Biol Res 41: 197-204, 2008
ARTICLE
Differences in lipogenesis and lipolysis in obese and non-obese adult human adipocytes
MARIANA CIFUENTES, CECILIA ALBALA and CECILIA V ROJAS
Institute of Nutrition and Food Technology (INTA), Universidad de Chile, Santiago, Chile.
Dirección para Correspondencia
ABSTRACT
Es wurde vorgeschlagen, dass Unterschiede in der Adipozytenfunktion und/oder im Metabolismus zwischen fettleibigen und mageren Individuen sich in funktionellen Anomalien des Fettgewebes manifestieren können, die zu Stoffwechselstörungen bei Adipositas führen. Wir untersuchten die Lipogenese und Lipolyse von omentalen Adipozyten von adipösen (OB) und nicht adipösen (NOB) Menschen. Die spezifische Aktivität des lipogenen Markerenzyms G3PDH war in den Gesamtadipozyten von OB im Vergleich zu denen von NOB-Personen um 50 % niedriger. Omentale Adipozyten von OB-Teilnehmern wiesen auch niedrigere basale lipolytische Levéis und eine geringere lipolytische Reaktion auf einen p-adrenergen Stimulus auf. Der Cholesterinabbau an der Plasmamembran der Adipozyten mit Hilfe von Methyl-β-Cyclodextrin verursachte eine lipolytische Wirkung auf die Adipozyten beider Gruppen zusammen, aber wenn fettleibige und schlanke Probanden getrennt analysiert wurden, war die Reaktion nur bei den Fettleibigen signifikant. Wir präsentieren Beweise für ein unterschiedliches lipogenes und lipolytisches Profil in den omentalen Adipozyten adipöser Individuen und schlagen eine relevante Rolle des Cholesterins in der Plasmamembran vor, wobei sich die Auswirkungen seiner Entfernung in der Lipolyse von OB- und NOB-Adipozyten unterscheiden.
Schlüsselbegriffe: Adipozyt, Cholesterin, Lipogenese, Lipolyse, Fettleibigkeit, Triglycerid-Stoffwechsel.
EINFÜHRUNG
Der Überschuss an viszeralem Fettgewebe wird mit zahlreichen Gesundheitsproblemen in Verbindung gebracht. Eine erhöhte Adipositas ist mit einem vergrößerten Fettzellvolumen verbunden. So weisen fettleibige Personen im Vergleich zu schlanken Personen eine relativ große Menge an hypertrophen Fettzellen auf. Studien an tierischen und menschlichen Fettzellen haben ergeben, dass mehrere Stoffwechselfunktionen von Adipozyten mit einer größeren Zellgröße verändert werden, z. B. die Insulinsensitivität und der Glukosestoffwechsel, aber auch die Adipokinsekretion und die Genexpressionsprofile (Bluher et al., 2004; Salans und Doherty, 1971; Salans et al., 1974; Smith, 1971; Yang et al., 2004). Dies hat zu der Vermutung geführt, dass die funktionelle Vorherrschaft von hypertrophen und/oder stoffwechselgestörten Zellen im Fettgewebe ein wichtiger kausaler Effekt für eine geringe Reaktion des Gewebes auf homöostatische Signale ist und somit den fettleibigen Zustand aufrechterhält oder verschlimmert. Um diese Hypothese zu überprüfen, haben wir die Lipogenese und Lipolyse in isolierten omentalen Adipozyten von adipösen und nicht adipösen Erwachsenen in vitro untersucht. In Anbetracht der Tatsache, dass die Lipolyse-Signalisierung von Proteinen abhängt, die sich in Caveolae befinden, und dass eine Störung der Organisation dieser cholesterinreichen Strukturen mit metabolischen Veränderungen in adipösen Adipozyten in Verbindung gebracht wurde (Le Lay et al., 2004), haben wir auch die Auswirkungen der Entfernung von Cholesterin aus der Plasmamembran mittels Methyl-(β-Cyclodextrin) (M(βCD)) auf die Lipolyse von OB- und NOB-Adipozyten untersucht.
