Positive funktionelle Synergie strukturell integrierter künstlicher Proteindimere, die durch Click-Chemie zusammengesetzt wurden

Schnittstellen der Click-Chemie

Wir vermuteten, dass Bereiche der Oberfläche eines Proteins, die in Bezug auf die Assoziation kompatibel sind, durch die Bildung gegenseitig kompatibler nicht-kovalenter Wechselwirkungen eher eine integrierte Struktur erzeugen. Da es sich bei den Proteinen um Monomere handelt, sind diese Wechselwirkungen bestenfalls schwach und vorübergehend, so dass sie nicht von Dauer sind. Wir kamen zu dem Schluss, dass wir einen molekularen „Bolzen“ als Teil der Schnittstelle benötigen, um neue Wechselwirkungen zu fördern und zu stabilisieren. Der erste Schritt besteht darin, die Regionen auf den Zielproteinen zu identifizieren, die das Potenzial zur Interaktion haben. ClusPro 2.040 (cluspro.org) wurde verwendet, um potenzielle Dimer-Konfigurationen zu erzeugen. Die ausgegebenen sfGFP-Homodimermodelle wurden mit RosettaDock41,42 verfeinert, analysiert und in eine Rangfolge gebracht (ergänzende Tabelle 1). Die Konfiguration mit dem höchsten Rang ist in Abb. 1b dargestellt (das Modell, das der ermittelten Struktur am nächsten kommt; vide infra), und die nächsten vier Konfigurationen sind in der ergänzenden Abb. 1 dargestellt. Während unterschiedliche Ausrichtungen des einen sfGFP zum anderen beobachtet wurden, ergab das Docking, dass die Reste 145-148, 202-207 und 221-224 routinemäßig zur Dimer-Grenzfläche beitragen. Um die beiden Proteine miteinander zu verbinden, wurde die genetisch kodierte bioorthgonale Click-Chemie verwendet (Abb. 1a). Zu den Vorteilen gegenüber beispielsweise Disulfidbindungen gehören längere Seitenketten zur Überwindung potenzieller sterischer Konflikte, eine verbesserte Vernetzungsstabilität und die Möglichkeit, nicht-symmetrische (unterschiedliche Verbindungsreste an verschiedenen Monomeren) und Heterodimere in einer designten 1-zu-1-Weise zu erzeugen (vide infra).

Auf der Grundlage der Dimermodelle wurden drei Reste für den Ersatz durch die beiden Click-kompatiblen ncAAs, SCO43 (gespanntes Alkin) und azF (Azid)44,45, ausgewählt (Abb. 1a). H148 und Q204 wurden aufgrund ihrer Lage an der mutmaßlichen Dimerschnittstelle ausgewählt (Abb. 1b und ergänzende Abb. 1). Beide Reste sind dafür bekannt, dass sie bei der azF-Inkorporation leicht mit niedermolekularen Cyclooctin-Addukten modifiziert werden34,46 und liegen nahe am funktionellen Zentrum, dem sfGFP-Chromophor (CRO) (Abb. 1b). Die Gel-Mobilitätsverschiebungsanalyse zeigte, dass die Dimerisierung erfolgreich war (Abb. 1c, d); dies wurde durch die Massenspektrometrieanalyse bestätigt (ergänzende Abb. 2). Der Rest 132 wurde nicht an der Dimer-Grenzfläche vorhergesagt (Abb. 1b und Anhang 1), ist aber dafür bekannt, dass er mit einer Reihe von gespannten Alkin-Addukten kompatibel ist, die von Farbstoffen46 über Kohlenstoff-Nanoröhren35 bis hin zu einzelsträngiger DNA36 reichen. Somit ist es ein guter Test für unsere Fähigkeit, Protein-Protein-Grenzflächen und die Kompatibilität von Click-Reaktionen vorherzusagen. Obwohl der Rest 132 an der Oberfläche exponiert ist, wurde bei der Verwendung von sfGFP132azF mit einem SCO-haltigen Protein kein Dimerprodukt beobachtet (ergänzende Abb. 3), was auf die Bedeutung der Kompatibilität der Oberflächengrenzflächen und den Nutzen der In-silico-Analyse bei der Identifizierung von Click-Chemie-kompatiblen Stellen hinweist. Entweder sterische Konflikte und/oder Protein-Protein-Wechselwirkungen, die an anderen Stellen länger bestehen, können die kovalente Vernetzung am Rest 132 behindern.

