Ich gehöre einer Hämatologie-Interessengruppe an und freue mich immer über die Fallstudien und Fragen, die andere Techniker stellen. Diese Gruppe ist multinational, so dass ich Beiträge von Technikern aus der ganzen Welt sehe. Es ist interessant zu sehen, welche Ähnlichkeiten und Unterschiede es bei den Standardarbeitsverfahren gibt und welche Rolle die Techniker in den verschiedenen Bereichen und Ländern spielen. Es ist auch interessant zu sehen, dass wir alle auf die gleichen Arten von Problemen und schwierigen Proben stoßen!In den letzten Monaten habe ich in dieserHämatologie-Interessengruppe viele Fragen und Kommentare zur Lösung von verklumpten Blutplättchen gesehen und möchte daher diese Gelegenheit nutzen, um etwas Licht in diese kniffligen Präparate zu bringen. Der Fall, den ich hier vorstelle, und die Fotos wurden mir freundlicherweise von Abu Jad Caesar zur Verfügung gestellt, der Laborleiter bei Medicare Laboratories – Zweigstelle Tulkarm, in Palästina ist.
Bei dem Patienten wurde ein CBC mit einem Nihon Kohden 6410 durchgeführt. Die Leukozytenzahl betrug 12,7 x 103μL, die Impedanz-Thrombozytenzahl lag beim ersten Durchlauf bei 20.000/μL, die anderen Parameter lagen im Normbereich. Die Probe wurde erwärmt und ein Na-Citrat-Röhrchen angefordert, um eine Pseudothrombozytopenie auszuschließen. Nach der Erwärmung wurde der EDTA-Test mit einer Thrombozytenzahl von 0/μL wiederholt. Das Na-Citrat-Röhrchen wurde durchgeführt, und die Thrombozytenzahl des Geräts betrug 189.000/μL. (Abbildung 1) Aufgrund des Verhältnisses von Blut zu Antikoagulans im Na-Citrat-Röhrchen wurde ein Multiplikator von 1,1 angewandt, so dass die Na-Citrat-Plättchenzahl 207.900/μL betrug. Es wurden Objektträger hergestellt, gefärbt und untersucht. Bild 1 zeigt die Verklumpung im EDTA-Röhrchen. Bild 2 zeigt den Ausstrich aus dem Na-Citrat-Röhrchen, ohne sichtbare Verklumpung.
Das Blutbild wurde mit folgenden Bemerkungen gemeldet: Thrombozytenverklumpung beobachtet, 2 Proben zum Ausschluss einer Thrombozytopenie entnommen. Im EDTA-Vollblutausstrich wurden viele Thrombozytenverklumpungen festgestellt (EDTA-induzierte Thrombozytopenie). Schlussfolgerung: Die Thrombozyten sind ausreichend und werden auf etwa200.000/μL geschätzt.
Thrombozytenzahlen im Normalbereich bereiten uns in der Regel keine allzu großen Probleme bei der Berichterstattung, selbst wenn eine gewisse Verklumpung vorliegt, hauptsächlich weil sie normal sind. Angemessene Thrombozytenzahlen liegen in einem typischen Referenzbereich von etwa 150 bis 450 x 103/μL. Wenn das Gerät ein anormales Streudiagramm oder Verklumpungen der Thrombozyten anzeigt, wird empfohlen, den Test mit einer anderen Methode zu wiederholen. Wenn die erste Zählung durch Impedanzzählung erfolgt, können viele Analysegeräte auch optische oder fluoreszierende Thrombozytenzählungen melden. Bei der Impedanzzählung können sehr kleine Erythrozyten oder Fragmente als Thrombozyten gezählt werden, wodurch die Thrombozytenzahl fälschlicherweise erhöht wird. Bei der optischen Zählung können große Thrombozyten als Erythrozyten gezählt werden, was zu einer fälschlich verminderten Zahl führt. Einige Hämatologie-Analysegeräte von Sysmex verwenden Impedanz- und optische Zählungen und verfügen auch über fluoreszierende Thrombozytenzählungen, die einen thrombozytenspezifischen Farbstoff verwenden und genaue Thrombozytenzählungen ohne die Interferenzen anderer Methoden liefern. Eine normale Thrombozytenzahl, selbst wenn auf einem Abstrich Verklumpungen zu sehen sind, wird in der Regel immer noch als normal eingeschätzt (oder kann gelegentlich erhöht sein.)