Die vorliegenden Ergebnisse unterstreichen ein unterschiedliches lipogenes und lipolytisches Profil zwischen schlanken und fettleibigen Personen. Unsere Daten belegen die metabolische Relevanz des geringeren Cholesteringehalts der Plasmamembran in Adipozyten fettleibiger Personen, der die physiologische Regulierung der Lipolyse beeinflusst.
MATERIALIEN UND METHODEN
Isolierung von Adipozyten
Humanes Omentalfett wurde von 25 fettleibigen (OB) und nicht fettleibigen (NOB) Probanden gewonnen, die sich einer elektiven abdominalen Operation unterzogen (entweder Magenbypass, gynäkologisch oder gastrointestinal). Die Altersspanne der Probanden lag zwischen 29 und 79 Jahren, und ihr Body-Mass-Index (BMI) lag zwischen 18 und 54 kg/m2. Der Grenzwert zur Definition von Fettleibigkeit wurde gemäß der NIH-Definition von BMI > 30 kg/m2 festgelegt. Zwölf Probanden (9 Männer, 3 Frauen) waren NOB (BMI 23,3 ±3,4 kg/m2), während 13 OB waren (BMI 38,2 ± 4,3 kg/m2; 4 Männer, 9 Frauen). Wir konnten keinen Einfluss des Geschlechts auf die untersuchten Parameter feststellen. Das Protokoll wurde vom Institutional Review Board des INTA der Universität von Chile genehmigt, und die Spender unterschrieben eine Einverständniserklärung. Das bei der Operation entnommene Fettgewebe wurde in Kochsalzlösung getaucht und zur Verarbeitung innerhalb einer Stunde ins Labor transportiert. Nach der Ankunft wurde das Gewebe mehrmals mit Hanks‘ Balanced Salt Solution (HBSS) gewaschen, wobei alles sichtbare Bindegewebe, Blutgerinnsel und Gefäße entfernt wurden. Anschließend wurde es in kleine Stücke (2-3 mm2) zerkleinert und in MI99 (Invitrogen, Carlsbad, CA) Médium, ergänzt mit Antibiotika (Penicillin-Streptomycin), bei 37°C in einem Inkubator mit kontrollierter Atmosphäre kultiviert. Die Inkubationszeit des Gewebes betrug 2 Tage, um die interindividuelle Variabilität zu minimieren, die durch Faktoren wie das hormonelle Milieu, den aktuellen Gesundheitszustand oder Medikamente verursacht wird. Die Adipozyten wurden mit einer Methode isoliert, die auf der Arbeit von Rodbell (1964) basiert. Kurz gesagt, wurde zerkleinertes Fettgewebe mit lg/1 Kollagenase Typ I (Worthington Biochemical Corp. Lakewood, NJ) bei 37°C für 60 Minuten unter ständigem Mischen inkubiert. Die resultierende Zellsuspension wurde durch ein steriles Mullkissen filtriert, und da sich die Adipozyten spontan von der wässrigen Phase ablösen, wurden sie durch vorsichtiges Absaugen der schwimmenden Schicht mit einer Plastikpipette gewonnen und zweimal mit 5 Volumen HBSS gewaschen. Isolierte Adipozyten wurden entweder sofort für Lipolyse-Studien verwendet oder für eine spätere Bestimmung der Glycerin-β-Phosphat-Dehydrogenase (G3PDH) eingefroren.
Die lipolytische Reaktion auf einen β-adrenergen Stimulus und der Nachweis der lipogenen Aktivität (siehe unten) belegten das Vorhandensein lebensfähiger Adipozyten nach der Verdauung des Gewebes.
