Introduction
Thalassämie ist die häufigste vererbte Blutkrankheit in Südostasien und wird durch eine verminderte oder fehlende Synthese der Globinketten des Hämoglobins (Hb) verursacht, was zu einem Ungleichgewicht der Globinketten führt.1,2 Die Beta-Thalassämie ist eine der Hauptformen der Thalassämie und wird durch eine Mutation im Beta-Globin-Gen (HBB) auf Chromosom 11 verursacht. Das klinische und hämatologische Spektrum der Beta-Thalassämie reicht vom stummen Träger bis hin zu klinisch manifesten Zuständen, einschließlich der schweren transfusionsabhängigen Beta-Thalassämie major und der Beta-Thalassämie intermedia (TI).3,4 In Thailand sind sowohl die Beta-Thalassämie als auch das Hämoglobin E (HbE) eine der häufigsten Formen, die in allen Regionen, insbesondere im Nordosten Thailands, verbreitet sind. Die meisten schweren Beta-Thalassämien resultieren aus dem Zusammenspiel von Beta-Thalassämie und HbE.5,6
Die molekularen Grundlagen der Thalassämie sind weltweit untersucht worden. Mehr als 300 verschiedene Mutationen des Beta-Globin-Gens sind charakterisiert worden. Die meisten Beta-Thalassämie-Mutationen werden durch Punktmutationen, kleine Deletionen oder Insertionen innerhalb der kodierenden Regionen und der Exon-Intron-Verbindungen verursacht. Die Art der Mutation ist in der Regel ethnisch spezifisch.7-9 In Thailand schwankt die Prävalenz von Beta-Thalassämie-Trägern zwischen 3 % und 9 %.10 Bis heute wurden mehr als 30 verschiedene Mutationen identifiziert.11-13 Die Heterogenität der Mutationen erschwert die Identifizierung der Mutation bei einigen Beta-Thalassämie-Patienten. Verschiedene DNA-Analysetechniken wie die Dot-Blot-Analyse, der reverse Dot-Blot, die allelspezifische Amplifikation mit dem Amplification Refractory Mutation System (ARMS) oder die direkte DNA-Sequenzierung sind weit verbreitet, um Beta-Globin-Genmutationen zu identifizieren.1417
Ziel dieser Studie war es, die Beta-Globin-Gen-Mutationen bei 80 pädiatrischen Patienten zu charakterisieren, die Beta-Thalassämie-Mutationen tragen und im Phramongkutklao-Krankenhaus, einem Tertiärzentrum für Thalassämie-Patienten aus allen Regionen, insbesondere aus Zentralthailand, weiterbehandelt wurden.
Patienten und Methoden
Patientenauswahl
Achtzig nicht verwandte Beta-Thalassämie-Patienten, die von Januar 2013 bis Dezember 2013 die hämatologische Klinik der Abteilung für Pädiatrie des Phramongkutklao-Krankenhauses in Bangkok, Thailand, besuchten, wurden in unsere Studie aufgenommen. Das Studienprotokoll wurde vom Institutional Review Board des Phramongkutklao Hospital, Phramongkutklao College of Medicine, Thailand, genehmigt. Fünfundsechzig Patienten hatten eine klinisch manifeste Beta-Thalassämie, davon 57 mit Beta-Thalassämie/HbE und acht mit homozygoter oder compound heterozygoter Beta-Thalassämie. Fünfzehn Patienten hatten eine heterozygote Beta-Thalassämie. Bei allen Patienten wurde die Diagnose im Alter von 18 Jahren oder darunter gestellt. Patienten mit homozygoter Beta-Thalassämie und Beta-Thalassämie/HbE wurden klinisch in schwere transfusionsabhängige Thalassämie major und milde TI eingeteilt, und zwar anhand von Kriterien wie Alter bei der Diagnosestellung, durchschnittlicher Hb-Wert im Steady-State und Transfusionshäufigkeit in der Vorgeschichte, wie zuvor beschrieben.18
Mutationsanalyse
