitiver Beeinträchtigungen bei Frauen in der Perimenopause untersucht. Daher wurde in der vorliegenden Studie die Wirkung von XYS auf die kognitiven Fähigkeiten und der zugrunde liegende Mechanismus bei OVX-Ratten untersucht.
2. Materialien und Methoden
2.1. Tiere und Behandlung
Insgesamt wurden in dieser Studie 60 weibliche Sprague-Dawley-Ratten verwendet. Das Studienprotokoll wurde von der institutionellen Ethikkommission für Versuchstiere genehmigt (Genehmigungsnummer: ACU170802). Die Tiere wurden bei kontrollierter Temperatur und Luftfeuchtigkeit mit freiem Zugang zu Wasser und Standardnahrung untergebracht. Die Ratten wurden nach dem Zufallsprinzip in 5 Gruppen (12 Ratten/Gruppe) eingeteilt: Sham-Gruppe, OVX + Kochsalzlösung oder O-Salzgruppe, OVX + 17-β-Östradiol (E2) oder O-E2-Gruppe, OVX + XYS 9 g/kg oder O-XYS9-Gruppe und OVX + XYS 3 g/kg oder O-XYS3-Gruppe. Die Ratten wurden unter Narkose, wie zuvor beschrieben, einer OVX-Operation unterzogen. Kurz gesagt, wurde ein Längsschnitt in einem Drittel des Rumpfes und 1-2 cm von jeder Seite der Wirbelsäule entfernt vorgenommen. Das Fettgewebe wurde mit einer Pinzette vorsichtig herausgezogen. Der Eierstock wurde identifiziert, und die Uterushörner wurden ligiert. Der Eierstock wurde entfernt, und der Bauchschnitt wurde vernäht. In der Scheingruppe wurde der Bauch ohne OVX eingeschnitten.
Die Behandlung wurde zwei Wochen nach der OVX-Operation begonnen und dauerte sechs Wochen lang. Die Ratten in den XYS-Behandlungsgruppen erhielten XYS über eine Schlundsonde in einer täglichen Einzeldosis von 9 g/kg oder 3 g/kg. Die subkutane Injektion von E2 (2 μg/kg) diente als positive Arzneimittelkontrolle. Die Verabreichung von 1 ml Kochsalzlösung (0,9 %) diente als Placebo-Kontrolle. Die XYS-Abkochung wurde in Form eines Extrakts (1 g/ml, entspricht 1 g rohe Kräuter/ml) verwendet, der vom angegliederten Krankenhaus der Nanjing-Universität für traditionelle chinesische Medizin zur Verfügung gestellt wurde. Die Formel für die XYS-Abkochung wurde in einem wertvollen Bericht veröffentlicht. Die in der Klinik für Frauen in den Wechseljahren verwendete Dosis von XYS beträgt 175 g rohe Kräuter/60 kg, was bei Ratten 3,5 g/kg entspricht. Unter Bezugnahme auf andere experimentelle Berichte über das Rattenmodell haben wir die niedrige Dosis auf 3 g/kg und die hohe Dosis auf 9 g/kg festgelegt. E2-Pulver (Kat. Nr. E2758, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) wurde in einer kleinen Menge Ethanol aufgelöst, und dann wurde eine 20 μg/ml-Lösung mit 0,9%iger Kochsalzlösung hergestellt.