Lipogenese und Lipolyse
Die Synthese von Triglyceriden im Adipozyten verwendet sowohl vorgefertigte als auch de novo hergestellte Fettsäuren, während das Glycerin-Grundgerüst aus Glycerin-β-Phosphat aus Glucose stammt. Die lipogene Kapazität wurde anhand der spezifischen Aktivität des Enzyms G3PDH bewertet, das die Bildung des Glycerin-Grundgerüsts von Triglyceriden aus Dihydroxyacetonphosphat katalysiert, das über die Glykolyse bereitgestellt wird. Dieses Enzym gilt als ratenlimitierend für die Triglyceridsynthese im Fettgewebe, da es in diesem Gewebe die einzige Quelle für Glycerin-β-Phosphat ist. Seine Verwendung als lipogener Marker in reifen Adipozyten wird durch die Hochregulierung seiner mRNA und Aktivität durch Insulin unterstützt (Moustaid et al., 1996; Rumberger et al., 2003). Die isolierten Adipozyten wurden bei 4 °C in einem Puffer mit 0,25 M Saccharose, lmM EDTA, 50 mM Triethanolamin und lmM Dithiotreithol homogenisiert (10 Schläge bei 1800 U/min mit einem Glas-Col-Homogenisierungssystem, Glas-Col, IN). Das Homogenat wurde bei 14.000 x g, 4°C für 30 min zentrifugiert. Die G3PDH-Aktivität wurde im Überstand nach der Methode von Kozak und Jensen (1974) durch Messung der NADH-Oxidation (zeitlicher Verlauf der Änderung der Absorption bei 340 nm bei 37°C) auf einem Mikroplattenlesegerät (EL-808, BioTek Instruments Inc, Winooski, VT) unter Verwendung von Dihydroxyacetonphosphat als Substrat für das Enzym bestimmt. Die Reaktion verlief über den gesamten Testzeitraum hinweg linear mit der Zeit. Eine Einheit der Enzymaktivität entspricht der Oxidation von 1 nmol NADH pro Minute unter den oben genannten Bedingungen. Die Proteinkonzentration im löslichen Extrakt wurde mit der Bradford-Methode (Bradford, 1976) gemessen.
Die Lipolyse wurde während der 48-stündigen Fettkultur durch Messung des kumulativen Glycerins, das in das MI99-Kulturmedium freigesetzt wurde, bestimmt (Reagenz zur Bestimmung des freien Glycerins, Sigma, St. Louis MO). Darüber hinaus wurde die akute lipolytische Reaktion auf einen β-adrenergen Stimulus mit oder ohne Verarmung des Cholesterins der Plasmamembran (60 min Vorinkubation mit 10 mM MβCD ) durch Messung des gesamten freigesetzten Glycerins während einer 90-minütigen Inkubation von 10 %igen Adipozytensuspensionen bei 37°C mit sanftem kontinuierlichen Schwenken und der Zugabe von 10μM Isoproterenol (Sigma) oder Vehikel bewertet. Für die Bewertung der Lipolyse während der Fettgewebekultur werden die Glycerinwerte pro mg Gewebe ausgedrückt, während für die Lipolysebestimmung in Adipozytensuspensionen die Werte auf die gesamten zellulären Lipide normalisiert werden, wie von Carpéné (2001) beschrieben, oder, bei Experimenten mit lipolytischen Wirkstoffen, auf die jeweilige basale (nicht stimulierte) Kontrolle. Die gesamten zellulären Lipide wurden nach der Methode von Dolé und Meinertz (1960) extrahiert und gravimetrisch bestimmt. In Anbetracht des berichteten unabhängigen Zusammenhangs zwischen Zellgröße und Lipolyse, der insbesondere in unseren Studien, in denen OB- und NOB-Personen verglichen wurden, als Störfaktor wirken könnte, wurde der Ausdruck pro mg Lipid als am besten geeignet angesehen. Wie Large et al. (1999) gezeigt haben, korreliert die Glycerin-Reléase, ausgedrückt pro Lipidgehalt, stark mit der Aktivität der hormonsensitiven Lipase in Studien an fettleibigen und schlanken Menschen und ist aufgrund des erhöhten Fettzellvolumens bei Fettleibigen relevanter für die lipolytische Kapazität als die pro Zellzahl.
Statistik
Die Unterschiede zwischen den Mittelwerten wurden mit dem Student’s t-Test analysiert und bei p≤0,05 als signifikant angesehen. Der Korrelationskoeffizient von Pearson wurde verwendet, um die Assoziationen für kontinuierliche Variablen zu evaluieren. Die Daten sind als Mittelwerte ± SEM ausgedrückt.