Nach Einholung der informierten Zustimmung wurden insgesamt 80 periphere Blutproben mit Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) von allen Personen entnommen. Genomische DNA wurde aus peripheren Blutlymphozyten mit einem AxyPrep™ blood genomic DNA miniprep kit gemäß dem Protokoll des Herstellers extrahiert. Die Mutationen des Beta-Globin-Gens wurden zunächst mithilfe von zwei Sätzen der allelspezifischen Polymerase-Kettenreaktion (PCR) oder des Multiplex-Amplifikations-Refraktär-Mutations-Systems (M-ARMS) charakterisiert, um sieben in chinesischen und südostasiatischen Populationen verbreitete Mutationen nachzuweisen, darunter Codon 41/42 (-TCTT), Codon 17 (A>T), Nukleotid -28 (A>G), IVS-II-654 (C>T), Codon 71/72 (+A), IVS-I-1 (G>T) und IVS-I-5 (G>C), wie zuvor beschrieben.15,17 Es wurde festgestellt, dass diese Mutationen für 80-90 % der Beta-Thalassämie-Allele in dieser Region verantwortlich sind.19,20 Unbekannte Beta-Thalassämie-Gene wurden durch direkte DNA-Sequenzierung aller kodierenden Regionen und Exon-Intron-Grenzen weiter charakterisiert, um ungewöhnliche Punktmutationen und kleine Rearrangements im Beta-Globin-Gen gemäß den zuvor an anderer Stelle beschriebenen Protokollen zu erkennen.16 Beta-Thalassämie-Allele, die durch die oben genannten M-ARMS- und DNA-Sequenzierungsmethoden uncharakterisiert blieben, wurden anschließend durch Gap-PCR untersucht, um eine 3,4-kb-Deletion des gesamten Beta-Globin-Gens nachzuweisen, über die zuvor in thailändischen Populationen berichtet wurde.21
Ergebnisse
In unsere Studie wurden insgesamt 88 Beta-Thalassämie-Allele von acht homozygoten oder compound heterozygoten Beta-Thalassämie-Patienten, 57 Beta-Thalassämie/HbE-Patienten und 15 heterozygoten Beta-Thalassämie-Patienten aufgenommen. Alle 80 Probanden stammten aus nicht verwandten Familien und 93,8 % (75/80) der Probanden lebten in Bangkok und anderen Provinzen in Zentralthailand. Von diesen 65 Patienten mit klinisch manifester Beta-Thalassämie wiesen 92,3 % (60/65) und 7,7 % (5/65) der Patienten eine Beta-Thalassämie major bzw. TI auf. Bei den 60 Patienten mit Beta-Thalassämie major hatten 86,7 % (52/60) der Patienten eine Beta-Thalassämie/HbE, während nur 13,3 % (8/60) der Patienten eine homozygote oder compound heterozygote Beta-Thalassämie aufwiesen. Alle Patienten mit homozygoter oder compound heterozygoter Beta-Thalassämie und 91,2 % (52/57) der Patienten mit Beta-Thalassämie/HbE in dieser Studie wiesen eine schwere transfusionsabhängige Beta-Thalassämie major auf. Was den Genotyp der Patienten mit Beta-Thalassämie major betrifft, so war der häufigste Genotyp Codon 41/42 (-TCTT)/Codon 26 (G>A) oder betaE mit 40 %, und der zweithäufigste war Codon 17 (A>T)/betaE mit 18.3% aller Beta-Thalassämie-Hauptgenotypen (Tabelle 1 und Abbildung 1).
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Tabelle 1 Genotyp von 65 klinisch manifesten Beta-Thalassämiepatienten |
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Abbildung 1 Art des Genotyps bei Beta-Thalassämie-Patienten. |
Um die molekulare Grundlage dieser 88 Beta-Thalassämie-Allele aufzuklären, charakterisierten wir zunächst die DNA jedes Patienten durch zwei Sätze von M-ARMS. Fünfundsiebzig Allele (85,2 %) wurden mit dieser Methode identifiziert, darunter 33 Allele (37,5 %) von Codon 41/42 (-TCTT), 23 Allele (26.1%) von Codon 17 (A>T), sieben Allele (8%) von IVS-I-5 (G>C), sechs Allele (6,8%) von IVS-II-654 (C>T), vier Allele (4,5%) von IVS-I-1 (G>T) und zwei Allele (2,3%) von Codon 71/72 (+A) (Tabelle 2). Interessanterweise wurde das Nukleotid -28 (A>G) in unserer Studie nicht identifiziert. Bei 13 Allelen (14,8 %) wurde in keinem der beiden Sätze eine Beta-Thalassämie-Mutation festgestellt. Daher war die direkte DNA-Sequenzierung aller drei kodierenden Exons und der flankierenden Exon-Intron-Verbindungen im Beta-Globin-Gen der nächste Schritt zur Charakterisierung dieser 13 Allele. Sechs ungewöhnliche Mutationen wurden in neun Allelen (10,2 %) nachgewiesen, darunter vier Allele (4,5 %) für Codon 35 (C>A) und ein Allel (1,1 %) für die Mutation des Initiationscodons (ATG>AGG), Codon 15 (G>A), Codon 19 (A>G), Codon 27/28 (+C) und Codon 123/124/125 (-ACCCCACC) (Abbildung 2). Die verbleibenden Allele, die durch M-ARMS und DNA-Sequenzierung nicht charakterisiert wurden, wurden durch Gap-PCR weiter identifiziert, um eine 3,4 kb-Deletion nachzuweisen, und diese Deletion wurde in allen vier verbleibenden Allelen (4,5 %) gefunden.