2.2. Morris-Wasserlabyrinth-Test
Die Lern- und Gedächtnisfunktion von Ratten wurde mit dem Morris-Wasserlabyrinth-Test (MWM) untersucht. Das MWM-Versuchsgerät ist ein rundes Becken (200 cm Durchmesser) mit 38-40 cm hohem Wasser. Die Wassertemperatur wird konstant auf 20-22°C gehalten. Der WMW-Test besteht aus drei Teilen, nämlich dem Versuch zur räumlichen Erfassung (Dauer: 5 Tage), dem Versuch zur räumlichen Erkundung und dem Versuch mit der sichtbaren Plattform. In der Raumerfassungsprüfung wurden die Ratten vorsichtig in einen zufälligen Quadranten des Wassertanks gesetzt, wobei die Plattform 1,5 cm im nordöstlichen Quadranten unter dem Wasser versteckt war. Jede Ratte durfte bis zu 60 Sekunden lang schwimmen, um die Plattform zu finden. Ratten, die die Plattform nicht innerhalb von 60 s fanden, wurden zu ihr geführt, und die Latenzzeit wurde als 60 s aufgezeichnet. Die Fluchtlatenz wurde mit einem Videoanalysesystem (ANY-maze Animal Behavior Analysis System, Stoelting Company, USA) aufgezeichnet. Die Ratten wurden 4 Mal pro Tag trainiert. Nach 5 Tagen Training erhielten die Ratten den räumlichen Probeversuch, wobei die Plattform aus dem nordöstlichen Quadranten entfernt wurde. Die Ratten wurden an denselben Startort im nordwestlichen Quadranten gesetzt. Die Laufspuren der Ratten bei der Suche nach der Plattform in 120 s wurden aufgezeichnet. Die Dauer und die Kreuzungszeiten im Zielquadranten wurden berechnet, um die Beibehaltung des räumlichen Gedächtnisses zu bewerten. Am nächsten Tag nach dem räumlichen Probeversuch erhielten die Ratten den Versuch mit der sichtbaren Plattform, ähnlich dem Training mit der versteckten Plattform, bei dem die Plattform 1,5 cm über die Wasseroberfläche angehoben und im südwestlichen Quadranten platziert wurde. Jede Ratte wurde 4 Mal freigelassen, und zwar jedes Mal von einem anderen Einstiegspunkt aus. Die Fluchtlatenz, die Schwimmstrecke und die Schwimmgeschwindigkeit wurden aufgezeichnet.
2.3. Probenentnahme
Nach Beendigung des MWM-Tests wurden die Ratten thorakotomiert und unter Narkose mit Natrium-Pentobarbital (40 mg/kg über eine intraperitoneale Injektion) in die aufsteigende Aorta über den linken Ventrikel intubiert. Rumpfblut wurde mit einem Serumseparatorröhrchen zum Nachweis von E2 entnommen. Die Hippocampi von sechs Ratten wurden von der Großhirnrinde und dem umgebenden Hirngewebe getrennt, schnell entfernt, mit kaltem PBS gewaschen und in flüssigem Stickstoff für den Nachweis von E2 und den Western Blot eingefroren. Drei nicht durchblutete Hirngewebe wurden 24 Stunden lang in 4 % Paraformaldehyd immobilisiert und für die Golgi-Färbung und Immunhistochemie verwendet. Die linken drei Ratten wurden transkardial mit kalter Kochsalzlösung perfundiert und anschließend 1 Stunde lang in 4%igem Paraformaldehyd fixiert. Die Gehirne wurden dann entnommen, 24 Stunden lang in 4%igem Paraformaldehyd fixiert und für die TUNEL-Färbung in Paraffin eingebettet.
2.4. E2-Nachweis
Blutproben wurden bei Raumtemperatur gerinnen gelassen und 15 Minuten lang bei 4°C zentrifugiert, um das Serum abzutrennen. Das Hippocampus-Gewebe wurde gewogen, in kalter Kochsalzlösung homogenisiert und 20 Minuten lang zentrifugiert, um den Überstand aufzufangen. Der E2-Gehalt im Serum und Überstand des Hippocampus-Homogenats wurde mit einem ELISA-Kit (Shanghai Enzyme-linked Biotechnology Co. Ltd., Shanghai, China) nachgewiesen.