ERGEBNISSE
Lipogenese
Die spezifische Aktivität des lipogenen Enzyms G3PDH war bei OB-Personen im Vergleich zu den Adipozyten von NOB fast halbiert (p<0,05, Abb. 1). In Übereinstimmung damit gab es eine signifikante inverse Korrelation zwischen dem Lipogenese-Marker und dem BMI der Probanden (Abb. 1, Inset, r2=0,31, p=0,01). Es ist erwähnenswert, dass es keine Unterschiede in der Proteinkonzentration (die zur Normalisierung der G3PDH-Aktivität verwendet wird) zwischen OB- und NOB-Probanden gab, die diese Ergebnisse hätten verfälschen können.
Lipolyse
Die Freisetzung von Glycerin in das Inkubationsmedium während der Kultur des gesamten omentalen Fettgewebes oder isolierter Adipozyten wurde als Indikator für die lipolytische Aktivität verwendet. Sowohl die basale als auch die durch Isoproterenol stimulierte Lipolyse war bei den isolierten Adipozyten der OB-Patienten geringer (p<0,05 bzw. p<0,01, Abb. 2). In Übereinstimmung mit diesen Beobachtungen gab es eine hochsignifikante inverse Korrelation zwischen der Lipolyse und dem BMI der Probanden für das gesamte Gewebe (r2=0,46, p<0,0005, Inset, Abb. 2) und die isolierten Adipozyten (basal: r2=0,28, p<0,01; β-adrenerge-stimuliert: r2=0,17, p<0,05, n=20). Adipozyten von fettleibigen Probanden zeigten eine geringere Reaktion auf den β-adrenergen Stimulus im Vergleich zu denen von schlanken Probanden (Abb. 3, p<0,05).
Die Exposition von Adipozyten mit 10 mM MβCD in einer Untergruppe von 11 Proben verursachte einen signifikanten Anstieg der basalen Lipolyse. Dieser Anstieg war direkt proportional zum BMI der Probanden (r2=0,5, p<0,05, Abb. 4). Die lipolytische Reaktion auf die β-adrenerge Stimulation war signifikant reduziert, wenn die Adipozyten M(βCD) ausgesetzt waren (345 ± 50 % gegenüber 199 ± 33 %, p< 0,05). Interessanterweise wurde beim Vergleich der Wirkung von M(βCD gegenüber dem Vehikel eine signifikante Verringerung der lipolytischen Reaktion auf Isoproterenol bei Adipozyten von Probanden mit einem BMI>40 kg/ m2 (morbid fettleibig nach NIH-Definition) beobachtet, während bei schlanken Probanden kein signifikanter Unterschied zu beobachten war (Abb. 5). In Übereinstimmung damit wurde eine signifikante Korrelation zwischen dem BMI und dem Verhältnis der lipolytischen Reaktion auf 10μM Isoproterenol in Anwesenheit und Abwesenheit von 10 mM M(βCD) gefunden (r2=0,46, p<0,05).
DISKUSSION
In der vorliegenden Arbeit untersuchten wir die Lipogenese und Lipolyse in Adipozyten, die aus dem omentalen Fettgewebe von OB- und NOB-Erwachsenen in einem weiten Bereich des BMI (18-54 kg/m2) isoliert wurden. Unsere Beobachtungen zeigen, dass die spezifische Aktivität des Lipogenese-Markers G3PDH bei OB nur halb so hoch war wie bei den Adipozyten ihrer NOB-Pendants. Andererseits war ein höherer BMI mit einer geringeren basalen und β-adrenergisch stimulierten Lipolyse und einer größeren Empfindlichkeit gegenüber einer Beeinträchtigung der Plasmamembran-Signalübertragung durch den Cholesterinabbau verbunden. Eine größere Triglyceridakkumulation in den OB-Adipozyten könnte mit der geringeren lipolytischen Aktivität zusammenhängen, die wir in dieser Gruppe beobachtet haben, wie auch andere vorgeschlagen haben (Langin et al., 2005). Darüber hinaus könnte die geringere spezifische G3PDH-Aktivität, die wir im OB gefunden haben, was kontraintuitiv erscheinen mag, eine verringerte Kapazität zur Speicherung der überschüssigen zirkulierenden Triglyceride darstellen, was wahrscheinlich zu einer Hypertriglyceridämie und Fettansammlung in anderen Körperregionen führt, mit den bekannten schädlichen Auswirkungen, die mit dem metabolischen Syndrom verbunden sind.