Positive Funktionsumschaltung bei der Bildung des sfGFP148x2-Dimers

H148 bildet eine H-Bindung mit CRO (Abb. 1b) und spielt eine wichtige Rolle. 1b) und spielt eine wichtige Rolle beim Protonen-Shuttling, das die Population der neutralen A- (λmax ~ 400 nm, CRO A) und der anionischen B-Form (λmax ~ 490 nm, CRO B)47 im Grundzustand reguliert. Die B-Form überwiegt in sfGFP, aber nach Einbau von azF anstelle von H148 (sfGFP148azF) führt die Entfernung der H-Bindung dazu, dass der A-Zustand nun überwiegt33,34 (Abb. 2a und Tabelle 1). Der Einbau von SCO am Rest 148 (sfGFP148SCO) führt zu einem ähnlichen Effekt, wobei CRO A vorherrscht, aber mit einer geringeren Rotverschiebung (λmax 492 nm) in der kleineren CRO B-Form (Abb. 2a und Tab. 1).

Die Dimerisierung von sfGFP148azF und sfGFP148SCO hat zwei signifikante positive Effekte: (i) Einschalten der Fluoreszenz bei ~490 nm aufgrund der Förderung der CRO-B-Form; (ii) stark erhöhte Helligkeit durch erhöhten molaren Absorptionskoeffizienten bei 490 nm (Abb. 2a und Tabelle 1). Der Hauptanregungspeak ist bei der Dimerisierung rot verschoben (λmax 492 nm) im Vergleich zu sfGFPWT (λmax 485 nm) (Ergänzende Tabelle 3). Das Absorptionsverhältnis von 490:400 nm verschiebt sich um eine Größenordnung von ~0,5 für die Monomere auf ~5 für das Dimer, wobei die CRO B-Form das Absorptionsspektrum des Dimers dominiert (Abb. 2a), obwohl es offensichtlich keine Spezies gibt, die die Rolle der Imidazolgruppe H148 ersetzen kann. Frühere Beispiele der Modifizierung von sfGFP148azF mit kleinen Moleküladdukten oder Photoaktivierung führen bestenfalls zu einer teilweisen Umwandlung in die CRO B-Form33,34. Der 10-fache Wechsel in der Absorption spiegelt sich in der Fluoreszenzemission wider; die Anregung bei 490 nm führt zu einer ~20-fach höheren Emission als bei beiden Monomeren (Abb. 2a). Darüber hinaus zeigt das Dimer sogar im Vergleich zum ursprünglichen Superfolder sfGFPWT eine verbesserte Funktion (Abb. 2b und Tabelle 1). Die molare Absorption und die Helligkeit stiegen um ~320% für sfGFP148x2 (~160% pro CRO) (Abb. 2b), mehr als für eine einfache additive Steigerung zu erwarten wäre, wenn die Monomereinheiten unabhängig voneinander agieren.

Um die Bedeutung der biorthogonalen Verbindung zu untersuchen, konstruierten wir eine klassische Disulfid-basierte Verbindung, indem wir H148 zu Cystein mutierten. Die sfGFPH148C-Varianten dimerisierten, aber nur in Gegenwart von Cu2+ (ergänzende Abb. 4). Die spektralen Eigenschaften ließen darauf schließen, dass das Dimer im Vergleich zu sfGFP148x2 und sfGFPWT weniger fluoreszierend war (ergänzende Abb. 4). Das sfGFPH148C-Monomer zeigte den erwarteten Wechsel von CRO B zu CRO A. Während bei der Dimerisierung von sfGFPH148C ein Wechsel von CRO A zu CRO B beobachtet wurde, hatte das Dimer eine geringere molare Absorption pro CRO als sfGFPWT und deutlich weniger als sfGFP148x2; eine signifikante Population des A-Zustands wurde weiterhin beobachtet. Die Fluoreszenzemission bei Anregung bei 490 nm für das dimere sfGFPH148C war etwa halb so hoch wie die von sfGFPWT. Somit erzeugte der biorthogonale Ansatz eine besser funktionierende dimere Spezies als die klassische Disulfidbindung.