Die Thrombozytopenie hingegen kann eine Herausforderung für das hämatologische Labor darstellen. Bei Thrombozytopenie benötigen Ärzte eine genaue Zahl, um Patienten zu diagnostizieren, zu behandeln oder zu überwachen. Bei einer schweren Thrombozytopenie kann selbst ein geringer Anstieg oder Abfall signifikant sein. Bei weniger Thrombozyten zählt jedes Plättchen!
Eine der ersten Fragen, die wir uns bei einer scheinbaren Thrombozytopenie stellen müssen, ist, ob es sich um eine echte Thrombozytopenie oder um eine Pseudothrombozytopenie (PTCP) handelt. Bei einer echten Thrombozytopenie handelt es sich um einen Patienten mit einer niedrigen Thrombozytenzahl, der möglicherweise überwacht oder medizinisch behandelt werden muss. Es kann gefährlich sein, eine Thrombozytopenie falsch zu deuten, aber es ist auch gefährlich, eine niedrige Thrombozytenzahl bei einem Patienten mit einer unechten Thrombozytopenie zu melden, der eigentlich nicht thrombozytopenisch ist. Pseudothrombozytopenie oder Scheinthrombozytopenie ist definiert als eine künstlich oder irrtümlich niedrige Thrombozytenzahl. Bei PTCP ist die niedrige Thrombozytenzahl auf Klumpen zurückzuführen, die als 1 Thrombozyt gezählt werden. (Diese großen Klumpen können auch als Leukozyten gezählt werden, was zu einer fälschlich erhöhten Leukozytenzahl führt).
Wir können PTCP in 2 Kategorien einteilen. Thrombozytenverklumpungen werden am häufigsten durch präanalytische Fehler verursacht, wie z. B. über- oder unterfüllte EDTA-Röhrchen, verklumpte Proben oder eine zeitliche Verzögerung zwischen Probenentnahme und Test. Die Techniker sollten das Röhrchen auf Gerinnsel und das Probenvolumen überprüfen und einen Delta-Test durchführen, um Thrombozytopenie und PTCP zu unterscheiden. Bei einer offensichtlich „guten“ Probe wäre der nächste Schritt eine Abstrichuntersuchung. Wenn auf dem Abstrich Klumpen zu sehen sind, müssen wir entscheiden, was die Klumpen verursacht hat. Handelt es sich um die erste Kategorie, d. h. eines der üblichen präanalytischen Probleme, oder um die zweite Kategorie der PTCP, d. h. eine In-vitro-Agglutination der Blutplättchen? Zu den Bedingungen, die diese In-vitro-Agglutination von Thrombozyten verursachen, gehören Kälteagglutinine, das Multiple Myelom, Infektionen, Anticardiolipin-Antikörper, hohe Immunglobulinspiegel, Abciximab-Therapie und EDTA-induzierte Pseudothrombozytopenie. (EDTA-PTCP) Von diesen ist die EDTA-induzierte Pseudothrombozytopenie die häufigste Ursache. (Nakashima,2016).
