shRNA – Anwendungen – Was ist shRNA, wie funktioniert sie und welche Anwendungen gibt es?

Was ist shRNA und wie wird sie verwendet?

Short hairpin RNA (shRNA)-Sequenzen werden in der Regel in einem DNA-Vektor kodiert, der durch Plasmid-Transfektion oder virale Transduktion in Zellen eingebracht werden kann. shRNA-Moleküle lassen sich aufgrund ihres Designs in zwei Hauptkategorien einteilen: einfache stem-loop und microRNA-adaptierte shRNA. Eine einfache stem-loop shRNA wird häufig unter der Kontrolle eines RNA-Polymerase III (Pol III)-Promotors transkribiert. Das 50-70 Nukleotide umfassende Transkript bildet eine Stem-Loop-Struktur, die aus einer 19 bis 29 bp langen Region doppelsträngiger RNA (dem Stem) besteht, die von einer Region überwiegend einzelsträngiger RNA (der Loop) und einem 3′-Dinukleotidüberhang überbrückt wird. Die einfache stem-loop shRNA wird im Zellkern transkribiert und tritt in den RNAi-Weg ein, ähnlich wie eine pre-microRNA. Die längere (> 250 Nukleotide) microRNA-adaptierte shRNA ist ein Design, das nativen pri-microRNA-Molekülen ähnlicher ist und aus einer shRNA-Stammstruktur besteht, die microRNA-ähnliche Fehlpaarungen enthalten kann, die durch eine Schleife überbrückt und von endogenen microRNA-Sequenzen in 5′ und 3′ flankiert werden. Die mikroRNA-angepasste shRNA wird wie die einfache Stielschleifen-Haarnadel ebenfalls im Zellkern transkribiert, aber es wird angenommen, dass sie ähnlich wie eine endogene pri-mikroRNA früher in den RNAi-Weg eintritt.

shRNA-Technologien sind DNA-basiert, was Flexibilität bei der Gestaltung des Vektors bietet. Die meisten vektorbasierten shRNA-Systeme enthalten einen selektiven Marker, der die Eliminierung von Zellen, die nicht erfolgreich transfiziert oder transduziert wurden, und die Erhaltung von Zellen mit anhaltendem Gen-Knockdown ermöglicht. Die shRNA-Expressionskassetten können auch in virale Vektorsysteme wie Retroviren, Adeno-assoziierte Viren, Adenoviren und Lentiviren eingebaut werden, die eine stabile Integration in und Expression aus dem Wirtsgenom ermöglichen. Diese viralen Strategien ermöglichen die Einbringung von shRNA in Zelllinien, die für eine Transfektion unempfindlich sind. Fluoreszierende Marker (z. B. grün oder rot fluoreszierende Proteine) können ebenfalls eingesetzt werden, um Zellen, die shRNAs exprimieren, zu verfolgen. Die Leistung von shRNA wird von vielen Faktoren beeinflusst, darunter die Effizienz der Transduktion oder Transfektion, der Promotor, der die Expression der shRNA antreibt, und epigenetische Veränderungen (die zu einem Silencing der shRNA-Expression führen können). Darüber hinaus kann der Einfluss, den jeder dieser Faktoren auf die Leistung des Vektors hat, je nach Zelllinie oder Zelltyp unterschiedlich sein. Die SMARTchoice-Promotor- und Reporteroptionen helfen den Forschern bei der Auswahl der optimalen Promotoren für die shRNA-Expression und das Gen-Silencing. Wenn diese shRNA-Expressionskassetten mit induzierbaren Promotoren gekoppelt werden, wie bei SMARTvector Inducible Lentiviral shRNA oder dem TRIPZ-Vektorsystem, können Forscher Studien zur zeitlichen und räumlichen Modulation der Genexpression konzipieren.

Videoanimation: RNA-Interferenz

Wie wird shRNA in eine Zelle eingebracht?

Es gibt zwei Optionen für die DNA-basierte Einbringung von shRNA in Zellen. Für Plasmide können typische Transfektionsmethoden wie die Verwendung von Lipid-Transfektionsreagenzien oder Elektroporation verwendet werden. Lentivirale Partikel sind eine ausgezeichnete Wahl für schwer zu transfizierende Zellen und in Situationen, in denen eine hohe Effizienz erforderlich ist oder mehrere Konstrukte pro Zelle übertragen werden müssen. Die meisten modernen Vektoren verfügen über selektierbare Marker, die die selektive Abtötung von Zellen in der Kultur ermöglichen, die nicht erfolgreich transfiziert oder transduziert wurden, so dass eine Reinkultur entwickelt werden kann.

Was beeinflusst die Funktion und Spezifität von shRNA?

