Wie funktioniert die Ionenaustauschchromatographie?

Ionenaustauschchromatographie (IEX) ist eine Technik, die häufig bei der Reinigung von Biomolekülen eingesetzt wird. Dabei werden Moleküle auf der Grundlage ihrer Ladung getrennt.

Diese Technik nutzt die Wechselwirkung zwischen geladenen Molekülen in einer Probe und entgegengesetzt geladenen Bestandteilen in der stationären Phase der Chromatographiematrix. Diese Art der Trennung ist mit anderen Techniken schwierig, da die Ladung durch den pH-Wert des verwendeten Puffers leicht manipuliert werden kann.

Es gibt zwei Arten der Ionenaustausch-Trennung – Kationenaustausch und Anionenaustausch. Beim Anionenaustausch ist die stationäre Phase positiv geladen, während sie beim Kationenaustausch negativ geladen ist.

Prinzip der Ionenaustauschchromatographie

IEX-Chromatographie wird zur Trennung geladener Biomoleküle verwendet. Die rohe Probe, die geladene Moleküle enthält, wird als flüssige Phase verwendet. Beim Durchlaufen der Chromatographiesäule binden die Moleküle an entgegengesetzt geladene Stellen in der stationären Phase.

Die aufgrund ihrer Ladung getrennten Moleküle werden mit einer Lösung unterschiedlicher Ionenstärke eluiert. Indem eine solche Lösung durch die Säule geleitet wird, findet eine hochselektive Trennung der Moleküle entsprechend ihrer unterschiedlichen Ladungen statt.

Die Technik

Die wichtigsten Schritte im Verfahren der Ionenaustauschchromatographie sind im Folgenden aufgeführt:

• Eine unreine Proteinprobe wird bei einem bestimmten pH-Wert in die Ionenaustauschchromatographiesäule geladen.
• Geladene Proteine binden sich an die entgegengesetzt geladenen funktionellen Gruppen im Harz
• Ein Salzgradient wird zur Elution der getrennten Proteine verwendet. Bei niedrigen Salzkonzentrationen werden Proteine mit wenigen geladenen Gruppen eluiert, bei höheren Salzkonzentrationen werden Proteine mit mehreren geladenen Gruppen eluiert.
• Unerwünschte Proteine und Verunreinigungen werden durch Waschen der Säule entfernt.

Ein pH-Gradient kann auch verwendet werden, um einzelne Proteine auf der Grundlage ihres isoelektrischen Punkts (pI) zu eluieren, d. h. des Punkts, an dem die Aminosäuren in einem Protein eine neutrale Ladung tragen und daher in einem elektrischen Feld nicht wandern. Da es sich bei Aminosäuren um ionische Zwitterverbindungen handelt, enthalten sie Gruppen mit positiven und negativen Ladungen. Je nach pH-Wert der Umgebung sind die Proteine positiv, negativ oder gar nicht geladen. An ihrem isoelektrischen Punkt interagieren sie nicht mit den geladenen Bestandteilen des Säulenharzes und werden daher eluiert. Ein abnehmender pH-Gradient kann verwendet werden, um Proteine mit einem Anionenaustauscherharz zu eluieren, und ein ansteigender pH-Gradient kann verwendet werden, um Proteine von Kationenaustauscherharzen zu eluieren. Der Grund dafür ist, dass eine Erhöhung des Puffer-pH-Wertes der mobilen Phase dazu führt, dass das Protein weniger protoniert (weniger positiv geladen) wird, so dass es keine ionische Wechselwirkung mit dem negativ geladenen Harz eingehen kann, was eine Elution ermöglicht. Umgekehrt bewirkt ein Absenken des pH-Werts der mobilen Phase, dass das Molekül stärker protoniert (weniger negativ geladen) wird, was seine Elution ermöglicht.

Harzauswahl in der Ionenaustauschchromatographie

Ionenaustauschharze haben positiv oder negativ geladene funktionelle Gruppen, die kovalent an eine feste Matrix gebunden sind. Die Matrizen bestehen in der Regel aus Cellulose, Polystyrol, Agarose und Polyacrylamid. Einige der Faktoren, die die Wahl des Harzes beeinflussen, sind der Anionen- oder Kationenaustauscher, die Durchflussrate, der schwache oder starke Ionenaustauscher, die Partikelgröße des Harzes und die Bindungskapazität. Die Stabilität des interessierenden Proteins diktiert die Auswahl eines Anionen- oder Kationenaustauschers – beide Austauscher können verwendet werden, wenn die Stabilität keine Rolle spielt.

Die Anwendungen der Ionenaustauschchromatographie

Der Ionenaustausch ist die am weitesten verbreitete chromatographische Methode für die Trennung und Reinigung von geladenen Biomolekülen wie Polypeptiden, Proteinen, Polynukleotiden und Nukleinsäuren. Die weit verbreitete Anwendbarkeit, die hohe Kapazität und Einfachheit sowie die hohe Auflösung sind die Hauptgründe für ihren Erfolg als Trennmethode. Die Ionenaustauschchromatographie ist in verschiedenen industriellen Anwendungen weit verbreitet, von denen einige wie folgt sind:

• Trennung und Reinigung von Blutbestandteilen wie Albumin, rekombinanten Wachstumsfaktoren und Enzymen.
• Biotechnologie – Analytische Anwendungen wie Qualitätskontrolle und Prozessüberwachung
• Lebensmittel- und klinische Forschung – zur Untersuchung von Weizensorten und der Korrelation von Proteinurie mit verschiedenen Nierenerkrankungen.
• Fermentation – Kationenaustauscherharze werden zur Überwachung des Fermentationsprozesses bei der Herstellung von ß-Galaktosidase verwendet.

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