Wenn Techniker über Thrombozytenverklumpungen sprechen, dann in der Regel, weil wir nach Möglichkeiten suchen, die Thrombozytenzahl in diesen Proben aufzulösen oder genau zu schätzen, und es scheint keine einfache Antwort zu geben.Die Verklumpung macht eine präzise Zählung unmöglich, und selbst Schätzungen können sehr heikel sein. Wie können wir die Anzahl der Blutplättchen schätzen? Sollen wir das Vorhandensein von Verklumpungen einfach mit „erscheint normal“, „verringert“ oder „erhöht“ angeben? Oder sollten wir unsere Schätzungen in mehrere Bereiche aufteilen, um den Ärzten wertvollere Informationen zu geben? Und was ist, wenn der Leistungserbringer eine tatsächliche Anzahl wünscht, um dem Patienten die bestmögliche Pflege zukommen zu lassen, und wir die Verklumpung nicht auflösen können? Was können wir tun, um eine Zählung zu ermöglichen? Zu den ersten empfohlenen Schritten gehört es, die Probe 2 Minuten lang zu verwirbeln, um die Thrombozytenklumpen aufzulösen, und sie dann erneut zu analysieren. Das Erwärmen der Proben kann ebenfalls dazu beitragen, Thrombozytenklumpen aufzulösen, insbesondere bei Proben mit kalten Agglutininen oder bei Proben, deren Testung sich verzögert hat und die bei Raumtemperatur oder darunter transportiert oder gelagert wurden. Wenn die Verklumpungen fortbestehen und die erneute Entnahme der Probe immer noch zu einer Verklumpung der Blutplättchen führt, kann ein präanalytischer Fehler ausgeschlossen werden, und es besteht der Verdacht auf eine EDTA-induzierte Pseudothrombozytopenie. Viele Labore werden ein anderes Röhrchen ziehen lassen oder eine andere Methode anwenden, um die Verklumpung zu beheben.
Was ist also eine EDTA-induzierte Thrombozytopenie (EDTA-PTCP)? Es handelt sich um ein Laborphänomen, das auf das Vorhandensein von EDTA-abhängigen IgM/IgG-Autoantikörpern zurückzuführen ist, die in Gegenwart von EDTA an die Glykoproteine der Thrombozytenmembran binden. EDTA löst diese Bindung aus und verstärkt sie, indem es diese Glykoproteine den Antikörpern aussetzt.(Geok Chin Tan, 2016) Obwohl es sich um ein In-vitro-Phänomen handelt, haben Patienten mit bestimmten Erkrankungen wie malignen Neoplasmen, chronischen Lebererkrankungen, Infektionen, Schwangerschaft und Autoimmunerkrankungen ein erhöhtes Risiko für EDTA-PTCP. Allerdings wurde EDTA-PTCP auch bei Patienten beobachtet, die frei von Krankheiten sind. (Zhang, 2018)
Welche alternativen Methoden gibt es, um das Problem der EDTA-induzierten Thrombozytenverklumpung zu lösen? Die wahrscheinlich gebräuchlichste ist die erneute Entnahme der Probe in einem Na-Citrat-Röhrchen. Es sollten sowohl EDTA- als auch Na-Citrat-Röhrchen gezogen werden. Bei einem echtenEDTA-PTCP, wie in unserer Fallstudie, sollten Sie auf dem Abstrich aus dem EDTA-Röhrchen Verklumpungen sehen und auf dem Abstrich aus dem Na-Citrat-Röhrchen keine. Aufgrund des Volumens des Gerinnungshemmers im Na-Citrat-Röhrchen müssen Sie auch