2.5. Golgi-Färbung
Der Hippocampus wurde in kleine Blöcke geschnitten und für die Golgi-Färbung wie beschrieben bearbeitet. Die Hippocampusblöcke wurden 14 Tage lang in Golgi-Färbelösung (Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd., Shanghai, China) eingelegt, wobei die Färbelösung alle 2-3 Tage ausgetauscht wurde. Die Gewebe wurden mit 30 %iger Saccharose dehydriert und in 100 μm große Schnitte geschnitten. Die Schnitte wurden mit Ethanol dehydriert, mit Xylol geklärt und auf mit Gelatine beschichtete Objektträger aufgezogen. Die Golgi-Färbung wurde bei allen Proben erfolgreich durchgeführt. Die Morphologie der Neuronen im Hippocampus wurde unter dem Lichtmikroskop (Nikon, Tokio, Japan) beobachtet. Die Neuronen in der CA1-Region des Hippocampus wurden mit Hilfe des Neuron J-Plug-ins in der Image J-Software analysiert. Für jede Ratte wurden fünf Abschnitte ausgewählt, und für jeden Abschnitt wurden dendritische Stacheln mit vollständiger Morphologie ausgewählt. Die Dichte und die Verzweigungspunkte der dendritischen Stacheln wurden gemessen.
2.6. Immunhistochemie
Die Expression der N-Methyl-D-Aspartat-Rezeptor (NMDAR)-Untereinheiten 2A und 2B im Hippocampus wurde mittels Immunhistochemie nach dem Standardverfahren bestimmt. Als primäre Antikörper wurden Kaninchen Anti-NMDAR2A (1 : 200, Boster Biological Technology, Wuhan, China) und Kaninchen Anti-NMDAR2B (1 : 400, Servicebio Technology Co., Ltd., Wuhan, China) verwendet. Der sekundäre Antikörper war HRP-konjugiertes Kaninchen-IgG (Servicebio).
2.7. TUNEL-Färbung
Die morphologischen Veränderungen im Hippocampus wurden durch TUNEL-Färbung mit einem handelsüblichen Kit (Roche, Mannheim, Deutschland) nach Anweisung nachgewiesen. Die Schnitte wurden einer kolorimetrischen DAB-Reaktion unterzogen, gefolgt von einer Hämatoxylin-Färbung. Die Kerne der TUNEL-positiven apoptotischen Zellen waren unter dem Lichtmikroskop braun. Für jede Ratte wurden fünf Schnitte ausgewählt, und für jeden Schnitt wurden drei nicht repetitive Felder (400-fache Vergrößerung) ausgewählt. Der Prozentsatz der TUNEL-positiven Zellen in allen Zellen wurde berechnet.
2.8. Western Blot
Der hippocampale CA1-Gehirnteil wurde schnell extrahiert und gemäß dem Hirnatlas in kleine Schnitte geschnitten. Hippocampus-Gewebe wurde über Nacht mit RIPA-Lysepuffer (mit 100 Mm PMSF, erworben von Servicebio) inkubiert. Die Zelltrümmer wurden durch 10-minütiges Zentrifugieren entfernt, um den proteinhaltigen Überstand aufzufangen. Die Proteinkonzentration wurde mit dem BCA-Protein-Assay-Kit (Pierce, Rockford, IL, USA) bestimmt. Die Proteinlysate (30 μg/Linie) wurden durch 10%ige SDS-PAGE aufgetrennt und auf eine PVDF-Membran geblottet. Nach Blockierung mit 5% fettfreier Milch wurde die Membran über Nacht mit den folgenden primären Antikörpern sondiert: Kaninchen-anti-NMDAR2A (1 : 500, Millipore, Billerica, MA, USA), Kaninchen-anti-NMDAR2B (1 : 2000, Millipore), Kaninchen-anti-CYP19 (1 : 1000, Abcam, Cambridge, UK), Kaninchen-anti-ERα (1 : 2000, Millipore), Kaninchen anti-phospho-ERα (Ser118, 1 : 2000, Millipore), Kaninchen anti-phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K) 110β (1 : 1000, Millipore), Kaninchen anti-Bax (1 : 1000, Abcam), Kaninchen anti-Bcl-2 (1 : 1000, Abcam) und Kaninchen anti-GAPDH (1 : 1000, Bioworld Technology, Louis Park, MN, USA). GAPDH wurde als interne Kontrolle nachgewiesen. Anschließend wurde die Membran 1,5 h lang mit sekundärem Meerrettichperoxidase- (HRP-) konjugiertem Ziegen-Anti-Kaninchen-IgG (1 : 5000, Bioworld) sondiert. Die Banden wurden mit der Chemilumineszenzmethode sichtbar gemacht. Die mittlere optische Dichte der Proteinbanden wurde mit der Software Image J quantifiziert.
