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Repräsentative Ergebnisse

Die Fähigkeit von Plaque-Assays zur genauen Bestimmung von Virustitern hängt von zahlreichen Faktoren ab: geeignete Auswahl der Wirtszellen, geeignete Medien und Wachstumsbedingungen für die zelluläre und virale Lebensfähigkeit, immobilisierte virale Vermehrung und eine genaue Bestimmung der viralen Inkubationszeit, um ausreichend Zeit für eine deutliche und zählbare Plaquebildung zu haben.

Für diese Studie wurden Viren aus drei repräsentativen Familien ausgewählt, um Unterschiede bei der Overlay-Auswahl, den Inkubationszeiten und der Plaquemorphologie bei verschiedenen Probentypen aufzuzeigen. Als (+)ssRNA-Virusmodell wurde das Venezolanische Pferdeenzephalitis-Virus (VEEV) ausgewählt, das bei Pferden und Menschen erhebliche Krankheiten verursachen kann und der Familie der Togaviridae angehört. Der Influenza-B-Stamm aus Taiwan, ein segmentiertes (-)ssRNA-Virus, das vor allem Menschen infiziert, gehört zur Familie der Orthomyxoviridae. Rift-Valley-Fieber-Virus (RVFV), ein von Arthropoden stammendes (-)ssRNA-Virus, das hauptsächlich Arthropoden, Wiederkäuer und Menschen infiziert, wurde als Vertreter der Familie der Bunyaviridae ausgewählt.

Für RVFV (Abbildung 1) wurden die Titer aus einer Stammlösung eines rekombinanten, lebenden, abgeschwächten MP12-Stammes von RVFV in einem 12-Well-Plattenformat unter Verwendung von CMC-, Agarose- oder Avicel-Overlays bestimmt, die 72 Stunden nach der Infektion (hpi) nebeneinander inkubiert wurden. Eine repräsentative Platte mit Verdünnungen von 10-4 bis 10-7 ist in Tafel A zu sehen. Plaques mit CMC- und Agarose-Overlays zeigten kleine, klare und deutliche Plaques mit einem gut definierten kreisförmigen Rand. Plaques mit einem Flüssigkeits-Overlay waren im Vergleich zu Agarose- und CMC-Plaques etwas zahlreicher und größer und wiesen einen weniger deutlichen Rand auf. Die Virustiter wurden in Panel B verglichen, wobei alle Overlays vergleichbare Ergebnisse erzielten.

Um einen klareren visuellen Vergleich zwischen den Overlays für MP12 sowie eine größere Stichprobengröße zur Bestimmung der Reproduzierbarkeit zu erhalten, wurde auch eine 6-Well-Platte in dreifacher Ausführung getestet (Abbildung 2). Im 6-Well-Plattenformat zeigte die Verwendung eines CMC-Overlays kleinere Plaques als Agarose- oder Flüssigkeits-Overlays, die in ihrer Größe miteinander vergleichbar waren. Während die Virustiter bei allen drei Overlays ähnlich waren (Panel D), erwiesen sich die in Agarose- und Flüssigkeits-Overlays gebildeten Plaques aufgrund ihrer größeren Größe als leichter zu zählen.

Im Gegensatz zu RVFV unterschieden sich die VEEV-Titer und die Plaquemorphologie zwischen den verschiedenen Overlays deutlich (Abbildung 3A). Die in CMC-Overlays gebildeten Plaques wiesen bei Verwendung eines 12-Well-Plattenformats eine klare und ausgeprägte Morphologie auf, was auf Kosten der Plaquegröße und -empfindlichkeit ging (Tafel B). Im Gegensatz zu CMC führte die Verwendung von Agarose- und Flüssigkeits-Overlays zu signifikant größeren Plaques, was auf eine geringere virale Hemmung und eine höhere Empfindlichkeit gegenüber der VEEV-Replikation hindeutet. Dies wurde zuvor in einer von Juarez et al. veröffentlichten Arbeit bestätigt, in der ausschließlich Agarose mit CMC verglichen wurde.4 Während Agarose und flüssige Overlays größere Plaques als CMC produzierten, hatten die Plaques schlecht definierte Ränder und waren in einem 12-Well-Format schwer zu zählen, wobei flüssige Overlays die größte Randdiffusion aufwiesen. Als die Plaques in 6-Well-Platten getestet wurden (Abbildung 4), konnte das größere 6-Well-Format das Problem der übermäßig großen Plaques, die im 12-Well-Format schwer zu unterscheiden waren, ausräumen, wobei sich Agarose- und Flüssigkeits-Overlays den CMC-Overlays in Bezug auf die Plaquedefinition und die Empfindlichkeit als überlegen erwiesen (Abbildung 4D).