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Tabelle 2 Die Häufigkeit von Beta-Thalassämie-Mutationen in 88 Allelen |
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Abbildung 2 Sechs ungewöhnliche Mutationen, die durch direkte DNA-Sequenzierung identifiziert wurden. |
Insgesamt wurden 100 % unserer 88 Beta-Thalassämie-Allele durch eine Kombination dieser Techniken charakterisiert, einschließlich zweier Sätze von M-ARMS, direkter DNA-Sequenzierung und 3,4 kb Deletionsnachweis-Gap-PCR. Ohne das betaE-Globin-Gen wurden in der vorliegenden Studie 13 verschiedene beta-Thalassämie-Mutationen gefunden. Die 4-bp-Deletion (-TCTT) in den Codons 41/42 war die häufigste Mutation, die in unserer Studie identifiziert wurde und 37,5 % der Allele ausmachte. Das Codon 17 (A>T) war die zweithäufigste und machte 26,1 % der Allele aus. Zusammen machten diese beiden häufigen Mutationen mehr als die Hälfte (63,6 %) der betroffenen Allele aus. Alle anderen häufigen Mutationen mit Ausnahme des Nukleotids -28 (A>G) machten 21,6 % der Allele aus.
Diskussion
Diese Studie lieferte nützliche Informationen über die Häufigkeitsverteilung von Beta-Thalassämie-Mutationen bei pädiatrischen Patienten, insbesondere in Zentralthailand, da mehr als 90 % der Patienten in Bangkok und anderen Provinzen in dieser Region lebten. Insgesamt hatten 92 % der Kinder mit klinisch manifester Beta-Thalassämie den Beta-Thalassämie-Major-Phänotyp, und mehr als 85 % der pädiatrischen Patienten mit Beta-Thalassämie-Major wiesen eine compound heterozygote Beta-Thalassämie und HbE auf, was in Thailand sehr häufig vorkommt.5,6,8,10 Die Häufigkeit des BetaE-Globin-Gens wurde nicht in die Analyse der Beta-Thalassämie-Mutationshäufigkeit einbezogen, da HbE leicht durch Hb-Elektrophorese nachgewiesen werden kann.
Mit verschiedenen Methoden können Beta-Thalassämie-Mutationen bestimmt werden.1417 Diese Studie zeigte, dass M-ARMS sieben häufige Mutationen in chinesischen und südostasiatischen Populationen nachweisen konnte und in der Lage war, 85,2 % der Allele zu erkennen, wie dies auch in früheren Berichten der Fall war.19,20 Da M-ARMS nur einen bestimmten Satz von Mutationen erkennen kann, die für die verwendeten Primer spezifisch sind, ist die direkte DNA-Sequenzierung der nächste Schritt, um verschiedene Punktmutationen und kleine Umlagerungen im Beta-Globin-Gen zu identifizieren. Sechs weniger häufige Mutationen wurden in 10,2 % der Allele identifiziert. Der Nachteil der DNA-Sequenzierung ist, dass große Deletionen des Gens nicht nachweisbar sind. Daher ist die Gap-PCR der letzte Schritt zum Nachweis einer 3,4 kb-Deletion, über die bereits in thailändischen Populationen berichtet wurde.21 Mit einer Kombination dieser Techniken konnten Beta-Thalassämie-Mutationen in allen 88 Allelen (100 %) der pädiatrischen Patienten in unserer Studie identifiziert werden.