Dodt et al. (2003) beobachteten bei einem In-vivo-Ansatz beim Menschen eine abgeschwächte lipolytische Reaktion auf intraneurale Stimulation bei fettleibigen Frauen, was mit unseren In-vitro-Ergebnissen übereinstimmt und die Vorstellung unterstützt, dass Fettleibigkeit zumindest teilweise mit einer geringen lipolytischen Reaktion auf die sympathische Aktivierung verbunden sein könnte. In Übereinstimmung damit untersuchten Gómez-Ambrosi et al. (2004) das Muster der Genexpression im omentalen Fettgewebe und zeigten, dass fettleibige Probanden eine verminderte bzw. erhöhte Expression von Lipolyse-Induktor- und Repressor-Genen aufwiesen.
In der Literatur gibt es erhebliche Diskrepanzen hinsichtlich der Normalisierung der Lipolyse-Daten. Angesichts des berichteten direkten Zusammenhangs zwischen der Größe der Fettzellen und der Lipolyse (Large et al., 1999) und der größeren relativen Häufigkeit größerer Fettzellen bei Adipösen (Large et al., 1999) wird erwartet, dass das Fettgewebe bei Adipösen eine größere unbereinigte Lipolyse aufweist als bei Nicht-Adipösen. Um einen Störfaktor aufgrund der unterschiedlichen Zellgrößenverteilung bei OB im Vergleich zu NOB zu vermeiden, wurden unsere Glycerin-Reléase-Werte normalisiert, indem sie pro mg Gesamtlipid ausgedrückt wurden, um so die lipolytische Aktivität für eine bestimmte Lipidmasse zu bewerten. Dies wird durch Studien an fettleibigen und mageren Menschen bestätigt, die eine hohe Korrelation zwischen der Aktivität des lipolytischen Schlüsselenzyms HSL (hormonsensitive Upase) und der Glycerin-Reléase der Adipozyten, ausgedrückt pro Lipidgehalt, festgestellt haben (Large et al., 1999). Die Autoren stellten fest, dass der Lipidgehalt für die lipolytische Kapazität relevanter ist als die Normalisierung nach Zellzahl, was auf das erhöhte Fettzellvolumen bei Fettleibigen zurückzuführen ist. Es ist erwähnenswert, dass die β-adrenerge Stimulation unter basalen Bedingungen bei OB-Personen ebenfalls geringer war, und diese Bewertung ist unabhängig von der Zellgröße oder -anzahl, da sie mit der entsprechenden Kontrolle (jeweils basale Werte) normalisiert wird.
Die Rolle des Membrancholesteringehalts für die Integrität der Caveolae, die spezifische Signaltransduktion und die ordnungsgemäße Zellfunktion wurde bereits erkannt (Le Lay et al. 2001). Es konnte gezeigt werden, dass hypertrophe Adipozyten einen gestörten Stoffwechsel aufweisen, der mit einem geringeren Cholesteringehalt der Plasmamembran einhergeht (Le Lay et al. 2001). Unsere Beobachtungen erweitern die Beobachtungen von Le Lay et al. (2001, 2004), die zeigten, dass eine Cholesterinverarmung in Adipozyten zu Insulinresistenz und Veränderungen in der Expression einer Reihe von Genen führt, die für den Fettstoffwechsel von Bedeutung sind. Diese Ergebnisse wurden als Beweis für eine Cholesterinverringerung in der Plasmamembran als Bindeglied zwischen Adipozytenhypertrophie und Stoffwechselstörung angeführt, was durch die vorliegenden Ergebnisse bestätigt wird. In unseren Experimenten, in denen wir Adipozyten M(βCD) aussetzten, kam es zu einem signifikanten Anstieg der basalen Lipolyse (was nach der Veränderung der Integrität der Plasmamembran-Caveolae zu erwarten war und zu einer verringerten Aktivität der Phosphodiesterase 3B führte) und folglich zu einer verringerten lipolytischen Reaktion auf den β-adrenergen Stimulus. Interessanterweise beobachteten wir einen signifikanten Zusammenhang zwischen dem Einfluss von M(βCD auf die basale Lipolyse und dem BMI. Darüber hinaus unterstützt die signifikante Korrelation zwischen dem BMI und dem Verhältnis von Isoproterenol zur basalen Lipolyse in An- und Abwesenheit von M(βCD eine größere Anfälligkeit von Adipozyten fettleibiger Probanden für cholesterinverarmungsbedingte Veränderungen der Plasmamembran.