2.9. Statistische Analyse
Die Versuchsdaten wurden mit der Software GraphPad Prism 5 (San Diego, CA, USA) ausgewertet. Die numerischen Daten wurden als Mittelwert ± SD ausgedrückt. Der Unterschied zwischen zwei Gruppen wurde mit dem t-Test verglichen. Die Ergebnisse des Versuchs mit der versteckten Plattform wurden mittels ANOVA mit wiederholten Messungen Gruppe × Tag und Tukey’s post hoc analysiert. Andere Mehrfachvergleiche wurden mittels einseitiger ANOVA und Tukey’s post hoc analysiert. Der Wert < 0,05 wurde als statistisch signifikant angesehen.
3. Ergebnisse
3.1. Xiao-Yao-San Dekokt verbessert die räumlichen Lern- und Gedächtnisfähigkeiten von ovariektomierten Ratten
Die Lernfähigkeit wurde zunächst anhand des räumlichen Erfassungsversuchs bewertet. Die ANOVA mit wiederholten Messungen zeigte, dass sowohl die Behandlung als auch die Trainingstage die Fluchtlatenz beeinflussten (Abbildung 1(a)). Die Fluchtlatenz verringerte sich in allen Gruppen mit der Zunahme der Trainingstage (), und der Unterschied war auch im Trend der Latenzverringerung innerhalb jeder Gruppe signifikant (). Es gab keine Wechselwirkung zwischen der Behandlung und den Trainingstagen (). An den ersten beiden Trainingstagen wurde kein signifikanter Unterschied in der Fluchtlatenz der einzelnen Gruppen festgestellt. Ab dem dritten Trainingstag war die Fluchtlatenz signifikant länger als die der Scheingruppe; die Fluchtlatenz der E2- und hochdosierten XYS9-Gruppe war kürzer als die der Kochsalzgruppe, unterschied sich aber nicht von der der Scheingruppe. Nach 5 Tagen Training wurden die Ratten mit dem Probeversuch auf ihr räumliches Gedächtnis hin untersucht. Wie in Abbildung 1(b) dargestellt, waren die Kreuzungszeiten, die Dauer und der prozentuale Anteil der Dauer im Probequadranten in der Kochsalzlösungsgruppe signifikant reduziert. Bei der Dauer in den anderen Quadranten wurde kein Unterschied festgestellt. Durch die Behandlung mit XYS oder E2 konnten die Kreuzungszeiten und die Dauerzeiten im Sondenquadranten signifikant auf das Niveau der Scheingruppe zurückgeführt werden. Um die Auswirkungen von Umweltfaktoren sowie des kognitiven und Aktivitätsniveaus der Versuchstiere auf das räumliche Lernen und Gedächtnis auszuschließen, wurden die Ratten auch dem Versuch mit der sichtbaren Plattform unterzogen (Abbildung 1(c)). Es gab keinen signifikanten Unterschied zwischen den Gruppen in Bezug auf die Fluchtlatenz, die Schwimmstrecke und die Schwimmgeschwindigkeit. Zusammengenommen deuten diese Ergebnisse darauf hin, dass das räumliche Lernen und Gedächtnis bei OVX-Ratten beeinträchtigt waren und eine hochdosierte XYS-Behandlung die beeinträchtigten kognitiven Funktionen wirksam verbessern konnte.