Abgesehen vom BetaE-Globin-Gen wurden bei 80 nicht verwandten Patienten 13 verschiedene Beta-Thalassämie-Mutationen nachgewiesen. Die beiden am häufigsten entdeckten Mutationen waren Codon 41/42 (-TCTT) und Codon 17 (A>T), die 37,5 % bzw. 26,1 % der betroffenen Allele ausmachten. Alle anderen häufigen Mutationen, die durch M-ARMS entdeckt wurden, machten 21,6 % der Allele aus. Im Vergleich zu einer früheren Studie über Beta-Thalassämie-Mutationen in Thailand ergab sich, dass die Häufigkeit der in unserer Studie identifizierten Beta-Globin-Gen-Mutationen anders war. Erstens wurde das Nukleotid -28 (A>G) in unserer Studie nicht identifiziert. Das Nukleotid -28 (A>G) ist eine Beta+-Thalassämie-Mutation, die den milden Beta-Thalassämie-Phänotyp verursacht; daher wurde diese Mutation nur bei TI-Patienten beobachtet.22 Die vorliegende Studie zeigte, dass TI die Minderheitengruppe (weniger als 10 %) unter den pädiatrischen Patienten mit symptomatischer Beta-Thalassämie war. Dies könnte erklären, warum diese Mutation in unserer Studie nicht beobachtet wurde. Zweitens war die Häufigkeit anderer häufiger Mutationen wie Codon 41/42 (-TCTT), Codon 17 (A>T), IVS-II-654 (C>T), Codon 71/72 (+A), IVS-I-1 (G>T) und IVS-I-5 (G>C) in unserer Studie ähnlich wie in anderen Studien in Zentralthailand.8,10 Die Allelhäufigkeit in dieser Studie unterschied sich jedoch von Studien in anderen Teilen Thailands. Codon 41/42 (-TCTT) war die häufigste Mutation, die in unserer Bevölkerung, die hauptsächlich in Zentralthailand lebte, festgestellt wurde. Diese Frameshift-Mutation ist auch die häufigste Mutation, die in anderen Teilen Thailands, der Volksrepublik China und Südostasiens gefunden wurde.20 Während Codon 17 (A>T) das zweithäufigste mutierte Allel in Zentral-, Nord- und Nordostthailand war, war IVS-I-5 (G>C) die zweithäufigste Mutation in Südthailand.23 IVS-I-5 (G>C) wurde bereits früher als die häufigste Mutation bei thailändischen muslimischen Patienten in Südthailand berichtet.24 Darüber hinaus machte Codon 71/72 (+A) in der vorliegenden Studie 2,3 % aus, während diese Mutation im Norden16 6 % und im Nordosten13 Thailands 13,1 % ausmachte, was auf eine höhere Häufigkeit dieser Mutation in diesem Gebiet hindeutet.
Sechs ungewöhnliche Mutationen, darunter Codon 35 (C>A), Codon 15 (G>A), Codon 19 (A>G) oder Hb Malay, Codon 27/28 (+C), Mutation des Initiationscodons (ATG>AGG) und Codon 123/124/125 (-ACCCCACC) wurden durch direkte DNA-Sequenzierung identifiziert. Obwohl keine neue Mutation entdeckt wurde, wurden in unserer Studie zwei seltene Mutationen in Thailand gefunden: eine Mutation des Initiationscodons und eine Deletion von 8 bp in Exon 3. Die Initiationskodon-Mutation (ATG>AGG) wurde erstmals 1990 bei einem chinesischen Beta-Thalassämie-Patienten beschrieben.25 In Thailand wurde diese Mutation einmal im Jahr 2005 bei zwei Geschwistern mit Beta-Thalassämie/HbE festgestellt.26 Obwohl diese Mutation die Beta-Globin-Kettensynthese ernsthaft beeinträchtigt und höchstwahrscheinlich den Beta0-Thalassämie-Phänotyp verursacht, wiesen alle drei berichteten Patienten einen milden Phänotyp auf, was durch die Co-Vererbung mit der heterozygoten 3,7 kb-Deletion des Alpha-Thal-2-Genotyps bei den chinesischen Patienten und die Assoziation mit dem C>T-Polymorphismus am -158(G)-Gamma-Globin-Gen bei den beiden thailändischen Geschwistern erklärt werden kann. Der Phänotyp unserer Patientin war eine transfusionsabhängige Beta-Thalassämie major, die im Alter von 9 Monaten diagnostiziert wurde, während der Genotyp eine compound heterozygote Mutation zwischen Codon 41/42 (-TCTT) und Initiationscodon war. Beide mutierten Allele verursachen den Phänotyp der Beta0-Thalassämie. Eine Acht-Basen-Deletion in Exon 3 oder Codon 123/124/125 (-ACCCCACC) wurde erstmals bei nordostthailändischen Kindern mit dem schweren Beta-Thalassämie/HbE-Phänotyp charakterisiert.27 Diese Deletion führt zur Synthese von 135 Aminosäuren der betaX-Kette (beta-Khon Kaen), die sehr instabil sind und bald nach der Translation abgebaut werden. Eine weitreichende Veränderung der Aminosäuren am Codon 123 bis 131 führt zu dominanten Einschlusskörper-Beta-Thalassämie-Merkmalen wie bei unserem Patienten.