Vergrößerte Fettzellen, von denen bekannt ist, dass sie mit steigendem BMI häufiger auftreten (Julien et al., 1989; Salans et al., 1973; Van Harmelen et al, 2003), sind insulinresistent (Olefsky 1977) und weisen ein ausgeprägtes Sekretionsmuster auf, das mit Adipositas-assoziierten Störungen in Verbindung gebracht wird (Imbeault et al., 1999; Van Harmelen et al., 2000).
Interessanterweise zeigen die fettgewebespezifischen Insulinrezeptor-Knockout-Mäuse (Bluher et al., 2004) eine Polarisierung der Adipozyten in zwei Subpopulationen von kleinen (<50μm Durchmesser) und großen (>1OOμm) Zellen, was unter anderem mit Unterschieden in der Triglyzeridsynthese und Lipolyse einhergeht. Die hier berichteten Beobachtungen zeigen intrinsische Unterschiede im Triglycerid-Stoffwechsel zwischen omentalen Adipozyten von OB- und NOB-Patienten, und wir schlagen vor, dass die Anreicherung in hypertrophierten und membranständigen cholesterinarmen Adipozyten solche Veränderungen bewirken könnte. Es ist möglich, dass die beeinträchtigte lipolytische Reaktion mit der Zeit zur Vergrößerung des Triglyzeriddepots beiträgt. Die verringerte Fähigkeit, zusätzliche Triglyceride zu speichern, würde zu einer erhöhten Menge an zirkulierenden Lipiden führen und die mit dem metabolischen Syndrom verbundenen Risiken erhöhen.
Nach unserem besten Wissen hat keine andere Studie die Lipogenese und Lipolyse in omentalen Adipozyten von menschlichen OB- und NOB-Patienten untersucht. Die vorliegende Arbeit zeigt relevante Unterschiede im omentalen Adipozyten-Triglycerid-Stoffwechsel bei fettleibigen im Vergleich zu nicht fettleibigen Probanden und legt nahe, dass die Adipozyten fettleibiger Individuen anfälliger für einen reduzierten Cholesteringehalt der Plasmamembran sind. Auch wenn wir beabsichtigt haben, die subjektiven Faktoren zu minimieren, können wir nicht ausschließen, dass bei fettleibigen Personen vorhandene Komorbiditäten das unterschiedliche Verhalten der Fettzellen beeinflussen können. Der Vergleich des Umgangs mit Triglyceriden zwischen diesen Gruppen und in einem Fettdepot von derartiger pathogener Relevanz trägt zum Verständnis von Unterschieden im Stoffwechsel und in der Reaktionsfähigkeit bei, die ein Ziel für pharmakologische Interventionen sein könnten und weitere Studien erfordern.
HINWEISE
Wir möchten Dr. Miguel A. Celis vom Tisné-Krankenhaus, Dr. Leonardo Rodríguez vom DIPRECA-Krankenhaus und Dr. Cristian Cavalla, James Hamilton und Gonzalo Wiedmaier vom Padre-Hurtado-Krankenhaus für die unschätzbare Hilfe bei der Gewinnung von Fettgewebe danken. Marisol Blanco und Herr Rodrigo Brücher für ihre technische Hilfe.
GRANT SUPPORT
Unterstützt durch Zuschüsse des DI-U de Chile (N°s Mult 04/06-2 an C. Rojas und 1-04/01-2 an M. Cifuentes) und FONDECYT (N° 1070632 an C. Rojas, N°1080232 für M. Cifuentes).
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