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3.2. Xiao-Yao-San Dekokt erhöht den Östrogengehalt im Hippocampus bei ovariektomierten Ratten
Als nächstes untersuchten wir die Wirkung von XYS auf den Östrogenspiegel bei OVX-Ratten. Wie in Abbildung 2(a) gezeigt, verbesserte die XYS-Behandlung nicht den durch OVX verringerten Serum-Östradiolspiegel; es gab jedoch keinen signifikanten Unterschied im Serum-Östradiolspiegel zwischen den Schein- und OVX-Behandlungsgruppen. Bemerkenswert ist, dass hochdosiertes XYS und E2 den Östradiolspiegel im Hippocampus im Vergleich zur Kochsalzlösung erhöhten (Abbildung 2(b)). In der O-XYS3-Gruppe war der Östradiolspiegel im Hippocampus immer noch niedriger als in der Sham-Gruppe. Die Veränderung des E2-Gehalts im Hippocampus lässt sich möglicherweise nicht durch die Veränderung des E2-Gehalts in den Keimdrüsen, sondern durch die Veränderung der In-situ-Synthese erklären. Deshalb haben wir die Expression von CYP19, dem letzten Enzym der Östrogensynthese, im Hippocampus bestimmt. Die Ergebnisse zeigten, dass die Behandlung mit XYS oder E2 die Expression von CYP19 im Vergleich zur Kochsalzgruppe erhöhen konnte (), aber nur der Unterschied zwischen der hochdosierten XYS- und Kochsalzgruppe war signifikant (). Durch die Behandlung wurde der CYP19-Spiegel nicht wieder auf den der Scheingruppe angehoben. Die Ergebnisse deuten darauf hin, dass XYS die Expression von Aromatase im Hippocampus förderte und damit die De-novo-Synthese von E2 erhöhte.
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3.3. Xiao-Yao-San Dekokt reduziert neuronale Schäden im Hippocampus von ovariektomierten Ratten
Die Zellmorphologie im Hippocampus, insbesondere in der CA1-Region, spielt eine wichtige Rolle für die kognitiven Fähigkeiten. Die Zellmorphologie im Hippocampus wurde durch Golgi-Färbung analysiert, wie in Abbildung 3(a) dargestellt. Im Vergleich zur Scheingruppe nahm die Zahl der Neuronen in der Kochsalzgruppe deutlich ab, und die Morphologie der dendritischen Dornen war beschädigt. Eine weitere Analyse der CA1-Neuronen zeigte, dass die Punktzahl der Neuronen und die Dichte der dendritischen Stacheln in der Kochsalzlösungsgruppe signifikant abnahm (Abbildungen 3(b) und 3(c)). Eine hochdosierte XYS-Behandlung erhöhte die Zahl der Neuronen im Hippocampus und steigerte die Punktzahl der Neuronen und die Stacheldichte in der CA1-Region. Die Behandlung mit E2 hatte die gleiche therapeutische Wirkung wie hochdosiertes XYS. XYS in niedriger Dosierung führte jedoch nicht zu einer wirksamen Verbesserung der neuronalen Schäden in der CA1-Region des Hippocampus. Folgerichtig wurde die Apoptose von Hippocampus-Neuronen (CA1, CA3, DG) durch eine hochdosierte XYS- oder E2-Behandlung reduziert (Abbildung 4). Eine niedrige XYS-Dosis konnte jedoch nur die Apoptose von CA3-Neuronen reduzieren, hatte aber keine Wirkung auf CA1- und DG-Neuronen. Insgesamt konnte eine hohe XYS-Dosis die neuronalen Schäden im Hippocampus, insbesondere in der CA1-Region, reduzieren.
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Xiao-Yao-San-Abkochung erhöht die Expression von NMDAR2A und NMDAR2B im Hippocampus bei ovariektomierten Ratten.
Synaptische Plastizität ist die neurobiologische Grundlage für Langzeitlernen und -gedächtnis, und die Leistung im MWM-Test wird durch die NMDAR-Funktion beeinflusst. Daher haben wir die Expression der NMDAR-Untereinheiten 2A und 2B im CA1 des Hippocampus weiter untersucht. Western Blot (Abbildungen 5(a) und 5(b)) zeigte, dass die Expression von NMDAR2A und NMDAR2B bei OVX-Ratten reduziert war. Die Behandlung mit XYS oder E2 erhöhte die Expression dieser beiden Proteine signifikant auf das gleiche Niveau wie in der Scheingruppe. Die Immunhistochemie (Abbildung 5(c)) zeigte ebenfalls, dass der Anteil der positiv gefärbten Zellen in den Behandlungsgruppen zunahm. Im Vergleich zur Kochsalzlösungsgruppe erhöhte XYS in hoher Dosierung signifikant die Expression von NMDAR2A und NDMAR2B ( bzw. 0,013), während XYS in niedriger Dosierung nur die Expression von NMDAR2A signifikant erhöhen konnte ().
