Ein allgemeines Blotting-Verfahren beginnt mit der Extraktion von Gesamt-RNA aus einer homogenisierten Gewebeprobe oder aus Zellen. Eukaryotische mRNA kann dann durch Oligo(dT)-Cellulose-Chromatographie isoliert werden, um nur die RNAs mit einem Poly(A)-Schwanz zu isolieren. Die RNA-Proben werden dann durch Gelelektrophorese aufgetrennt. Da die Gele brüchig sind und die Sonden nicht in die Matrix eindringen können, werden die nun nach Größe getrennten RNA-Proben durch ein Kapillar- oder Vakuum-Blotting-System auf eine Nylonmembran übertragen.
Kapillar-Blotting-System für den Transfer von RNA von einem Elektrophorese-Gel auf eine Blotting-Membran.
Eine positiv geladene Nylonmembran ist für das Northern Blotting am effektivsten, da die negativ geladenen Nukleinsäuren eine hohe Affinität zu ihr haben. Der für das Blotting verwendete Transferpuffer enthält in der Regel Formamid, da es die Annealing-Temperatur der Sonden-RNA-Interaktion senkt und somit hohe Temperaturen, die zu einem Abbau der RNA führen könnten, überflüssig macht. Sobald die RNA auf die Membran übertragen wurde, wird sie durch UV-Licht oder Wärme durch kovalente Bindung an die Membran immobilisiert. Nachdem eine Sonde markiert wurde, wird sie an die RNA auf der Membran hybridisiert. Zu den Versuchsbedingungen, die sich auf die Effizienz und Spezifität der Hybridisierung auswirken können, gehören Ionenstärke, Viskosität, Duplexlänge, nicht übereinstimmende Basenpaare und Basenzusammensetzung. Die Membran wird gewaschen, um sicherzustellen, dass die Sonde spezifisch gebunden hat und um zu verhindern, dass Hintergrundsignale entstehen. Die Hybridsignale werden dann mittels Röntgenfilm nachgewiesen und können durch Densitometrie quantifiziert werden. Um Kontrollen für den Vergleich in einem Northern Blot zu erstellen, können Proben verwendet werden, die das interessierende Genprodukt nicht aufweisen, nachdem es durch Microarrays oder RT-PCR bestimmt wurde.
GeleBearbeiten
RNA auf einem Formaldehyd-Agarose-Gel laufen lassen, um die 28S (obere Bande) und 18S (untere Bande) ribosomalen Untereinheiten hervorzuheben.
Die RNA-Proben werden in der Regel auf Agarosegelen aufgetrennt, die Formaldehyd als Denaturierungsmittel für die RNA enthalten, um die Sekundärstruktur zu begrenzen. Die Gele können mit Ethidiumbromid (EtBr) gefärbt und unter UV-Licht betrachtet werden, um die Qualität und Quantität der RNA vor dem Blotting zu beobachten. Die Polyacrylamid-Gelelektrophorese mit Harnstoff kann ebenfalls zur RNA-Auftrennung verwendet werden, wird aber meist für fragmentierte RNA oder microRNAs eingesetzt. Eine RNA-Leiter wird oft zusammen mit den Proben auf einem Elektrophorese-Gel durchgeführt, um die Größe der erhaltenen Fragmente zu beobachten, aber bei Gesamt-RNA-Proben können die ribosomalen Untereinheiten als Größenmarker dienen. Da die große ribosomale Untereinheit 28S (ca. 5kb) und die kleine ribosomale Untereinheit 18S (ca. 2kb) ist, erscheinen zwei markante Banden auf dem Gel, wobei die größere fast doppelt so stark ist wie die kleinere.
SondenEdit
Sonden für den Northern Blotting bestehen aus Nukleinsäuren mit einer komplementären Sequenz zur gesamten oder zu einem Teil der interessierenden RNA. Es kann sich um DNA, RNA oder Oligonukleotide mit mindestens 25 komplementären Basen zur Zielsequenz handeln. RNA-Sonden (Ribosonden), die in vitro transkribiert werden, können strengeren Waschschritten standhalten, wodurch ein Teil des Hintergrundrauschens vermieden wird. Üblicherweise wird cDNA mit markierten Primern für die interessierende RNA-Sequenz hergestellt, die im Northern Blot als Sonde dient. Die Sonden müssen entweder mit radioaktiven Isotopen (32P) oder mit Chemilumineszenz markiert werden, bei der alkalische Phosphatase oder Meerrettichperoxidase (HRP) chemilumineszente Substrate abbauen und eine nachweisbare Lichtemission erzeugen. Die Chemilumineszenzmarkierung kann auf zwei Arten erfolgen: entweder ist die Sonde an das Enzym gebunden, oder die Sonde ist mit einem Liganden (z. B. Biotin) markiert, für den der Ligand (z. B. Avidin oder Streptavidin) an das Enzym (z. B. HRP) gebunden ist. Mit Röntgenfilm können sowohl radioaktive als auch chemilumineszente Signale nachgewiesen werden. Viele Forscher bevorzugen die chemilumineszenten Signale, da sie schneller und empfindlicher sind und die mit radioaktiven Markierungen verbundenen Gesundheitsrisiken verringern. Dieselbe Membran kann bis zu fünfmal untersucht werden, ohne dass es zu einem signifikanten Verlust der Ziel-RNA kommt.