den Verdünnungsfaktor von 1,1 auf das Ergebnis aus dem Na-Citrat-Röhrchen anwenden, um eine genaue Thrombozytenzahl zu erhalten. Beachten Sie jedoch, dass Hämatologie-Analysegeräte von der FDA für die Verwendung von EDTA-Röhrchen zugelassen und validiert sind. Wenn Sie ein anderes Antikoagulans verwenden möchten, muss die Methode in Ihrem Labor validiert werden. Beachten Sie auch, dass alternative Methoden im Allgemeinen nur EDTA-PTCP auflösen, nicht aber Verklumpungen aufgrund anderer Kälteagglutinine, Medikamente oder Erkrankungen. Darüber hinaus ist die durch Antikoagulantien verursachte Thrombozytopenie nicht auf EDTA beschränkt. Sie kann auch bei Citrat und Heparin auftreten. In einer Studie wurde festgestellt, dass bis zu 17 % der Patienten mit einer EDTA-PTCPalso dieses Phänomen auch mit Citrat aufwiesen. Tatsächlich haben Forscher festgestellt, und wir haben bei unseren eigenen Validierungen festgestellt, dass einige Proben, die in EDTA nicht verklumpen, in Na-Citrat tatsächlich verklumpen. Daher können alternative Röhrchen nicht alle Thrombozytenverklumpungen auflösen. (Geok Chin Tan, 2016)
Einige Labore haben ACD-Röhrchen (Zitronensäure, Trinatriumcitrat, Dextrose) als Gerinnungshemmer für EDTA-PTCP validiert. Bei dieser Methode müssen das EDTA-Röhrchen und das ACD-Röhrchen parallel laufen und ein Umrechnungsfaktor angewandt werden, der den Unterschied in der Probenverdünnung in den beiden Röhrchen widerspiegelt. Für diesen Vergleich muss ein Parameter wie der RBC-Wert gewählt werden. Die Verwendung einer Formel, bei der die Erythrozyten in EDTA durch die Erythrozyten in ACD geteilt werden, ergibt ein Verhältnis, das die Verdünnungsunterschiede zwischen den Antikoagulanzien widerspiegelt. Dieses Verhältnis kann dann mit der ACD-Plättchenzahl multipliziert werden, um die ACD-korrigierte Plättchenzahl zu erhalten. (CAP Today, 2014). In einigen Quellen werden ACD-Röhrchen empfohlen, weil die Häufigkeit des Verklumpens bei NaCitrat frustrierend hoch sein kann. Es wird vermutet, dass das saurere ACD-Röhrchen das Verklumpen der Blutplättchen besser verhindern kann als Na-Citrat. (Manthorpe, 1981)
Weniger gebräuchliche Röhrchen sind CTAD (Trinatriumcitrat, Theophyllin, Adenosin, Dipyridamol) und Heparin. CTAD wirkt direkt auf die Thrombozyten und hemmt den Thrombozytenfaktor 4, wodurch die Thrombozytenaktivierung minimiert wird. Nachteilig an CTAD-Röhrchen ist, dass sie lichtempfindlich sind und im Dunkeln gelagert werden müssen und teuer sein können. Außerdem verändern sie das Verhältnis zwischen Blut und zusätzlicher Verdünnung, so dass Berechnungen verwendet werden müssen, wie dies bei Na-Citrat und ACD der Fall ist. Heparinröhrchen werden seltener als vorteilhaft bei der Lösung von Thrombozytenverklumpungsproblemen angesehen, da Heparin die Thrombozyten aktivieren kann. Heparinröhrchen sind auch teurer, so dass sie im Allgemeinen nicht die erste Wahl für EDTA-PTCP sind.