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3.4. Xiao-Yao-San-Abkochung aktiviert PI3K-Signalweg durch ERα
Die Wirkung von E2 oder Phytoöstrogenen auf die Physiologie wird durch ER-Signalisierung vermittelt. Studien haben gezeigt, dass die Aktivierung der extrazellulären signalregulierten Kinase (ERK), einer mitogen-aktivierten Proteinkinase, für die positiven Auswirkungen von E2 auf das Gedächtnis notwendig ist. Die Phosphorylierung von ERK1/2 ist abhängig von der Aktivierung von PI3K. Daher untersuchten wir die Wirkung von XYS auf die ER-PI3K-Signalübertragung. Wie in Abbildung 6 dargestellt, förderten hochdosiertes XYS und E2 die Expression von ERα, phosphoryliertem ERα (Ser118) und PI3K p110β (die katalytische Untereinheit) im Vergleich zur Kochsalzgruppe signifikant. Die Aktivierung von ERα-PI3K verringerte außerdem die Expression des proapoptotischen Faktors Bax und erhöhte die Expression des antiapoptotischen Faktors Bcl-2. Niedrig dosiertes XYS hatte jedoch keinen signifikanten Einfluss auf die ERα-PI3K-Signalisierung, was mit den Ergebnissen der Abbildungen 3 und 4 übereinstimmt.
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4. Diskussion
XYS wird seit langem zur Behandlung von Angstzuständen und Depressionen in der Perimenopause eingesetzt. Unsere Studie untersuchte die neue Anwendung von XYS bei der Behandlung von OVX-induzierten kognitiven Beeinträchtigungen. Die Ergebnisse zeigten, dass XYS das räumliche Lernen und das räumliche Gedächtnis bei OVX-Ratten wirksam verbesserte. Der mögliche Mechanismus besteht darin, dass XYS die De-novo-Synthese von Östrogen im Hippocampus fördert, wodurch der ERα-PI3K-Signalweg aktiviert und die Apoptose von Hippocampus-Neuronen gehemmt wird.
Der zugrundeliegende Mechanismus von XYS für die Behandlung von Depressionen wurde ausgiebig untersucht. XYS spielt eine antidepressive Rolle, indem es ein umfassendes Netzwerk von Neurotransmittern, Neurotrophinen, der Hypothalamus-Hypophysen-Nebennieren-Achse, Aminosäuren und Lipiden reguliert. Einige dieser Studien haben gezeigt, dass XYS auf stressbedingte Veränderungen im Gehirn einwirken kann. In-vitro-Tests haben gezeigt, dass ein XYS-haltiges Serum die durch oxidativen Stress hervorgerufenen Veränderungen des mitochondrialen Membranpotenzials, der Konzentration von freiem Kalzium und der Apoptoserate von Neuronen umkehren kann. Unsere Studie zeigte, dass XYS auch die neuronale Apoptose in der Hippocampusregion von OVX-Ratten abschwächte. Die antiapoptotischen Wirkungen von XYS deuten darauf hin, dass es das Potenzial hat, auf eine Vielzahl von pathologischen Prozessen im Zusammenhang mit der neuronalen Apoptose im Gehirn einzuwirken.