Molekulare Grundlage für die Funktionsumschaltung in sfGFP148x2

Die Kristallstruktur von sfGFP148x2 (siehe ergänzende Tabelle 2 für Statistiken) zeigt, dass die Monomere eine ausgedehnte Dimer-Grenzfläche mit weitreichenden Wechselwirkungen zwischen den beiden CRO-Zentren bilden. Die Monomereinheiten von sfGFP148x2 sind in einer quasi-symmetrischen Kopf-Schwanz-Anordnung angeordnet, die um ~45° zueinander versetzt ist (Abb. 3a). Die antiparallele, nebeneinander liegende Anordnung der Monomere kommt der des höchstrangigen Modells am nächsten (ergänzende Abb. 1 und ergänzende Tabelle 1). Die Elektronendichte der neuen Triazol-Vernetzung ist klar definiert (Abb. 3b) und bildet die längliche Anti-1,4-Triazol-Bindung, die teilweise vergraben und eng mit beiden Monomereinheiten verbunden ist und somit einen integralen Bestandteil der Dimer-Grenzfläche bildet (Abb. 3c). Die CROs sind 15 Å voneinander entfernt und zeigen zueinander (Abb. 3a).

Die Grenzfläche weist ähnliche Merkmale auf wie natürliche Dimere48. Die vergrabene Fläche der Grenzfläche beträgt ~1300 Å2, wobei im Allgemeinen die gleichen Reste von jedem Monomer dazu beitragen (Abb. 3c, d). H-Bindungen spielen eine wichtige Rolle, wobei die Reste E142, N146, S147, N149 und N170 aus beiden Monomeren zu acht H-Bindungen zwischen den Untereinheiten beitragen (Abb. 3b). Die Struktur zeigt, dass natürliche Dimer-Grenzflächen durch die Verwendung von Click-verknüpften Monomeren nachgeahmt und stabilisiert werden können, was nach der ursprünglichen Modellierung zwar möglich war, aber wahrscheinlich zu schwach oder vorübergehend war, um ohne die eingebettete Verbindung zu bestehen. Es könnte also sein, dass unser Ansatz verwendet werden könnte, um schwache Protein-Protein-Wechselwirkungen zu stabilisieren und so definierte Schnittstellen zu bilden.

Dimerisierung induziert eine Reihe von Konformationsänderungen, um ein weitreichendes Interaktionsnetzwerk zu bilden, das dem Mechanismus zugrunde liegt, durch den sfGFP eingeschaltet und die Helligkeit verstärkt wird. Die sfGFP148azF-Struktur (PDB 5BT0)34 zeigt, dass 148azF eine ähnliche Position wie H148 in sfGFPWT einnimmt, jedoch nicht die kritische H-Bindung zur CRO-Phenol-OH-Gruppe, die die Bildung des CRO-B-Zustands fördert. Bei der Dimerisierung führt die Modifikation von 148azF durch die Bildung der Triazol-Bindung mit 148SCO im kognitiven Monomer zu einer Veränderung der Position sowohl des Rückgrats als auch der Seitenkette, wodurch ein Loch entsteht, das nun von einem Wassermolekül im Dimer besetzt werden kann (W1azF in Abb. 4a). Das Wasser kann eine H-Bindung mit CROazF und dem Carbonyl des Rückgrats von 148azF eingehen (Abb. 4). Ein äquivalentes Wassermolekül befindet sich in der sfGFP148SCO-Monomereinheit (W1SCO), die ähnliche Wechselwirkungen bildet. Diese strukturierten Wassermoleküle haben das Potenzial, die H-Bindungs-Wechselwirkung zu ersetzen, die bei der Entfernung von H148 verloren geht, und so das Dimer durch Förderung der Bildung von CRO B im Grundzustand zu aktivieren. Die Wassermoleküle sind auch an der Dimer-Grenzfläche vergraben, so dass der dynamische Austausch mit dem Hauptlösungsmittel stark reduziert wird. Darüber hinaus sind die beiden CROs nun durch ein ausgedehntes, überwiegend aus Wasser bestehendes Netzwerk verbunden, das die Dimer-Grenzfläche überspannt (Abb. 4b, c). Die Analyse der Tunnelzusammensetzung ergab, dass drei Wassermoleküle in jeder Einheit (W1azF/SCO, W2azF/SCO und W3azF/SCO) symmetrisch sind; W4 bildet zusammen mit dem Rückgrat von F145SCO die Brücke über die Dimerschnittstelle, die die beiden Wassernetzwerke miteinander verbindet. Auf diese Weise erzeugt die Dimerisierung ein ausgedehntes, wasserreiches H-Bindungsnetzwerk zwischen den Monomeren, das den Übergang von der A-Form zu CRO in die B-Form fördert.