Optimaler Gen-Knockdown ist eine Voraussetzung für erfolgreiche RNAi mit shRNA-Systemen. Das rationale Design von shRNA-Sequenzen basiert weitgehend auf Algorithmen, die mit siRNA entwickelt wurden. Während einige siRNA-Designregeln auch für shRNA gelten, werden verfeinerte shRNA-Designalgorithmen in Zukunft wahrscheinlich das Ausschalten von Zielgenen für shRNAs verbessern. Um funktionelle shRNA-Sequenzen vorherzusagen, wählt der SMARTvector™ shRNA-Algorithmus von Dharmacon die Zielsequenzen auf der Grundlage zahlreicher Kriterien aus, darunter positionsabhängige Nukleotidpräferenzen, Sekundärstruktur und thermodynamische Stabilitätsprofile, die für das SMARTvector-MikroRNA-basierte Gerüst spezifisch sind. Darüber hinaus umfasst der SMARTvector-Algorithmus mehrere Kriterien zur Erhöhung der Spezifität.

Wie bei siRNAs können bioinformatische Ansätze angewandt werden, um zielspezifische shRNAs zu schaffen und gleichzeitig das Potenzial für Off-Target-Effekte zu minimieren. Es ist bekannt, dass hohe Konzentrationen von Silencing-Zwischenprodukten zu Off-Target-Ereignissen beitragen können, aber die Menge der Zwischenprodukte ist schwer zu kontrollieren, wenn shRNAs exogen exprimiert werden. In mehreren Veröffentlichungen wurden Belege dafür gefunden, dass unter bestimmten Bedingungen eine hohe Expression einfacher Stammschleifen-shRNAs den endogenen RNAi-Weg sättigen und zu unbeabsichtigten Phänotypen führen kann. Andere Studien deuten darauf hin, dass die Verwendung einer an microRNA angepassten shRNA die zelluläre Toxizität bei in vivo RNAi-Experimenten verringern kann, da diese Gerüste sowohl von Drosha-DGCR8 als auch von Dicer effizienter verarbeitet werden.

shRNA-Anwendungen

shRNA bietet die Möglichkeit eines verlängerten Gen-Silencing. Die Transduktion virenbasierter shRNA ermöglicht den Zugang zu Zellen, wie Primär- und neuronalen Zellen, die mit herkömmlichen Strategien auf der Basis kationischer Lipide nur schwer zu transfizieren sind. Virale shRNAs wurden auch eingesetzt, um die Genfunktion auf der Ebene des gesamten Genoms mit Hilfe von Pools von Silencing-Konstrukten zu untersuchen. Pool- oder Array-Screens sind heute weit verbreitet, um Hochdurchsatz-Screens zur Identifizierung von Genen durchzuführen, die für eine Vielzahl von Prozessen erforderlich sind, wie z. B. das Überleben und die Vermehrung von Krebszellen, Komponenten von Tumorsuppressorwegen, Modulatoren der zirkadianen Uhr von Säugetieren, Suppressoren des epithelialen mesenchymalen Übergangs, Wirtsmediatoren der HIV-1-Replikation und Regulatoren der Zellmigration. Die Leistungsfähigkeit des gepoolten RNAi-Screenings wurde auch auf das Screening von Genfunktionen in Tiermodellen ausgedehnt, um die Biologie in vivo zu untersuchen.

Welches shRNA-Tool ist das richtige für Ihre Bedürfnisse?

shRNA-Auswahlhilfe

Wir bieten eine Auswahl an shRNA-Reagenzien und -Bibliotheken. Diese kurze Auswahlhilfe hilft Ihnen, die beste Option für Ihre speziellen Bedürfnisse zu finden.

Produktvorstellungen

shRNA – Produkte

• Lentivirale vektorbasierte Reagenzien für die RNA-Interferenz.

SMARTvector Lentiviral shRNA

• Treffen Sie eine kluge, fundierte Wahl für erfolgreiches Gen-Silencing in den Zellen, die Sie interessieren.

SMARTvector Inducible shRNA

• Die fortschrittlichste und flexibelste induzierbare shRNA aus einem Vektor, die für ein streng kontrolliertes Gen-Silencing verfügbar ist.

Gepoolte Lentiviren-Screening-Bibliotheken

• Optimierter Aufbau von hochwertigen Pools, vollständige Analysetools und validierte Protokolle sind für ein erfolgreiches Ergebnis beim Screening mit gepoolten Lentiviren-Bibliotheken unerlässlich.

Ressourcen

shRNA – Ressourcen

• Finden Sie Produktleitfäden, häufig gestellte Fragen und mehr.

SMARTvector Lentiviral shRNA – Tech Note

• Technische Anmerkung, die den experimentellen Arbeitsablauf von SMARTchoice shRNA in Suspensionszellen beschreibt.

SMARTvector Lentiviral shRNA – Technisches Handbuch

• Die Plattform ist ein innovatives System, das sich ideal für RNAi-vermittelte Studien eignet.

GIPZ Lentiviral shRNA – Technisches Handbuch

• Experimentelle Protokolle für den Gen-Knockdown unter Verwendung von GIPZ lentiviral shRNA.

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