Die Ergebnisse unserer Studie zeigten, dass XYS den Östrogenspiegel im Hippocampus von OVX-Ratten wiederherstellen konnte. Der Hippocampus ist für die Gedächtnisbildung wichtig und reich an ERs, und Östrogen fördert über diese ERs eine bessere kognitive und synaptische Gesundheit. Mehrere klinische Studien wiesen auf die Wirksamkeit einer Hormonersatztherapie bei kognitiven Symptomen im Zusammenhang mit einem Östrogenverlust bei Frauen hin. XYS konnte den Östradiolspiegel im Hippocampus erhöhen, was die entscheidende Grundlage für seine Wirksamkeit bei der Verbesserung der kognitiven Fähigkeiten von OVX-Ratten sein dürfte. Der Serum-Östradiolspiegel wurde durch XYS jedoch nicht erhöht. Dies könnte darauf zurückzuführen sein, dass Östradiol im Hippocampus de novo synthetisiert werden kann, während Serum-Östradiol aus den Keimdrüsen stammt. Unsere Ergebnisse zeigten, dass XYS die Expression von CYP19 im Hippocampus erhöhte, was darauf schließen lässt, dass das erhöhte E2 im Gehirn wahrscheinlich aus dem Hippocampus stammt. Die Ergebnisse unserer Studie zeigten, dass XYS die Expression von NMDAR2A und NMDAR2B im Hippocampus von OVX-Ratten erhöhte. Dieses Ergebnis stimmt mit früheren Studien überein. Es wurde festgestellt, dass Östrogen sowohl die Dichte der dendritischen Stacheln als auch die Anzahl der Synapsen im Hippocampus durch Modulation der NMDAR-Funktionen bei OVX-Ratten erhöht. Östrogen konnte auch die Morphologie der Neuronen im Hippocampus bei gealterten Ratten wiederherstellen, indem es die NMDAR2B-Konzentration in der CA1-Region auf das Niveau junger Ratten zurückführte; darüber hinaus kann Östrogen die Mobilität von NMDAR2A und NMDAR2B an der Synapse beeinflussen. Die Aktivierung von NMDAR wiederum könnte zur Synthese von E2 im Hippocampus beitragen, indem es den Ca2+-Einstrom induziert.
Neben den NMDARs reguliert XYS möglicherweise die Expression anderer kognitionsbezogener Faktoren im Gehirn. Der Verlust des postsynaptischen Dichteproteins 95 (PSD-95), des Synaptophysins und des neurotrophen Faktors des Gehirns (BDNF) im Hippocampus wurde direkt mit Lern- und Gedächtnisdefiziten in Verbindung gebracht. Die Wirkung von XYS bei CIS-Ratten wurde mit der Förderung der Expression von PSD-95 und Synaptophysin im Hippocampus in Verbindung gebracht. Es wurde auch gezeigt, dass XYS den BDNF im frontalen Kortex, in der CA1-Region des Hippocampus und in der Amygdala von CIS-Ratten hochreguliert. Während der CIS-Behandlung mit XYS wurde der c-Jun N-terminale Kinase (JNK)-Signalweg im Hippocampus gehemmt.
Obwohl wir nicht spezifisch untersucht haben, welche Komponente die wichtigste aktive Komponente von XYS auf Lernen und Gedächtnis ist, deuten unsere Ergebnisse darauf hin, dass die Hauptquelle der Phytoöstrogene in XYS ein Kandidat ist, der weitere Untersuchungen verdient. Die Erforschung von Antidepressiva kann uns ebenfalls einige Hinweise liefern. Jiali Liu et al. entdeckten, dass Bupleuri radix (Chaihu) das wichtigste Antidepressivum in der XYS-Verordnung ist, basierend auf der pharmakochemischen Analyse der Petroletherfraktion im Serum. Eine In-vitro-Studie zeigte, dass der Extrakt aus Bupleuri radix die Proliferation von Neuroblastomzellen durch die Aktivierung des PI3K/AKt-Signalwegs fördert. Die Aktivierung von PI3K wurde auch in unserer Studie beobachtet.