Im Vergleich zu RVFV oder VEEV stellt das Influenzavirus beim Plaquen mehrere einzigartige Herausforderungen dar, wie z. B. die Notwendigkeit einer externen Protease. Die Empfindlichkeit von Influenzaviren gegenüber verschiedenen Overlay-Auswahlen wurde in der Vergangenheit ebenfalls gut dokumentiert, da signifikante Veränderungen festgestellt wurden, wenn so geringfügige Modifikationen wie verschiedene Agarose-Marken verwendet wurden9.

Interessanterweise führte die Verwendung von CMC als Overlay für den Influenza-B-Stamm aus Taiwan zu deutlich kleineren Plaques, die schwer zu zählen waren und sich als schwierig erwiesen, zuverlässig zu bewerten (Abbildung 5A). Die Verwendung eines Agarose-Overlays lieferte die besten Plaques (Tafel C) und führte zu einer dunkleren Hintergrundfärbung (wahrscheinlich aufgrund einer erhöhten Lebensfähigkeit der Monoschicht) und zeigte klarere und schärfere Plaques im direkten Vergleich zur Verwendung des flüssigen Overlays (Tafel B).

Ein deutlicher Vorteil von flüssigen Polymeren gegenüber festen und halbfesten Overlays, wie Agarose und CMC, liegt in der einfachen Entfernung und Anwendung. Halbfeste Overlays müssen erhitzt werden, und die Verfestigung kann sich bei der Handhabung und Entfernung als problematisch erweisen. Um diese Vorteile zu nutzen und die Praktikabilität des Einsatzes von Avicel im Hochdurchsatzverfahren für RVFV zu ermitteln, wurde ein 96-Well-Plattenformat mit unterschiedlichen Overlay-Konzentrationen getestet (Abbildung 6). Für RVFV MP-12 wurden Verdünnungen in vierfacher Ausführung mit 0,6 und 1,2 % Avicel-Endkonzentration durchgeführt. Das Auftragen und Entfernen des Overlays erwies sich als einfach, wobei keine offensichtlichen Unterschiede zwischen den Wiederholungen oder zwischen den Konzentrationen festgestellt wurden, was ein hohes Maß an Reproduzierbarkeit beweist. Bei der Auswertung waren die Plaques deutlich erkennbar und mit bloßem Auge zählbar, was die Durchführbarkeit der Verwendung von flüssigen Overlays in einem hohen Durchsatz für RVFV zeigt.

Abbildung 1:RVFV-Plaque-Overlay-Vergleiche unter Verwendung von 12-Well-Platten. Veros wurden mit 2,5 x 105 Zellen in 12-Well-Platten plattiert und mit 200 µl der gleichen seriell verdünnten Ausgangsprobe von MP12 infiziert. Nach der Infektion wurden 1,5 ml Überlagerungen aus 0,3 % Agarose, 0,6 % Avicel oder 1 % CMC (Endkonzentrationen) aufgetragen, um die Überlagerungen direkt zu vergleichen (siehe Tafel A). Die Plaques wurden gezählt und in Tafel B dargestellt.

Abbildung 2:RVFV-Plaque-Überlagerungsvergleiche in 6-Well-Platten. Veros wurden mit 5 x 105 Zellen in 6-Well-Platten plattiert und mit 400 µl der gleichen seriell verdünnten Ausgangsprobe von MP12 infiziert. Drei ml Überlagerungen aus 0,3 % Agarose, 0,6 % Avicel oder 1 % CMC wurden aufgetragen, um die Überlagerungen direkt zu vergleichen, wie in den Tafeln A, B und C gezeigt. Separate Experimente wurden identisch wie für die Tafeln A-C beschrieben durchgeführt, wobei die Plaques in Tafel D gezählt und gezittert wurden (N = 3).