Ich habe von Technikern gehört, dass ihre Labors sehr gute Ergebnisse erzielen, wenn sie EDTA-Röhrchen Amikacin zusetzen, um bei Patienten mit EDTA-PTCP fälschlicherweise niedrige Thrombozytenzahlen zu vermeiden. Amikacin sollte dem EDTA-Röhrchen innerhalb von 1 Stunde nach der Entnahme zugesetzt werden, und der Test ist bei Raumtemperatur bis zu 4 Stunden lang stabil. Die Ergebnisse einer 2011 durchgeführten Studie haben gezeigt, dass die Zugabe von Amikacin zum EDTA-Röhrchen zu einer schnellen Dissoziation der Thrombozytenklumpen führt, mit geringen oder keinen Auswirkungen auf Morphologie oder Indizes. Diese Methode hat sich als sehr vielversprechend erwiesen, um genaue Thrombozytenzahlen bei Patienten mit durch Multikoagulanzien induzierter PTCP zu ermitteln. (Zhou, 2011)
Das letzte Antikoagulanzien-Röhrchen, das von vielen Technikern in der Hämatologie-Interessengruppe erwähnt wurde, sind die Sarstedt ThromboExact-Röhrchen. Ich habe viele Beiträge von Technikern gelesen, die diese Röhrchen verwenden, und sie scheinen eine sehr gute Erfolgsquote zu haben. ThromboExact-Röhrchen enthalten Magnesiumsalze und sind speziell für die Bestimmung der Thrombozytenzahl bei PTCP konzipiert. Sie sind derzeit nur für die Thrombozytenzählung validiert und die Proben sind nach der Entnahme 12 Stunden lang stabil.Interessanterweise war Magnesium vor den automatisierten Hämatologie-Analysegeräten das Gerinnungshemmer der Wahl für die manuelle Thrombozytenzählung. Die EDTA-PTCP ist seit der Einführung der automatisierten EDTA-Thrombozytenzählung in den 1970er Jahren bekannt. In einer Studie aus dem Jahr 2013 wurden in Deutschland ThromboExact-Röhrchen verwendet, die hervorragende Ergebnisse bei der Auflösung einer durch mehrere Gerinnungshemmer induzierten PTCP lieferten. Diese Röhrchen wurden während der Studie im Jahr 2013 kommerziell verfügbar. (Schuff-Werner, 2013) Leider sind diese Röhrchen bei uns in den USA nicht erhältlich. Ich war vor kurzem auf einer Konferenz und ging zu den Vertretern von Sarstedt und fragte nach diesen Röhrchen. Mir wurde gesagt, dass sie in Teilen Europas und Asiens erhältlich sind, aber in den USA nicht von der FDA zugelassen sind. Ich fragte sehr hoffnungsvoll, ob sie eine FDA-Zulassung anstrebten, und mir wurde leider gesagt, dass „sie nicht glaubten, dass sie den Markt hätten, um eine Zulassung anzustreben.“
Für welche alternative Methode sich Ihr Labor auch entscheidet, es wird empfohlen, ein EDTA- und das alternative Röhrchen zusammen zu ziehen. Auf diese Weise können die beiden Zählungen und das Vorhandensein oder Fehlen von Verklumpungen in den Röhrchen verglichen werden. Wir haben viele Patienten, bei denen einmal eine Verklumpung auftrat. Wenn der Arzt jedoch eine Thrombozytenzählung mit Na-Citrat anordnet, erhalten wir eine neue Entnahme von EDTA- und Na-Citrat-Röhrchen zusammen, und bei EDTA ist keine Markierung oder Verklumpung zu erkennen. In diesen Fällen ist es angebracht, die EDTA-Ergebnisse auszuwerten, da es keine Hinweise aufEDTA-PTCP gibt.
Wenn ein Patient eine niedrige PLT-Zahl aufweist, ohne dass eine hämatologische Erkrankung, eine Familienanamnese und/oder eine Blutungsneigung festgestellt wurde, und wenn präanalytische Fehler ausgeschlossen wurden, sollte eine PTCP in Betracht gezogen werden. Dies bedeutet jedoch nicht, dass ein Patient mit PTCP nach Auflösung der Verklumpung eine normale Thrombozytenzahl aufweisen wird. Wie bereits erwähnt, haben viele Patienten mit EDTA-PTCP hämatologische oder andere Störungen und können tatsächlich thrombozytopenisch sein. Die Auflösung der Verklumpung bei diesen Patienten ermöglicht es uns, dem Anbieter eine genaue Thrombozytenzahl zu geben, was bei thrombozytopenischen Patienten sehr wichtig ist.