Einzelmolekül-Fluoreszenzanalyse von sfGFP148x2

Mit Hilfe der Totalreflexions-Fluoreszenzmikroskopie (TIRF) wurde das Fluoreszenzverhalten von sfGFP148x2-Dimeren auf Einzelmolekülebene untersucht. Der Zeitverlauf der Fluoreszenzintensität einzelner sfGFP148x2-Dimere zeigte eine Reihe von Intensitätszuständen, wobei die Fluoreszenz bei ~80-100 Zählungen vorherrschte und eine größere Langlebigkeit aufwies als die Unterpopulation höherer Intensitätszustände, die durch kurze Ausflüge in einen Intensitätsbereich von ~100 bis 300 Zählungen gekennzeichnet waren (Abb. 2c). Die Fluoreszenzspuren zeigen auch eine verlängerte Photostabilität mit langen Zeiten bis zum Photobleaching (Abb. 2c und ergänzende Abb. 5). Im Vergleich dazu wird sfGFPWT schneller photobleach, wobei die Fluoreszenzspuren einen einzigen Intensitätszustand zeigen, bei dem die Ein-Zustände im Allgemeinen kürzer andauern (ergänzende Abb. 6). Darüber hinaus wurde festgestellt, dass monomeres sfGFPWT manchmal in einem anfänglichen dunklen, nicht-fluoreszierenden Zustand existiert, bevor die Fluoreszenz einsetzt und das anschließende Photobleaching einsetzt (ergänzende Abb. 6). Die Extraktion der durchschnittlichen Fluoreszenzzeit vor dem Photobleaching und dem Einnehmen vorübergehender nicht-fluoreszierender Zustände (Blinzeln) zeigt, dass sfGFP148x2 im Vergleich zu sfGFPWT (0,65 s) längere Perioden kontinuierlicher Fluoreszenz aufweist (Mittelwert 0,9 s). In Anbetracht der Ähnlichkeit der gemessenen Einzelmolekül-Fluoreszenzintensität tragen die verlängerten ON-Zeiten und die Photobleaching-Lebensdauer wahrscheinlich zu der erhöhten Fluoreszenz bei, die in den Ensemble-Messungen von sfGFP148x2 im stationären Zustand beobachtet wurde (Abb. 2a).

In einem Versuch, die Bandbreite der in den Dimerspuren beobachteten Fluoreszenzzustände zu erklären, wurde ein Histogramm aller gemessenen Intensitäten erstellt (Abb. 2c). Im Gegensatz zu sfGFPWT (ergänzende Abb. 6), das eine einzelne lognormale Verteilung49 zeigt, bevorzugte sfGFP148x2 eine Zwei-Komponenten-Anpassung50 (Abb. 2c). Die gemessene Intensitätsverteilung zeigt einen vorherrschenden Peak mit geringerer Intensität (~90 Zählungen) und einen teilweise überlappenden Peak mit höherer Intensität als Folge der kurzen Ausflüge zu höheren Intensitätszuständen, die in den Einzelmolekül-Fluoreszenzspuren beobachtet wurden. Während man bei einem Dimer, das aus zwei unabhängig voneinander aktiven Fluorophoren besteht, normalerweise eine bimodale Intensitätsverteilung erwarten würde, bei der jedes Fluorophor nacheinander photobleachend ist, stimmen die Zeitverlaufsspuren der Einzelmolekülintensität nicht mit diesem Modell überein und zeigen einen Mangel an zwei gut definierten Zuständen. Das einfache Ein/Aus-Verhalten von sfGFPWT ist in den Dimerspuren selten zu beobachten, die ihrerseits nicht das erwartete Addukt aus zwei monomeren Spuren darstellen, sondern ein komplexeres Verhalten zeigen.