Abbildung 3:VEEV-Plaque-Überlagerungsvergleiche mit 12-Well-Platten. Veros wurden mit 2,5 x 105 Zellen in 12-Well-Platten plattiert und mit 200 µl der gleichen seriell verdünnten Ausgangsprobe des VEEV TC-83-Impfstammes infiziert. Nach der Infektion wurden 1,5 ml Überlagerungen aus 0,3 % Agarose, 0,6 % Avicel oder 1 % CMC aufgetragen, um die Überlagerungen direkt zu vergleichen (siehe Tafel A). Die Plaques wurden gezählt und in Tafel B dargestellt.

Abbildung 4: Vergleich von VEEV-Plaque-Überlagerungen in 6-Well-Platten. Veros wurden mit 5 x 105 Zellen in 6-Well-Platten plattiert und mit 400 µl der gleichen seriell verdünnten Ausgangsprobe von VEEV TC-83 infiziert. Nach der Infektion wurden 3 ml Overlays aus 0,3 % Agarose, 0,6 % Avicel oder 1 % CMC aufgetragen, um die Overlays direkt zu vergleichen, wie in den Tafeln A, B und C gezeigt. Separate Experimente wurden identisch wie für die Tafeln A – C beschrieben durchgeführt, wobei die Plaques gezählt und in Tafel D ausgewertet wurden (N = 3).

Abbildung 5:Vergleiche von Influenza-Plaque-Overlays. MDCK-Zellen wurden mit 5 x 105 Zellen in 6-Well-Platten plattiert und mit 400 µl Inokulum unter Verwendung der gleichen seriell verdünnten Startprobe von Influenza B Taiwan infiziert. Es wurde kein fötales Rinderserum (FBS) in den Wachstumsmedien oder Overlays verwendet, da FBS die Influenza-Vermehrung durch Hemmung bestimmter Proteasen, die für die Virusfusion erforderlich sind, hemmen kann. Allen Overlays wurde vor der Anwendung TPCK-Trypsin zugesetzt, um die Virusfusion und den Eintritt in die Wirtszellen zu erleichtern. Nach der Infektion wurden 3 ml Overlays aus 0,3 % Agarose, 0,6 % Avicel oder 1 % CMC aufgetragen, um die Overlays direkt miteinander vergleichen zu können, wie in den Feldern A, B und C gezeigt. Die einzelnen Experimente wurden identisch wie in den Feldern A – C beschrieben durchgeführt, wobei die Plaques in Feld D gezählt und ausgezählt wurden (N = 3). Während für CMC-Plaques ein Durchschnittswert ermittelt wurde, erwies es sich als schwierig, sie zuverlässig zu zählen, da sie diffuse Ränder und sehr kleine Plaquegrößen aufwiesen.

Abbildung 6: Plaque-Überlagerungen im Hochdurchsatz. Eine 96-Well-Platte mit 3 x 104 Veros-Zellen pro Well wurde mit 50 µl Inokulum unter Verwendung derselben seriell verdünnten Ausgangsprobe von RVFV MP12 für 1 Stunde in vierfacher Ausführung infiziert. Für die Overlays wurden 0,6 und 1,2 % Endkonzentrationen von Avicel getestet, um die Durchführbarkeit und Reproduzierbarkeit der Verwendung von Flüssigkeitsoverlays im Hochdurchsatzverfahren zu ermitteln (Panels A und B).

Tabelle 1:Plaque Assay Inokulationsbedingungen und Zelltypen

Tabelle 2:Plaque und virale/zelluläre Wachstumsmedien

Overlay-Lösungen verfallen bei der Herstellung nicht, solange die Sterilität erhalten bleibt.

Tabelle 3:Overlays Vorrat

Tabelle 4: Plattenformate