Das nachstehende Flussdiagramm (Abbildung 4) zeigt einige Dinge, die bei der Behandlung von Thrombozytenverklumpungen zu beachten sind. Unser Ziel ist es, die Verklumpung aufzulösen, damit wir zeitnah eine genaue Thrombozytenzahl melden können. In dem Labor, in dem ich arbeite, habe ich Na-Zitrat-Röhrchen validiert, aber diese scheinen die Verklumpung bei weniger als 50 % der Patienten aufzulösen. Als letzten Ausweg, um eine genaue Thrombozytenzahl zu erhalten, wird in einigen Artikeln die Entnahme eines Fingerstifts und die manuelle Zählung empfohlen. Ich habe dies als Option für die gerinnungshemmende PTCP in die Tabelle aufgenommen, doch aufgrund der Schwierigkeiten bei der Entnahme einer Warenprobe und der Subjektivität der Zählungen sowie der Probleme im Zusammenhang mit den erforderlichen Berechnungen haben unsere Pathologen beschlossen, dass wir keine manuellen Thrombozytenzählungen durchführen werden. Aus diesem Grund befasse ich mich derzeit mit der Überwachung der Thrombozytenverklumpung und werde eine kleine interne Studie durchführen, umACD-, CTAD- und Na-Citrat-Röhrchen parallel zu vergleichen. Je nach den Ergebnissen werden wir dann eventuell auch Amikacin testen. Wenn wir zu erhellenden Schlussfolgerungen kommen, werde ich einen weiteren kurzen Blog mit unseren Ergebnissen schreiben!
Danke nochmals an Abu Jad Caesar, Laborleiter bei Medicare Laboratories – Zweigstelle Tulkarm, in Palästina, der mir diesen lehrbuchmäßig perfekten Fall von PCTP zur Verfügung gestellt hat, der durch die Entnahme in Na-Citrat leicht zu lösen war. Wir wünschten, sie würden alle die Lehrbücher lesen und wären so kooperativ!
- CAPToday, January 2014. access online http://www.captodayonline/qa-column-0114
- ManthorpeR, Kofod B, et al. Pseudothrombocytopenia, In vitro studies on the underlyingmechanisms. Scand J Haematol 1981; 26:385-92
- NakashimaMO, Kottke-Marchant K. Platelet Testing: In: Kottke-Marhchant K, ed. AnAlgorithmic Approach to Hemostasis Testing, 2nd ed. CAP Press;2016:101
- Schuff-Werner,Peter, et al.Effective estimation of correct platelet counts in pseudothrombocytopenia usingan alternative anticoagulant based on magnesium salt. Brit J of Haematol Vol162, Issue 5. June 29, 2013
- Tan,Geok Chin et al. Pseudothrombocytopenia due to platelet clumping: A Case Reportand Brief Review of the Literature. Case Reports in Hematology. Volume 2016
- Lixia Zhang, MMed,* Jian Xu, MD,* LiGao, MMed, Shiyang Pan, MD, PhD. Spurious Thrombocytopenia in AutomatedPlatelet Count. Laboratory Medicine 49:2:130-133. 2018
- Zhou,Xiamian,et al. Amikacin can be added to blood to reduce the fall in platelet count. AmJournal of Clinical Pathology, Vol 136, Issue 4, Oct 2011.
-Becky Socha, MS, MLS(ASCP)CM BB CM absolvierte das Merrimack College in N. Andover, Massachusetts, mit einem BS in Medizintechnik und schloss ihren MS in klinischen Laborwissenschaften an der University of Massachusetts, Lowell, ab. Sie ist seit über 30 Jahren als Medizintechnikerin tätig. Sie hat in allen Bereichen des klinischen Labors gearbeitet, aber ihr besonderes Interesse gilt der Hämatologie und der Blutbank. Wenn sie nicht gerade eine verrückte Wissenschaftlerin ist, kann man sie draußen beim Fahrradfahren antreffen.