Verbesserte Funktion bei der Bildung von sfGFP204x2-Dimeren

Um zu untersuchen, wie verschiedene Verknüpfungsstellen funktionelle Auswirkungen haben können, untersuchten wir das oben konstruierte alternative Dimer sfGFP204x2 (Abb. 5a) (Abb. 1d). Es zeigte sich, dass die Dimerisierung die spektralen Eigenschaften im Vergleich zur einfachen Addition der monomeren oder sfGFPWT-Proteine verbessert, was wiederum die synergistischen Vorteile der Dimerisierung unterstreicht. Der Einbau von azF oder SCO an Rest 204 hatte nur geringe Auswirkungen auf die spektralen Eigenschaften im Vergleich zu sfGFPWT 46 (Abb. 5b und Tabelle 1). Bei den monomeren Formen überwiegt die B CRO-Form; sowohl die molare Absorption als auch die Emissionsintensitäten waren ähnlich wie bei sfGFPWT. Die Fluoreszenzemission von sfGFP204SCO war leicht reduziert (80% von sfGFPWT; Tabelle 1). Bei der Bildung des sfGFP204x2-Dimers (siehe Abb. 1d und ergänzende Abb. 2) zeigte die Spektralanalyse eine Funktionsverbesserung in Bezug auf die wichtigsten spektralen Parameter: den molaren Absorptionskoeffizienten (ε) und die Fluoreszenzemission (Abb. 5b und Tabelle 1). Bei der Dimerisierung stieg ε im Vergleich zu den Ausgangsmonomeren um bis zu 400 % auf 160.000 M-1 cm-1 an. Dies entspricht einer durchschnittlichen molaren Absorption pro CRO von 80.000 M-1 cm-1, was fast einer Verdoppelung der Helligkeit im Vergleich zu den Ausgangsmonomeren und einer Erhöhung um 31.000 M-1 cm-1 im Vergleich zu sfGFPWT entspricht. Im Einklang mit der gesteigerten Fähigkeit, Licht zu absorbieren, war auch die Fluoreszenzemission erhöht; die normalisierte Emission pro CRO war 180 % höher als die des sfGFP204azF-Monomers. Unter Verwendung der Strickler-Berg51-Berechnung (website huygens.science.uva.nl/Strickler_Berg/) sinken die Fluoreszenzlebensdauern von 3,2 ns für sfGFPWT auf 0,92 ns für sfGFP204x2. Wie bei sfGFP148x2 hat die dimere Struktur von sfGFP204x2 also eine erhöhte Wahrscheinlichkeit für elektronische Anregung und Fluoreszenzabgabe im Vergleich zu monomeren Formen (siehe ergänzende Abb. 8 für den spektralen Vergleich von Dimeren). Dies ist für beide dimeren Formen umso beeindruckender, als sfGFPWT ein Maßstab für die Leistung grün fluoreszierender Proteine ist.

Die Bedeutung der Symmetrie für die Synergie

Natürliche Proteinhomodimere sind im Allgemeinen symmetrisch1,52 und eine solche Symmetrie wurde in unserem künstlichen Dimer durch einen gemeinsamen Vernetzungsrest nachgeahmt. Wir untersuchten die Bedeutung eines gemeinsamen Vernetzungsrests (als Nachahmung der strukturellen Symmetrie) für die funktionelle Synergie. Der Vorteil der biorthogonalen Chemie besteht darin, dass die gegenseitig kompatiblen Reaktionsgriffe den Aufbau definierter Paare ermöglichen (d. h. 148 + 204 = 148-204 und nicht 148-148 oder 204-204), wodurch die Bildung unerwünschter Produkte verhindert wird, die schwer zu trennen sind.