Beta-Thalassämie/HbE ist ein großes Thalassämie-Problem in Thailand und kann mit verschiedenen klinischen Phänotypen einhergehen, die von leichter Thalassämie intermedia bis zu schwerer transfusionsabhängiger Thalassämie major reichen.5,6,8,10 Wie in unserer Studie wiesen 85 % der Patienten mit Beta-Thalassämie major und 100 % der TI-Patienten eine heterozygote Beta-Thalassämie und HbE auf. Bei der Beta-Thalassämie major war der am häufigsten anzutreffende Genotyp Codon 41/42 (-TCTT)/betaE (40 %), gefolgt von Codon 17 (A>T)/betaE (18,3 %), IVS-I-5 (G>C)/betaE (8,3 %) und IVS-II-654 (C>T)/betaE (8,3 %), die 75 % aller nachgewiesenen Genotypen ausmachten. Mit Ausnahme der betaE-Thalassämie-Mutation wurden alle beta-Thalassämie-Mutationen bei unseren symptomatischen Patienten als beta0-Mutation eingestuft, mit Ausnahme von Codon 19 (A>G) oder Hb Malay, das als beta+-Mutation eingestuft und nur bei einem Patienten identifiziert wurde.28
Interessanterweise hatte unser Patient mit Codon 19 (A>G)/betaE eine transfusionsabhängige Thalassämie-Hauptmanifestation anstelle einer leichten TI. Andererseits zeigten Compound-Heterozygote mit vier beta0-Mutationen, einschließlich Codon 41/42 (-TCTT), Codon 17 (A>T), 3,4 kb-Deletion, IVSI-1 (G>T) und betaE-Genotyp, statt des Phänotyps der Beta-Thalassämie major eine TI. Dieses Phänomen lässt sich durch verschiedene genetische und nichtgenetische Faktoren erklären, die bei der Bestimmung der Variabilität der Krankheit eine Rolle spielen können.5,22,29,30 In unserer Studie wurde jedoch keine zusätzliche genetische Analyse (genetische Modifikatoren) durchgeführt.
Das Konzept der genetischen Präimplantationsdiagnostik besteht darin, den Transfer von Embryonen in die Gebärmutter bei Verfahren der assistierten Reproduktion zu ermöglichen. Diese Technik ist schnell und eignet sich als nicht-invasives klinisches Instrument zur Identifizierung genetischer Störungen, um selektive Fehlgeburten wie die Thalassämie major zu reduzieren.31,32 Unsere Studie zeigte, dass verschiedene Beta-Thalassämie-Mutationen möglicherweise klinisch im Rahmen eines genetischen Präimplantationsprotokolls angewandt werden, was eine molekulargenetische Analyse zur Amplifikation einer bestimmten Region auf dem Beta-Globin-Gen für ein Paar ermöglicht.
Zusammenfassend zeigt die vorliegende Studie die Heterogenität der molekularen Defekte, die Beta-Thalassämie bei thailändischen Kindern verursachen. Alle Beta-Thalassämie-Allele wurden durch eine Kombination von Techniken charakterisiert, darunter M-ARMS, direkte DNA-Sequenzierung und Gap-PCR zum Nachweis von 3,4 kb-Deletionen. Dreizehn Mutationen machten in unserer Studie 100 % der Beta-Thalassämie-Gene aus. Die ermittelte Häufigkeit dürfte die Häufigkeit von Beta-Globin-Gen-Mutationen bei pädiatrischen Patienten repräsentieren, die hauptsächlich in Zentralthailand lebten.
Anerkennung
Diese Studie wurde vom Phramongkutklao College of Medicine genehmigt und finanziell unterstützt.
Offenlegung
Die Autoren erklären, dass es keine Interessenkonflikte in dieser Arbeit gibt.
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