Aktuelle klinische Berichte zeigen, dass XYS eine signifikante antidepressive therapeutische Wirkung hat, aber es gibt keine klare toxikologische Studie über die Toxizität und die Nebenwirkungen von XYS im Detail. Im Allgemeinen kann XYS als ein verschreibungspflichtiges Medikament ohne allzu viele Nebenwirkungen betrachtet werden. Für XYS gibt es mehrere modifizierte Rezepturen, deren Grundbestandteile die gleichen sind wie XYS. In einer kürzlich durchgeführten Meta-Analyse wurden die Wirksamkeit und Sicherheit von modifiziertem XYS bei der Behandlung des perimenopausalen Syndroms bewertet. Die zusammengefassten Ergebnisse deuten darauf hin, dass modifiziertes XYS bei der Behandlung des perimenopausalen Syndroms im Vergleich zur Hormonersatztherapie wirksamer und sicherer sein könnte. Aufgrund der unzureichenden Methodik der eingeschlossenen Studien müssen die Wirksamkeit und Sicherheit von XYS jedoch durch weitere strenge Studien bestätigt werden. Unter Verwendung der 1H-Kernspinresonanzmethode (NMR) berichtete die Forschungsgruppe von Xiaoxia Gao, dass die Petroletherfraktion, die lipophile Bestandteile enthält, die wirksamste Fraktion zur Behandlung von Depressionen ist. Sie berichteten auch, dass Bupleuri Radix, die wichtigste antidepressive Komponente, in der Leber oder den Nieren gesunder Ratten mehr toxische Wirkungen hervorrufen konnte als bei Ratten mit chronischem, unvorhersehbarem mildem Stress. Die toxischen Wirkungen waren mit einer erhöhten Gallensäurekonzentration, einer Erleichterung des Lysinabbaus und einer Störung des Stoffwechsels von Sphingolipid, Glycerophospholipid und Fettsäuren verbunden. Dieses Ergebnis wurde in einer kürzlich durchgeführten Metabolom-Studie an Patienten mit Depressionen bekräftigt. XYS spielte eine antidepressive Rolle, indem es die Synthese von Leucin, Valin und Isoleucin sowie den Stoffwechsel von Binärsäure, Fettsäure, Argin und Prolin regulierte. Diese Studien legen nahe, dass es notwendig ist, den Zustand des Patienten genau zu überwachen und die Medikamentendosis rechtzeitig anzupassen, um toxische Nebenwirkungen zu vermeiden.
5. Schlussfolgerungen
In dieser Studie haben wir gezeigt, dass eine hochdosierte XYS-Behandlung eine ähnliche Wirksamkeit wie E2 bei der Verbesserung der kognitiven Fähigkeiten von OVX-Ratten hat. Die therapeutische Wirkung wurde durch den Schutz der Neuronen des Hippocampus und die Wiederherstellung des E2-Spiegels im Hippocampus vermittelt. Der ERα-PI3K-Signalweg war an diesem Prozess beteiligt. Unsere Studie legt nahe, dass XYS eine Option für die Behandlung von kognitiven Beeinträchtigungen in der Perimenopause sein könnte. Gegenwärtig wird XYS hauptsächlich zur Behandlung von klinischen Angstzuständen und Depressionen eingesetzt. Weitere klinische Daten sind erforderlich, um seine Wirkung auf die Verbesserung der kognitiven Funktion zu überprüfen.
Datenverfügbarkeit
Die Daten, die zur Untermauerung der Ergebnisse dieser Studie verwendet wurden, sind auf Anfrage bei den entsprechenden Autoren erhältlich.
Interessenkonflikte
Die Autoren erklären, dass sie keine Interessenkonflikte in irgendeiner Form haben.
Beiträge der Autoren
Lina Liu und Fei Ge haben zu gleichen Teilen zu dieser Studie beigetragen.
Anerkennungen
Diese Studie wurde von der National Natural Science Foundation of China (Grant nos. 81603578, 81503536, 81673795 und 81903974); die Natural Science Foundation of Jiangsu Province (Grant no. BK20181235); das Jiangsu Provincial Bureau of Traditional Chinese Medicine (Grant no. YB2017066); das Nanjing Science and Technology Development Plan Project (Grant no. 201715072); das Projekt des Krankenhauses für Chinesische Medizin der Provinz Jiangsu (Zuschuss Nr. Y2018CX09); und ein Projekt, das durch die vorrangige akademische Programmentwicklung der Hochschulen von Jiangsu finanziert wird.