Es wurden Dimere erzeugt, die die Reste 148 und 204 in den beiden verfügbaren Kombinationen (148SCO+204azF und 148azF+204SOC) verknüpften. Die Fluoreszenz im stationären Zustand zeigte, dass in beiden dimeren Formen die protonierten und deprotonierten Formen von CRO eindeutig vorhanden waren (Abb. 6a, b). Das mit 148azF-204SCO verknüpfte Dimer zeigte eine Veränderung der relativen Populationen der A- und B-Formen mit einem signifikanten Anstieg des molaren Absorptionskoeffizienten bei 490 nm (Abb. 6a); er war fast doppelt so hoch wie der des ursprünglichen sfGFP204SCO und ~30 % höher als der durch einfache Addition der Monomerspektren vorhergesagte Wert. Die relative Höhe des 400-nm-Peaks bleibt sowohl im sfGFP148azF- als auch im 148azF-204SCO-gebundenen Dimer ähnlich, was darauf hindeutet, dass die Population der deprotonierten Form im Dimer ähnlich hoch ist wie im ursprünglichen Monomer. Die Dimerisierung über die 148SCO-204azF-Kombination veränderte die relativen Populationen der protonierten und deprotonierten Formen, aber die Verringerung des 400-nm-Absorptionspeaks ging nicht mit einer gleichzeitigen Erhöhung des 490-nm-Peaks einher (Abb. 6b). Tatsächlich war die Dimerisierung weitgehend nachteilig, da beide großen Absorptionspeaks einen niedrigeren molaren Absorptionskoeffizienten aufwiesen als die einfachen Additionsspektren der Monomere (Abb. 6b). Es ist klar, dass die asymmetrisch verknüpften Dimere weniger fluoreszierend sind und eine signifikante Mischpopulation der beiden CRO-Zustände im Vergleich zu den symmetrisch verknüpften Dimeren enthalten, so dass in diesem Fall die Symmetrie wichtige funktionelle Auswirkungen hat.

Heterodimere und funktionelle Integration

Heterodimere, bei denen ein Dimer aus zwei verschiedenen Proteinen besteht, sind ein häufig beobachteter alternativer Dimerisierungszustand1,2. Er ermöglicht es uns auch, neue Komplexe zu entwerfen, in denen funktionell unterschiedliche Proteine verbunden werden können. Der Vorteil der bioorthogonalen Kopplung besteht in der Möglichkeit, definierte (Hetero)Dimere aus zwei verschiedenen Proteineinheiten zu erzeugen (d. h. A + B = A-B und nicht A-A, B-B, A-B, eine schwer zu trennende Mischung). Als Partnerprotein zu sfGFP wurde das gelb fluoreszierende Protein Venus29 gewählt, da sich die beiden Proteine spektral überschneiden (siehe ergänzende Abb. 9). Die Sequenzunterschiede sind in der ergänzenden Abb. 10 dargestellt.

SfGFP148SCO wurde mit dem entsprechenden azF-haltigen Venus (Venus148azF) kombiniert, um GFVen148 zu erzeugen (siehe ergänzende Abb. 11). Es zeigen sich neue spektrale Eigenschaften, die darauf hindeuten, dass ein integriertes System erzeugt wurde. Die Bildung von GFVen148 erzeugt ein Dimer, das im Vergleich zu sfGFP148SCO oder Venus148azF eine verbesserte Helligkeit aufweist (Abb. 7a und ergänzende Tabelle 3). Interessanterweise weist das Dimer spektrale Eigenschaften auf, die zwischen denen der einzelnen Monomere liegen, ohne dass es zu einer signifikanten Peakverbreiterung kommt (Abb. 7a, b und ergänzende Abb. 12a), was darauf hindeutet, dass die beiden CRO-Zentren in Bezug auf die Fluoreszenzemission funktionell integriert sind. Die Haupt-λmax liegt bei 505 nm, zwischen sfGFP (492 nm) und Venus (517 nm). Das ε-Äquivalent der B-CRO-Form (Bereich 490-510 nm) steigt deutlich an (~4-5-fach), höher als die einfachen additiven Spektren der Monomere, während die A-CRO-Population abnimmt, aber immer noch beobachtet wird (Abb. 7a). Dies geht einher mit einer ~4-fachen Zunahme der Emissionsintensität bei der Anregung bei 505 nm (Abb. 7b). Es wird ein einzelner Emissionspeak beobachtet, der ebenfalls zwischen den beiden Monomeren liegt, unabhängig von der Anregungswellenlänge (λEM bei 517 nm; Abb. 7b, c); bei der Anregung bei 490 nm (die beide CROs anregen kann) wurde ein einzelner und kein doppelter oder verbreiterter Peak beobachtet, was darauf hindeutet, dass eine einzige Spezies emittiert. Ein additives Spektrum einzelner Monomerspektren, das zwei unabhängig voneinander wirkende Proteine simuliert, unterstützt die Idee einer neuen integrierten Funktion, da es im Vergleich zum gemessenen GFVen148x2-Emissionsprofil breiter und rotverschoben ist (ergänzende Abb. 12b). Die Emission bei Anregung bei 400 nm wurde ebenfalls gemessen, da Venus148azF im Vergleich zu GFVen148 bei dieser Wellenlänge eine geringe Absorption aufweist. Die Emissionsintensität war für GFVen148 im Vergleich zu monomerem Venus148azF 30-mal höher, wobei die Emission bei 517 nm ihren Höhepunkt erreichte (Abb. 7c und ergänzende Abb. 12c). Anstatt, wie zu erwarten wäre, einen klassischen FRET zu zeigen (siehe oben), scheint GFVen148 in Bezug auf den Fluoreszenzausstoß als eine einzige Einheit zu agieren. Dies könnte darauf hindeuten, dass zwei CROs nun überwiegend als eine Spezies agieren, wobei die für sfGFP148x2 beobachteten strukturellen Aspekte (wie das Wassernetzwerk) eine Rolle spielen. Das Vorhandensein eines signifikanten neutralen A-Zustands des CRO deutet darauf hin, dass die beiden monomeren Einheiten nicht vollständig synchronisiert sind. Dies ändert jedoch nichts an der eindeutigen Auswirkung, die die Dimerisierung auf die Erzeugung neuartiger spektraler Eigenschaften haben kann, wie sie in GFVen148 zu sehen sind.

Wie bei sfGFP hatte der Einbau von azF anstelle von Q204 (bezeichnet als Venus204azF) kaum Auswirkungen auf die spektralen Eigenschaften von Venus (ergänzende Tabelle 3). Die kovalente Verknüpfung über 204 SPAAC (GFVen204) erzeugte erfolgreich ein Dimer (ergänzende Abb. 11). GFVen204 kombinierte die spektralen Eigenschaften beider Monomere und erzeugte eine Spezies mit λMax bei 490 und 514 nm (Verhältnis 1:1,2) (Abb. 7e, f und ergänzende Tabelle 3). Venus204 absorbiert ebenfalls bei 490 nm, jedoch in einem Verhältnis von 1:2,7 zu 514 nm. Die Bildung von Dimeren erhöhte wiederum die molare Absorption über die der einzelnen Monomere; insbesondere stieg ε um ~26.000 M-1 cm-1 (~27 %) für das mit Venus assoziierte λmax (514 nm), wo sfGFP nur wenig beiträgt. Um die Kommunikation zwischen den Monomeren zu untersuchen, wurde die Fluoreszenzemission bei Anregung bei vier verschiedenen Wellenlängen beobachtet: 400 nm (nur sfGFP); 450 nm (sfGFP, kleinere Venus); 490 nm (sfGFP λmax, Venusschulter); 510 (Venus, kleinere sfGFP). Bei allen Anregungswellenlängen lag der einzige klare Emissionspeak bei 528 nm (Abb. 7b), der Venus entspricht und auf eine Kommunikation durch Förster-Resonanz-Energietransfer (FRET) hinweist. Ein Emissionspeak, der mit sfGFP204SCO (~510 nm) korreliert, wurde selbst bei Anregung bei den für sfGFP spezifischen niedrigeren Wellenlängen nicht beobachtet. Auch der für GFVen148 charakteristische intermediäre Emissionspeak wurde nicht beobachtet, was die neuen Eigenschaften des 148-Heterodimers unterstreicht. Der signifikanteste Unterschied wurde bei der Anregung bei 400 nm beobachtet, wo die Emissionsintensität bei 528 nm für GFVen204 im Vergleich zu Venus204azF um das 14-fache anstieg (Abb. 7f, Inset). Die berechnete relative FRET-Effizienz nach der spektralen Zerlegung lag bei etwa 90 %. Die beiden funktionellen Zentren kommunizieren also durch Energietransfer (Abb. 7g) auf hocheffiziente Weise miteinander

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